一种快速高效的丛枝菌根真菌染色的方法与流程

本发明涉及一种快速高效对植物根部丛枝菌根真菌进行染色观察的方法，属于应用微生物学领域。

背景技术：
菌根是土壤中某些真菌与植物根的共生体。丛枝菌根真菌（ArbuscularMycorrhizalFungus，AMF）是自然界中一类分布广泛的土壤微生物，它可以与约90%的陆生维管束植物的根形成一种互惠共生体——丛枝菌根。丛枝菌根的作用主要是扩大根系吸收面积，增强对原根毛范围外的元素（主要是磷）吸收。菌丝与植物组织互通，一方面从寄主植物中吸收糖类等有机物质作为自己的营养，另一方面又从土壤中吸收养分、水分供给植物。丛枝菌根真菌不但能够改善寄主植物矿质营养，促进植物生长发育，还具有缓解干旱、盐碱和温度胁迫等多种逆境对植株造成的危害。最新的研究成果表明，自然生态系统中菌根真菌影响植物种群的竞争能力，菌根真菌的多样性决定着植物的生物多样性、生态系统的变化以及植物的生产力。因此菌根学逐渐的兴起。而菌根生长状况观察与侵染率测定是菌根学研究中一项重要的基础性工作。由于几乎所有的菌根真菌接种试验均会涉及到菌根发育状况观察与侵染率测定，因此半个多世纪以来人们十分重视其观察与测定方法研究，相继建立了一系列的染色法来观察菌根真菌的发育状况，其中应用最多的是台盼蓝染色法和酸性品红染色法。酸性品红法将根段或经过FAA固定的根系经KOH透明、乳酸或2%（W/V）HCL酸化后置于90℃的酸性品红染色液染色20~60min，乳酸分色后镜检。该方法操作简单，然而由于根皮层也被染上相同或略浅的颜色，导致颜色反差不明显，并且苯酚具有一定的毒性，对身体和环境具有一定的毒害。台盼蓝（Trypanblue）染色法是先将经过FAA固定的根系浸入10％（W/V）KOH溶液中，90℃消化1～2h经过消化后根呈透明状，然后将根浸入1％（W/V）HCl中酸化3～5min。将根取出冲洗干净后，浸入0.1％（W/V）台盼蓝（Trypanblue）染色液中，90℃保温10～20min。将根取出，冲洗掉染色液。然后将根浸泡在50％乳酸溶液中脱色。经过染色的根能够在此溶液中保存数周时间。台盼蓝染色法染色效果稳定可靠，但是在KOH溶液透明处理时不易透明彻底，导致染色时丛枝菌根真菌与皮层之间的颜色反差小，不利于对AM真菌细微结构（如丛枝）的显微拍照。并且固定和消化时间过长，当天不能观察菌丝形态，不利于方便快捷的对根部的AM真菌侵染情况进行观察研究。除了上述两种方法外，氯唑黑E染色法也用作AM真菌侵染情况的观察研究。该法将经KOH处理的根系置于等体积的85%乳酸、甘油和水溶解的0.1%（w/v）氯唑黑E混合溶液中90℃下浸泡1h以上，甘油脱色。镜检时用2%三氯甲醛作浮载剂。该法清晰度高、反差大，丛枝结构清晰，但氯唑黑E被认为是致癌疑似物而存在不足。本发明针对当前菌根研究日趋受到重视，但是菌根染色方法存在染色效果较差并且操作时间较长的问题，通过121℃消化缩短了操作时间，并新增H2O2漂白处理工艺强化了染色的清晰度和层次性，从而显著提高了染色效率和染色效果。本方法具有方便、快捷、适应性强的特点，在菌根真菌研究领域具有很强的实际应用价值。

技术实现要素：
本发明的目的在于通过增加高温（121℃）消化和H2O2漂洗的步骤，对传统的菌根真菌台盼蓝染色方法进行改进，从而缩短了总体染色时间，增强了染色效果，开发出一种方便、快捷、适应性强的菌根染色方法，解决了目前菌根研究中存在的染色层次不清、图像模糊、操作时间过长等问题，实现菌根的快速高效染色，为菌根研究者提供一种行之有效的染色方法，具有较强的实际应用价值和科研理论价值。