一种外生菌根合成方法
【专利摘要】本发明公开了一种关于外生菌根快速合成技术，包括以下步骤：采用组织分离法，在无菌的条件下取外生菌根真菌的菌盖组织接种于MMN培养基上避光培养，在菌根合成袋内，用分离获得的菌丝体纯培养对二至三个月苗龄的树苗进行接种，置于光照培养箱内培养半个月至三个月即可得到菌根。本方法便于筛选最适的树种与外生菌根真菌共生组合，缩短周期，提高效率，降低成本，指导菌根型食用菌的人工栽培。
【专利说明】
一种外生菌根合成方法
技术领域
[0001 ]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种外生菌根合成技术，尤其涉及一种快速高效的外生菌根合成技术。
【背景技术】
[0002]外生菌根真菌与树木形成外生菌根后，使外生菌根具有诸多功能，比如促进林木生长、增强营养吸收、增强抗病性、抗旱性并且改良土壤结构，对于保护生物多样性以及维护生态平衡具有积极的意义。近年来的研究中有一些关于红汁乳菇和松乳菇菌根合成的方法，但是周期普遍较长且过程复杂，本发明公开了一种外生菌根快速、高效的合成方法，为外生菌根真菌的人工栽培打下良好的基础。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种外生菌根快速合成方法，以便于筛选最适的树种与外生菌根真菌共生组合，缩短周期，提高效率、降低成本，指导人工栽培。
[0004]为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案:
[0005]—种外生菌根的合成方法，包括以下步骤:
[0006](I)采用组织分离法，无菌的条件下，取外生菌根真菌的菌盖菌肉接种于MMN培养基上避光培养；
[0007](2)将步骤(I)分离得到的菌丝体纯培养与三个月苗龄的共生树种幼苗于菌根接种袋中接种，加入MMN营养液，置于光照培养箱中培养半个月-三个月，得到菌根。
[0008]根据所述的外生菌根的合成方法，其中所述步骤(I)中MMN培养基配方为MgSO4.7H20 1.5g,KH2PO4 3g，酵母浸膏5g，葡萄糖 10g，麦芽糖 10g，VB1 0.01g，NaCl 0.058g，CaCl2 1.1lg，柠檬酸铁1.5X10—2g，PDA 24g，琼脂7g( 1L);所述的MMN营养液配方为:MgSO4.7H20 1.5g,KH2PO4 3g，酵母浸膏5g，葡萄糖 10g，麦芽糖 10g，VB1 0.01g，NaCl 0.058g，CaCl2 1.llg，柠檬酸铁1.5 X 10—2g，PDA24g。
[0009]根据所述的外生菌根的合成方法，其中所述步骤(2)中树幼苗的获得是采用:共生树种用自来水清洗三遍后，用75%酒精浸泡30分钟进行表面消毒，无菌水冲洗三遍后播于装有1:1的蛭石和珍珠岩的塑料筐内，在精控温室条件空气温度20-25°C、基质湿度60-70%下培养，无菌水浇灌;育苗基质蛭石和珍珠岩需先在121°C、0.1MPa中灭菌lh，灭菌结束后放置3天后，在同样条件中再次灭菌I次。
[0010]根据所述的外生菌根的合成方法，其中所述步骤(2)中树幼苗接种前将幼苗主根根尖剪去l-2cm，以便于侧根的生长以及侵染。
[0011]根据所述的外生菌根的合成方法，其中所述步骤(2)中接种袋为长25cm、宽15cm的聚丙烯培养袋，剪裁大小合适的滤纸于袋中，袋的底部左右两侧分别放置长3cm、宽3cm、厚3cm的海绵，便于后期吸水保湿。
