一种真菌培养物的提取物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术和化学领域，尤其涉及一种真菌培养物的提取物及其制备方 法和应用。
【背景技术】
[0002] 老年痴呆特别是阿尔茨海默型痴呆(Alzheimer's Disease:AD)，也就是通常所说 的阿尔茨海默病，是一种进行性发展的致死性神经退行性疾病，临床表现为认知和记忆功 能不断恶化，日常生活能力进行性减退，并有各种神经精神症状和行为障碍。据中国阿尔茨 海默病协会2011年的公布调查结果显示，全球有约3650万人患有痴呆症，每7秒就有一个人 患上此病，平均生存期只有5.9年，是威胁老人健康的"四大杀手"之一。这也使得AD症的预 防和治疗成为21世纪以来需要攻克的重大医药课题。
[0003] 关于阿尔茨海默病的发病机制，一般认为Αβ聚集体的形成是引发阿尔茨海默病的 重要原因。β-淀粉样多肽(Αβ)，尤其是含有42个氨基酸残基的Αβ(1-42)，被认为是阿尔茨海 默病发病的核心蛋白。目前主流的Αβ中心学说认为:体内Αβ正常的产生和清除的平衡一旦 破坏，就会发生Α邱勺积累，这导致了阿尔茨海默病的发生，而Α邱勺聚集则是产生生理毒性的 关键。现在还没有发现合适的药物能够从根本上解决Αβ的聚集及毒性的产生从而治愈疾 病，因此，寻找新型的能够抑制Αβ聚集的小分子有机化合物及其制备方法，进而从根本上治 疗阿尔茨海默病已迫在眉睫。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种能够抑制Αβ聚集的小分子有机化合物及其制备方法， 进而从根本上治疗阿尔茨海默病。
[0005] 本发明是这样实现的，一种真菌培养物的提取物，所述提取物是从真菌 Trichoderma sp.的培养发酵液的乙酸乙酯萃取液中浓缩、分离得到的无色油状物;所述无 色油状物为倍半萜类化合物;所述倍半萜类化合物包括以下化合物，化合物的结构式如下 所示：
[0007]所述倍半萜类化合物包括以下化合物中的一种或两种，化合物的结构式如下所 示：
[0010]为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种真菌培养物的提取物的制备方法， 包括以下步骤：
[0011] (1)将真菌Trichoderma sp.接种到种子培养基中，获得种子培养液；
[0012] (2)按接种量将种子培养液接种到大米固体培养基中，室温静置培养40~50天，获 得发酵培养液；
[0013] (3)将上述发酵培养液用乙酸乙酯萃取，获得萃取液，经浓缩、分离获得真菌 Trichoderma sp.培养物的无色油状提取物。
[0014] 进一步地，所述萃取液浓缩、分离的过程为:将萃取液在低于50°C下减压浓缩得 发酵液浸膏;将发酵液浸膏经硅胶柱层析分离、反向硅胶柱层析分离、反向HPLC分离纯化， 获得真菌Trichoderma sp.培养物的提取物。
[0015] 进一步地，所述种子培养液的配置过程为：Trichoderma sp.接种到种子培养基 上，在转速220r/min、27~29°C条件下培养47~49小时获得种子培养液。
[0016] 进一步地，所述种子培养基的成分，按重量百分比计，包括:葡萄糖1.9~2.1%，蛋 白胨0.9~1.1 %，酵母提取物0.4~0.6 %，海盐2~4%，其余为去离子水;所述种子培养基 经121°C高压灭菌20分钟后获得。
[0017] 进一步地，所述大米固体培养基的成分包括海盐、去离子水和大米，所述海盐、去 离子水、大米的质量比为7~8:240~260:140~160。
[0018] 进一步地，所述大米固体培养基的配制过程为:按质量比称取海盐、去离子水和大 米，将海盐完全溶解于去离子水中，然后加入大米，浸泡过夜，再经121°C高压灭菌40分钟获 得大米固体培养基。
[0019] 进一步地，所述接种量为每lmL种子培养液对应28~32g大米培养基。
[0020] 进一步地，所述萃取过程具体为:按比例向发酵提取物中添加乙酸乙酯，所述乙酸 乙酯与发酵提取物的体积比为70~90: 5。
[0021 ] 进一步地，所述萃取为超声萃取，超声萃取时间为30~40分钟，频率为40KHz。
[0022] 为了解决上述技术问题，本发明还一种真菌培养物的提取物的应用，所述提取物 用于制备抗Αβ42聚集活性的制剂。
[0023] 进一步地，所述提取物用于制备治疗阿尔茨海默病的药物。
[0024]本发明与现有技术相比，有益效果在于:本发明在深海真菌Trichoderma sp.的发 酵培养物中首次分离出3个倍半萜类化合物，其中1个是新化合物。我们对所述倍半萜类化 合物进行抗Αβ聚集活性测定，其中1个化合物具有很强的抗Αβ聚集活性，另外2个化合物具 有较强的抗Αβ聚集活性。本发明的提取物可以用于制备治疗阿尔茨海默病的药物。