本发明的技术方案如下：A、固定：将采取的植物根样在尼龙网中清洗干净，取根样（该专利适用性强，绝大部分草本植物、木本植物和灌木的根样均可）置于150ml三角烧瓶中，按每5g根样倒入FAA固定液约50ml，并用玻璃棒轻压根样，使其完全浸泡在FAA固定液中，固定4h以上；如果采集植物根样后可以立即进行下一步处理，则可省略该步骤；B、消化：将采集的植物的根样（或FAA固定液中的根样）冲洗干净后，将根样置于150ml三角烧瓶中，按每5g根样加入10％（W/V）KOH溶液约50ml，在121℃高压灭菌5~10min，以除去根中的细胞质，经过消化后根呈透明状，以便于染色观察；C、漂洗：在室温冷却后，将根从KOH溶液中取出，用蒸馏水冲洗干净，若KOH处理后根的颜色依然较深（如褐色或深黄色），则将根样置于250ml三角烧瓶中，按每5g根样加入H2O2漂洗液100ml中（分析纯，有效含量不少于3%（W/V）），漂白根样5~10min；若在消化处理后的根样透明化较好（如无色或半透明状），则可以省略漂洗步骤，直接进行下一步的酸化处理；D、酸化：然后将根置于150ml三角烧瓶中，按每5g根样加入1％（W/V）HCl50ml，酸化3～5min；E、染色：将根取出冲洗干净后置于150ml三角烧瓶中，按每5g根样加入0.1％（W/V）台盼蓝（Trypanblue）染色液50ml，煮沸10min；F、脱色：待冷却后，将根取出，用蒸馏水冲洗掉染色液，然后将根置于250ml三角烧瓶中，按每5g根样加入50％（W/V）乳酸溶液约100ml，脱色10min以上。经过染色的根能够在此溶液中保存数周时间；G、观察：将染色后的根段切成1cm左右，于光学显微镜下观察。凡出现菌丝、孢子或者丛枝等AMF结构，就将其计成已被侵染根段。计算AMF根侵染率。实验中用到的试剂配方：（1）FAA固定液配制：50％乙醇（W/V）、甲醛、冰醋酸按体积比为85:10:5，混匀，试剂瓶盛放，常温保存。（2）H2O2漂洗液：H2O2溶液（H2O2，分析纯，有效含量不少于30%（W/V）且不大于100%），稀释10倍即为H2O2漂洗液，避光保存，最好现配现用。（3）脱色液：乳酸、甘油和蒸馏水按体积比为1:1:1，混匀后用试剂瓶保存。（4）0.1％台盼蓝染色液：按每0.3gTrypanblue溶于300ml脱色液中，混合均匀。该染色方法适用性广，其中所述的根样可为绝大部分草本、木本植物和灌木的根样。其中所述的根样为酢浆草根样、狗尾草根样、大叶黄杨根样或加拿大一枝黄花根样。本项目通过在菌根染色过程中，将根样在121℃高压灭菌10min，改进了消化方式，较常用的90℃消化1~2h，大大缩短了消化时间；通过将消化后的茎段使用H2O2溶液漂洗，改善了根样的透明化效果，增强了染色的层次性。本项目通过这两处的改良，构建了一种快速高效的菌根真菌染色新方法，有利于进行菌根真菌的高效快速的观察和测定。附图说明图1a.本专利方法染色的大叶黄杨菌根形态图1b.台盼蓝染色法染色的大叶黄杨菌根形态图2a.本专利方法染色的的加拿大一枝黄花菌根形态图2b.台盼蓝染色法的加拿大一枝黄花菌根形态图3a.本专利方法染色的酢浆草菌根形态图3b.台盼蓝染色法染色的酢浆草菌根形态图4a.本专利方法染色的狗尾草菌根中丛枝结构形态图4b.台盼蓝染色法染色的狗尾草菌根中丛枝结构形态图5实验操作过程示意图具体实施方式利用该高效快速的菌根染色改良方法对多种植物的菌根进行染色检验，评估染色效果。在江苏大学校园内选取四种常见植物分别为：加拿大一枝黄花、酢浆草、大叶黄杨、狗尾草。其中加拿大一枝黄花属菊科，酢浆草为豆科，狗尾草为禾本科，三者均属于草本植物；大叶黄杨为冬青科，属于小乔木，这四种植物分别可代表菌根研究中常见到的植物类型。实施例1步骤一、植物根样采集和固定2012年8月中旬在江苏大学校园内采集四种植物的5~10cm的幼嫩根段各10个，放入盛有FAA固定液的三角瓶中，带回实验室。