[0012]根据所述的外生菌根的合成方法，其中所述步骤(2)中接种时将树幼苗置于培养袋中间位置，选取已分割好的菌块附着于共生树种幼苗侧根，一棵苗需要3块菌块，加入50ml营养液，封口；所述菌块是指在无菌条件下，将长满菌丝体的培养基用接种刀划分成IcmX I cm大小的正方型菌块。
[0013]根据所述的外生菌根的合成方法，其中所述步骤(2)中光照培养箱设定温度为230C，湿度为55%，12h光照，12h黑暗。
[0014]根据所述的外生菌根的合成方法，该方法包括下述步骤:
[0015](I)外生真菌菌种的分离和纯化:在无菌的条件下取外生真菌的菌盖接近菌褶处组织，接种于MMN培养基平板上28°C避光培养，MMN培养基配方为:MgS04.7H20: 1.5g,KH2PO4:3g，酵母浸膏:5g，葡萄糖:10g，麦芽糖:10g，VB1:0.01g，NaCl:0.058g，CaCl2:1.1Ig，梓檬酸铁:I.5 X I O—2g，PDA24g，琼脂:7g (IL); MMN 营养液配方为:MgSO4.7H20 1.5g, KH2PO4 3g，酵母浸膏5g，葡萄糖 10g，麦芽糖 10g，VB1 0.01g，NaCl 0.058g,CaCl2 1.llg，柠檬酸铁1.5 X 10—2g,PDA24g0
[0016](2)无菌苗培养:共生树种子用自来水清洗三遍后，用75%酒精浸泡30分钟进行表面消毒，无菌水冲洗三遍，育苗基质蛭石和珍珠岩按1:1配比，灭菌后置于塑料筐内，所育苗均于大棚温室10-30°c条件下培养，自来水浇灌；育苗基质蛭石和珍珠岩预先在121°C、0.1MPa下灭菌2h，灭菌结束后放置3天，之后同样条件再次灭菌；
[0017](3)接种:共生树种栽培3个半月后，准备接种，接种前将共生树种幼苗主根根尖剪去l-2cm，便于侧根的生长以及侵染;外生真菌菌丝体平板长满后，在无菌条件下，用接种刀将菌丝体划分成IcmX Icm大小的正方形备用;接种袋为长25cm、宽17cm的自封袋，剪裁大小合适的滤纸于袋中，袋的底部左右两侧分别放置长3cm、宽3cm、厚3cm的海绵，便于后期吸水保湿;将幼苗置于接种袋中间位置，选取已分割好的外生真菌菌块附着于幼苗侧根，一棵苗需要3块菌块，加入50ml MMN营养液，所述的MMN营养液配方为:MgS04.7H20 1.5g, KH2PO43g，酵母浸膏 5g，葡萄糖 10g，麦芽糖 10g，VBi 0.01g，NaCl 0.058g，CaCl2 1.llg，梓檬酸铁1.5 X 10—2g，PDA24g;封口；置于培养箱设定温度为23°C，湿度为55 %，12h光照，12h黑暗，培育3个月，从无菌苗根系上得带外生真菌的菌根；
[0018](4)菌根鉴定:对得到的菌根进行DNA提取，并对其PCR产物进行测序，证明所得菌根为外生真菌。
[0019]本方法便于筛选最适的树种与外生菌根真菌共生组合，缩短周期，提高效率、降低成本，指导人工栽培。
【附图说明】
:
[0020]图1为本发明菌根合成袋示意图，图中:I为自封袋，2为松木苗，3为接种的菌丝体块，4为海绵块，5为层析纸。
【具体实施方式】
[0021]下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。
[0022]实施例1
[0023]乳牛肝(Suillus bovinus)与落叶松(Larix gmelinii)的快速菌根合成方法:
[0024]乳牛肝的子实体鉴别:点柄乳牛肝菌子实体中等大。菌盖扁半球形或近扁平，直径
5.2-10cm，淡黄色或黄褐色，湿时粘滑，干后有光泽。菌肉淡黄色，受伤后不变色。菌管淡黄色，直生或稍延生，管口三角形。菌柄近柱形、实心，淡黄褐色，长3-lOcm，粗0.8-1.6cm，顶端偶有约Icm长的网纹，菌柄一半或全部有暗色腺体和腺点，伤时有乳汁流出。孢子无色到淡黄色，长椭圆形，(6.5-9.1)μπιΧ(2.6-3.9)μπι。
[0025]乳牛肝菌种分离、纯化:在无菌的条件下取乳牛肝(Suillus bovinus)的菌盖接近菌褶处组织，接种于MMN培养基平板上28 0C避光培养，MMN培养基配方为:MgSO4.7H20:1.5g，KH2P04:3g，酵母浸膏:5g，葡萄糖:10g，麦芽糖:10g, Vbi:0.0 lg, NaCl:0.058g, CaCb: 1.llg,柠檬酸铁:I.5 X 10—2g，PDA 24g，琼脂:7g(IL) JMN营养液配方为:MgSO4.7H20 I.5g，KH2PO43g，酵母浸膏 5g，葡萄糖 10g，麦芽糖 10g，VBi 0.01g，NaCl 0.058g，CaCl2 1.llg，梓檬酸铁1.5X10—2g，PDA 24g0
[0026]无菌苗培养:落叶松种子用自来水清洗三遍后，用75%酒精浸泡30分钟进行表面消毒，无菌水冲洗三遍，育苗基质蛭石和珍珠岩按1:1配比，灭菌后置于塑料筐内，所育苗均于大棚温室条件下培养(10-30°c)，自来水浇灌。
[0027]更进一步的方案可选择:育苗基质蛭石和珍珠岩预先在121°C、0.1MPa下灭菌2h，灭菌结束后放置3天，之后同样条件再次灭菌。
[0028]接种:落叶松栽培3个半月后，准备接种。接种前需要将落叶松幼苗主根根尖剪去l-2cm，以便于侧根的生长以及侵染;乳牛肝菌丝体平板长满后，在无菌条件下，用接种刀将菌丝体划分成IcmX Icm大小的正方形备用;接种袋为长25cm、宽17cm的自封袋，剪裁大小合适的滤纸于袋中，袋的底部左右两侧分别放置长3cm、宽3cm、厚3cm的海绵，便于后期吸水保湿;将落叶松幼苗置于接种袋中间位置，选取已分割好的乳牛肝菌块附着于松木幼苗侧根，一棵苗需要3块菌块，加入50ml MMN营养液(每升含MgSO4.7H20:1.5g，KH2PO4: 3g，酵母浸膏:5g，葡萄糖:10g，麦芽糖:10g，VB1:0.01g，NaCl:0.058g，CaCl2:1.llg，梓檬酸铁:1.5 X 10—2g，PDA24g，)，封口；置于培养箱设定温度为23°C，湿度为55 %，12h光照，12h黑暗，培育3个月，从落叶松无菌苗根系上得带乳牛肝菌根。
[0029]菌根鉴定:对得到的菌根进行DNA提取，并对其PCR产物进行测序，证明所得菌根为乳牛肝。
[0030]实施例2
[0031]红汁乳^(Lactariushatsudake)与赤松(Pinus densif1ra)的快速菌根合成技术:
[0032]红汁乳菇子实体鉴别:担子果中等大小至较小。菌盖直径3-7cm，边缘内卷，中心凹陷；表面水浸状，灰红色、淡红色、伤后变浅深蓝绿色，具微弱环纹或不具环纹。菌肉淡红色，具紫红色小点。菌褶宽1.5-5mm，密，近密至稍稀，直生，近延生，酒红色，伤后或老后变深蓝绿色。菌柄1.5-4 X 0.5-1 (3)cm，幼时实心，成熟后空心，近圆柱状，等粗或向下渐细，中生；表面光滑，无窝斑，淡红色，伤后变深蓝绿色;基部具浅黄褐色糙伏毛。乳汁少，酒红色，菌柄基部的乳汁更橙色，不变色，柔和。无特殊气味。孢子印淡奶油褐色。