【具体实施方式】
[0025]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于 限定本发明。
[0026] 近几十年来，天然产物领域的技术不断成熟及实验设备不断完善，从陆地环境的 生物分离得到一些具有治疗AD症的先导化合物，但有限的陆地资源使得发现新的具有抗AD 的活性化合物出现明显减缓趋势，而海洋是生命的发源地且占地球表面积的2/3,和陆地环 境相差甚远，产生与陆地真菌不同的次级代谢产物的可能性比较大，因此海洋的研究空间 不仅非常广阔，而且具有极其重要的研究意义。
[0027] 本发明首先对采自中国南海深海真菌SCSI0W21进行菌种鉴定，确定菌株名称 Trichoderma sp.，然后利用大米固体培养基对深海来源真菌20株进行了初步发酵，乙酸乙 酯萃取得到提取物后，运用TLC薄层色谱分析，正、反相硅胶柱色谱，Sephadex LH-20凝胶柱 色谱，高效液相等现代色谱学手段对发酵产生的次级代谢产物进行分离纯化，并对得到的 化合物应用现代波谱学方法(15^1?、〇^￥、批0(：、圓8(：、1^^等)和理化性质等确定其化学结 构。对提取物进行了多种活性测定，包括一氧化氮(N0)产生抑制活性、抗癌细胞毒活性、A-Beta蛋白聚集抑制活性、以及多种细菌的抗菌活性。最后，利用ThT模型对分离得到的化合 物进行抗Αβ 42多肽聚集活性的筛选，试图发现抗老年痴呆的活性化合物，从而解决困扰老年 人身体健康的重大疾病。
[0028] 按照本发明的技术方案进行如下操作：
[0029] -、种子培养：
[0030] 将低温保藏的深海真菌菌种Trichoderma SP.SCSI0W21复苏后，将菌种接种到种 子培养基中，27~29°C培养47~49小时，得到种子培养液；
[0031] 其中，种子培养基的配方为：葡萄糖1.9~2.1%，蛋白胨0.9~1.1%，酵母提取物 0.4~0.6%，海盐2~4%。经121°C高压灭菌20分钟。
[0032]二、发酵培养：
[0033]将种子培养液接种到大米固体培养基中，室温静置培养40~50天，获得深海真菌 Trichoderma sp · SCSI0W21 的发酵培养物；
[0034]其中，大米固体培养基的成分包括海盐、去离子水和大米，其中，海盐:去离子水： 大米的质量比为7~8: 240~260:140~160。具体的制备方法为：按比例称取海盐溶于去离 子水中，待海盐完全溶解后，加入大米，浸泡过夜。经121°C高压灭菌40分钟。按照每5mL种子 培养液配140~160g大米的比例接种。
[0035]按照上述方法发酵后，就可以得到含有所述倍半萜类化合物的深海真菌 Trichoderma sp. SCSI0W21的发酵培养物，为了获取所述倍半砲类化合物，还需要进一步提 取分离。本发明中还提供利用深海真菌Trichoderma sp.SCSI0W21发酵物提取纯化所述倍 半萜类化合物的方法，具体包括以下步骤：
[0036] 超声萃取:将深海真菌Trichoderma Sp.SCSI0W21的发酵培养物用乙酸乙酯超声 萃取，萃取液在低于50°C下减压浓缩得发酵液浸膏;重复前述萃取步骤数次，合并发酵液浸 膏；
[0037] 硅胶柱层析分离:将发酵液浸膏拌入硅胶后装硅胶柱，以氯仿-甲醇为洗脱溶剂梯 度洗脱，经TLC分析，根据极性大小的不同获取两个组分W21-l、W21-2;
[0038] 反向硅胶柱层析分离：分别将W21-1、W21_2组分进行反向硅胶柱层析分离，以甲 醇-水为洗脱溶剂梯度洗脱，经TLC分析，分别得到组分W21 -1 -1、W21 -2-1;
[0039] 反向HPLC分离纯化:组分W21-1-l、W21-2-l用反向HPLC柱分离纯化，0-30min内甲 醇浓度分别由30%和50%的等浓度冲洗，W21-1-1收集后即可得到纯化的式（I)倍半萜类化 合物，W21-2-1收集后可得到纯化的式（Π )和式(ΙΠ )倍半萜类化合物。
[0040] 其中，所述超声萃取过程中，按照每5mL种子培养液配350~450mL的乙酸乙酯比例 添加乙酸乙酯。所述硅胶柱层析分离过程中，所用硅胶为200~300目，洗脱溶剂梯度为氯 仿-甲醇体积比100:0,99:1，98:2,97:3,96:4,95:5,9:1，8:2,7:3,6:4,0:100。
[0041]以下通过具体实施例对本发明做进一步说明。
[0042]实施例1真菌培养物的提取物的制备和结构鉴定 [0043] 一、提取物的制备 [0044] 1.种子培养：
[0045] (1)配制种子培养基：葡萄糖1.9~2.1%，蛋白胨0.9~1.1%，酵母提取物0.4~ 0.6%，海盐2~4%。121°C高压灭菌20分钟，获得灭菌的种子培养基。
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