根据菌根侵染的特性，避免采取木质化严重的老根。步骤二、根样的清洗与消化将FAA固定液中的根样取出后用蒸馏水冲洗数次，将根表面的泥土冲洗干净。洗净的根样分别放入四个盛有100ml10％（W/V）KOH溶液的三角瓶，分别标记。将四个三角瓶分为两组，其中大叶黄杨和加拿大一枝黄花的根颜色较深，归为A组；酢浆草和狗尾草的根颜色较浅，归为B组。A组根呈褐色，说明根中色素含量较多，在121℃高压灭菌10min；B组根较嫩且颜色较浅，在121℃高压灭菌5min以除去根中的细胞质。步骤三、根样漂洗与酸化将消化处理的根在室温冷却后，将根从KOH溶液中取出，用蒸馏水冲洗干净。酢浆草和狗尾草的根经过消化后透明程度已经比较好，无需进行漂洗处理，蒸馏水冲洗后，将根浸入1％HCl中酸化3min。大叶黄杨和加拿大一枝黄花的根呈浅黄色，将根样浸入H2O2漂洗液中，漂白根样5min。然后将根浸入1％HCl中酸化3min。步骤四、根样的染色将酸化后的根取出后用蒸馏水冲洗干净，浸入盛有0.1％台盼蓝（Trypanblue）染色液的三角瓶中，煮沸10min。步骤五、脱色待染色液冷却后，将根取出，用蒸馏水冲洗掉染色液。然后将根浸泡在50％乳酸溶液中脱色10min。步骤六、观察和拍照记录将脱色后的根段取出，在载玻片上用手术刀片切成长1cm长度的茎段，用盖玻片压好后，在光学显微镜下进行观察，鉴定根部AMF菌丝分布和根内丛枝结构（见图1a，图2a，图3a，图4a）。同时利用常规的台盼蓝染色法对四种植物的根样进行染色，并进行观察拍照记录（见图1b，图2b，图3b，图4b）。与常规的台盼蓝染色法相比，该快速高效的菌根染色方法操作时间短，图片清晰度高,可以清晰的观察到菌丝形态（图1a，图2a，图3a）。台盼蓝染色法观察的菌丝结构不清楚（图1b，图2b，图3b），并且不能有效的观察狗尾草菌根中的丛枝结构（图4b）。该高效快速的的方法将根样的透明处理更彻底，使AM真菌的菌丝与根部皮层反差大，更利于AM真菌菌丝和丛枝结构的观察（图4a），为研究丛枝结构和菌丝形态提供了方便，是AM真菌染色研究中的一项重要改进。实施例2步骤一、植物根样采集和固定2012年8月中旬在江苏大学校园内采集四种植物的5~10cm的幼嫩根段各10个，放入盛有FAA固定液的三角瓶中，带回实验室。根据菌根侵染的特性，避免采取木质化严重的老根。步骤二、根样的清洗与消化将FAA固定液中的根样取出后用蒸馏水冲洗数次，将根表面的泥土冲洗干净。洗净的根样分别放入四个盛有100ml10％（W/V）KOH溶液的三角瓶，分别标记。将四个三角瓶分为两组，其中大叶黄杨和加拿大一枝黄花的根颜色较深，归为A组；酢浆草和狗尾草的根颜色较浅，归为B组。A组根呈褐色，说明根中色素含量较多，在121℃高压灭菌10min；B组根较嫩且颜色较浅，在121℃高压灭菌5min以除去根中的细胞质。步骤三、根样漂洗与酸化将消化处理的根在室温冷却后，将根从KOH溶液中取出，用蒸馏水冲洗干净。酢浆草和狗尾草的根经过消化后透明程度已经比较好，无需进行漂洗处理，蒸馏水冲洗后，将根浸入1％HCl中酸化5min。大叶黄杨和加拿大一枝黄花的根呈浅黄色，将根样浸入H2O2漂洗液中，漂白根样10min。然后将根浸入1％HCl中酸化5min。步骤四、根样的染色将酸化后的根取出后用蒸馏水冲洗干净，浸入盛有0.1％台盼蓝（Trypanblue）染色液的三角瓶中，煮沸10min。步骤五、脱色待染色液冷却后，将根取出，用蒸馏水冲洗掉染色液。然后将根浸泡在50％乳酸溶液中脱色10min。步骤六、观察和拍照记录将脱色后的根段取出，在载玻片上用手术刀片切成长1cm长度的茎段，用盖玻片压好后，在光学显微镜下进行观察。