[0033]红汁乳燕菌种分离、纯化:在无菌的条件下取红汁乳燕(Lactarius hatsudake)的菌盖接近菌褶处组织接种于MMN培养基平板上28 °C避光培养，MMN培养基配方为:MgSO4.7H20:1.5g，KH2PO4: 3g，酵母浸膏:5g，葡萄糖:1g，麦芽糖:1g ,Vbi: 0.0lg ,NaCl:0.0588，0&(:12:1.118，柠檬酸铁:1.5\10、，？0厶 24g，琼脂:7g(lL)。
[0034]无菌苗培养:油松种子用自来水清洗三遍后，用75%酒精浸泡30分钟进行表面消毒，无菌水冲洗三遍，育苗基质蛭石和珍珠岩按1:1配比，灭菌后置于塑料筐内，所育苗均于大棚温室条件下培养(10-30°c)，自来水浇灌。
[0035]育苗基质蛭石和珍珠岩预先在121°C、0.1MPa下灭菌2h，灭菌结束后放置3天，之后同样条件再次灭菌。
[0036]接种:油松栽培2个半月后，准备接种。接种前需要将油松幼苗主根根尖剪去1-2cm，以便于侧根的生长以及侵染;红汁乳菇菌丝体平板长满后，在无菌的条件下，将用接种刀将菌丝体划分成Icm X Icm大小的正方形备用;接种袋为长25cm、宽17cm的自封袋，剪裁大小合适的层析纸于袋中，袋的底部左右两侧分别放置长3cm、宽3cm、厚3cm的海绵，便于后期吸水保湿;将油松幼苗置于接种袋中间位置，选取已分割好的红汁乳菇菌块附着于松木幼苗侧根，一棵苗需要3块菌块，加入20ml MMN营养液(每升含MgSO4.7H20:1.5g，KH2PO4: 3g，酵母浸膏:5g，葡萄糖:10g，麦芽糖:10g，VB1:0.01g，NaCl:0.058g，CaCl2:1.llg，梓檬酸铁:1.5X 10—2g，PDA 24g，)，封口；置于培养箱设定温度为23 V，湿度为55 %，12h光照，12h黑暗，培育3个月，从油松无菌苗根系上得带红汁乳菇的菌根。
【主权项】
1.一种外生菌根的合成方法，包括以下步骤: (1)采用组织分离的方法，在无菌条件下，取外生菌根真菌的菌肉组织接种于MMN培养基上避光培养； (2)将步骤(I)在菌根接种袋内，用分离得到的菌丝体纯培养与三个月苗龄的共生树种幼苗进行接种，加入MMN营养液，置于光照培养箱中培养半个月至三个月，即可得到菌根。2.根据权利要求1所述的外生菌根合成方法，其特征在于，所述步骤(I)中MMN培养基配方为 MgS04.7H2〇 1.5g ,KH2PO4 3g，酵母浸膏 5g，葡萄糖 10g，麦芽糖 10g，VBi 0.01g，NaCl0.058g，CaCl2 I.Ilg，柠檬酸铁I.5X 10—2g，PDA 24g，琼脂20g(lL);所述的MMN营养液配方为:MgS04.7H20 1.5g，KH2P04 3g，酵母浸膏 5g，葡萄糖 1g，麦芽糖 1g，Vbi 0.01g，NaCl0.058g,CaCl2 I.llg，柠檬酸铁I.5 X 10—2g，PDA 24g。3.根据权利要求1所述的外生菌根合成方法，其特征在于，所述步骤(2)中共生树种幼苗的获得是采用:树的种子用自来水清洗三遍后，用75%酒精浸泡30分钟进行表面消毒，无菌水冲洗三遍后播于装有1:1的蛭石和珍珠岩的塑料筐内，在精控温室条件为空气温度20-25°C、基质湿度60-70%下培养，无菌水浇灌；育苗基质蛭石和珍珠岩需先在121°C、0.1MPa中灭菌lh，灭菌结束后放置3天后，在同样条件中再次灭菌I次。4.根据权利要求1所述的外生菌根的合成方法，其特征在于，所述步骤(2)中共生树种幼苗接种前将幼苗主根根尖剪去l-2cm，以便于侧根的生长和侵染。5.根据权利要求1所述的外生菌根的合成方法，其特征在于，所述步骤(2)中接种袋为长25cm、宽15cm的聚丙烯培养袋，剪裁大小合适的滤纸于袋中，袋的底部左右两侧分别放置长3 cm、宽3 cm、厚3 cm的海绵，便于后期吸水保湿。6.根据权利要求1所述的外生菌根合成方法，其特征在于，所述步骤(2)中接种时将共生树种幼苗置于培养袋中间位置，选取已分割好的菌块附着于树幼苗侧根，一棵苗需要3块菌块，加入50ml营养液，封口；所述菌块是指在无菌条件下，将长满菌丝体的培养基用接种刀划分成IcmX Icm大小的正方型菌块。7.根据权利要求1所述的外生菌根的合成方法，其特征在于，所述步骤(2)中光照培养箱设定温度为23°C，湿度为55%，12h光照，12h黑暗。8.根据权利要求1所述的外生菌根的合成方法，其特征在于该方法包括下述步骤: (1)外生真菌菌种的分离和纯化:无菌条件下，取外生真菌菌盖与菌柄交接处的菌肉组织，接种于MMN培养基上28 0C避光培养，MMN培养基配方为:MgSO4.7H20:1.5g，KH2PO4: 3g，酵母浸膏:5g，葡萄糖:10g，麦芽糖:10g，VB1:0.01g，NaCl:0.058g，CaCl2:1.llg，梓檬酸铁:1.5X10—2g，PDA 24g，琼脂:20g(lL); (2)无菌苗培养:共生树种子用自来水清洗三遍后，用75%酒精浸泡30分钟进行表面消毒，无菌水冲洗三遍，育苗基质蛭石和珍珠岩按1:1配比，灭菌后置于塑料筐内，所育苗均于大棚温室10-30°C条件下培养，自来水浇灌;育苗基质蛭石和珍珠岩预先在121°C、0.1MPa下灭菌2h，灭菌结束后放置3天，之后同样条件再次灭菌； (3)接种:树苗栽培3个半月后，准备接种，接种前将共生树种幼苗主根根尖剪去l-2cm，便于侧根的生长以及侵染;外生真菌菌丝体平板长满后，在无菌条件下，用接种刀将菌丝体划分成IcmX Icm大小的正方形备用;接种袋为长25cm、宽17cm的自封袋，剪裁大小合适的滤纸于袋中，袋的底部左右两侧分别放置长3cm、宽3cm、厚3cm的海绵，便于后期吸水保湿;将树种幼苗置于接种袋中间位置，选取已分割好的外生真菌菌块附着于幼苗侧根，一棵苗需要3块菌块，加入50ml MMN营养液，所述的MMN营养液配方为:MgS04.7H20 1.5g,KH2PO4 3g，酵母浸膏5g，葡萄糖 10g，麦芽糖 10g，VBi 0.01g，NaCl 0.058g,CaCb.Hg，梓檬酸铁1.5 X.10、，PDA 24g;封口；置于培养箱设定温度为23°C，湿度为55%，12h光照，12h黑暗，培育3个月，从共生树种无菌苗根系上得到外生真菌的菌根； (4)菌根鉴定:对得到的菌根进行DNA提取，并对其PCR产物进行测序，证明所得菌根为外生真菌。
【文档编号】A01G1/04GK105917972SQ201610516887
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年7月4日
【发明人】于富强, 李晶, 王冉
【申请人】中国科学院昆明植物研究所