一种从复杂环境样品筛选与计数产淀粉酶真菌的培养基的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物工程技术领域，具体地说是涉及一种从复杂环境样品筛选与计数产淀粉酶真菌的培养基。
【背景技术】
[0002]复杂环境样品如土壤样品，酒曲样品等含有众多数量和种类的微生物，各种功能相同或者相近的微生物集合体构成了不同的微生物功能群，如本发明关注的淀粉降解微生物功能群。微生物功能群的研宄在工业，农业，微生物治理，医学和基因工程方面均有重要的现实意义。
[0003]研宄微生物功能群其中重要的方法包括应用特定的选择培养基进行分离培养和计数。但是该种方法在培养过程中主要面临三个问题:环境样品成分复杂，细菌众多，容易造成污染；真菌生长速度太快，很快占领整个平板培养基，这样真菌之间的界限很难确定，不能准确计数；真菌种类众多，不能直观的选择出目标微生物，例如产淀粉酶真菌。对于产淀粉酶真菌的筛选，现有报道中的解决办法一般是分两步完成:先用含有细菌抗生素的真菌培养基如马铃薯培养、查氏培养基、或者马丁氏琼脂培养基分离所有优势真菌，然后将分离到的真菌接种到淀粉培养基进行鉴定。但是该种方法需要配制大量培养基，总培养时间长，工作量大。对于产淀粉酶真菌的计数则少有报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于针对现有产淀粉酶真菌计数与筛选培养基的不足，提出一种对于产淀粉酶真菌快速培养、分离计数与筛选的新型培养基，该种培养基是含细菌和真菌抗生素混合的培养基，具有能完全抑制细菌生长，能一次对复杂环境中产淀粉酶真菌进行培养、分离、计数，且配制简单，计数操作简单易行。
[0005]本发明新型培养基的配制与筛选步骤:
[0006]1、配制下述培养基
[0007](I)配制S培养基(基础培养基)，其成分为NaN032g，K2HP04lg，KCl 0.5g，MgSO40.5g，FeSO40.0lg，可溶性淀粉 10g，琼脂 15g，曲利苯蓝 0.lg，水 100mL ；
[0008]配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后补足水分至1000mL。121°C灭菌30min，待用。
[0009](2)配制5种细菌抗生素培养基(共8种)
[0010]a) SC培养基(S培养基中加氯霉素至终浓度97.5mg/L)，
[0011]b)SK培养基(S培养基中加卡那霉素至终浓度分别为18 μ g/mL、36 μ g/mL、54 μ g/mL、72 μ g/mL，分别编号为 SKl、SK2、SK3、SK4。)，
[0012]c)SP培养基(S培养基中加氨苄青霉素至终浓度112.5mg/L)，
[0013]d) SS培养基(S培养基中加链霉素至终浓度30mg/L)，
[0014]e) ST培养基(S培养基中加四环霉素至终浓度30mg/L)。
[0015](3)配制含细菌和真菌抗生素混合培养基(共16种)
[0016]在SK3培养基中加入制霉菌素溶液至终浓度分别为0.9 μ g/mL、1.8 μ g/mL、
3.6 μ g/mL,7.2 μ g/mL，编号为 SK3N1、SK3N2、SK3N3，SK3N4 ; (4 种)
[0017]在SK3培养基中加入酮康唑溶液至终浓度分别为2.5 μ g/mL, 5.0 μ g/mL,10.0 μ g/mL，编号为 SK3K1、SK3K2、SK3K3 ; (3 种)
[0018]在SK3培养基中加入两性霉素溶液至终浓度分别为0.0Syg/mU0.10 μ g/mL,
0.20 μ g/mL，编号为 SK3A1、SK3A2、SK3A3 ; (3 种)
[0019]在SK3培养基中加入灰黄霉素溶液至终浓度分别为0.3 μ g/mL,0.6 μ g/mL,
1.2 μ g/mL，编号为 SK3G1、SK3G2、SK3G3 ; (3 种)
[0020]在SK3培养基中加入克霉唑溶液至终浓度分别为1.0 μ g/mL,2.0 μ g/mL,4.0 μ g/mL，编号为 SK3CU SK3C2、SK:3C3。(3 种)
[0021](4)配制其他培养基:在基础培养基(S)中按马丁氏琼脂培养基配方加入孟加拉红稀释液至终浓度33mg/L，加入链霉菌素稀释液至终浓度30 μ g/mL。(I种)
[0022]2、白云边中温大曲样品的处理
[0023]取粉碎后的白云边中温大曲样品10g，置于装有90mL无菌水带玻璃珠的三角瓶中，在37°C的摇床中(120r/min)，震荡30min。将处理好的样品，进行系列稀释，取10_2、10_3和10_4为最终涂布平板浓度。
[0024]3、真菌的培养与计数
[0025]3.1细菌抗生素种类的筛选
[0026]取活化的白云边中温大曲菌悬液10_2、10_3和10 _4三个梯度各100 μ L，在SC、SP、
SS、ST、SK3培养基上涂布平板，并S培养基平板为空白对照。每种处理3个重复。28°C培养。每隔12h观察菌落形态，并计数。(共6*3*3 = 54次)
[0027]对照培养基S上2?3d后长满细菌，数量大于为350个，如图1。而加入了细菌抗生素的平皿培养基上细菌数目均为个位数，不影响真菌计数，说明该实验所加入的细菌抗生素均能有效抑制细菌生长。在培养过程中，分离得到真菌一共有4种，其中I种数量占绝大数，另外3种每个平皿培养基上仅有I?2个菌落。培养基SP、ST、SS、SC上菌落形态基本一致，菌丝丝绒状，为白色，，贴附于培养基表面，菌落不规则，如图2、3、4、5 ;培养基SK3上菌落在培养4d后仍较小且规则，如图6。因此，最优培养基为添加卡那霉素的培养基SK3。
[0028]3.2卡那霉素浓度的筛选
[0029]为筛选最适卡那霉素浓度取活化的白云边中温大曲菌悬液10_2、10_3和10_4三个梯度各100 μ L，在SKl、SK2、SK3、SK4培养基上涂布平板，S培养基平板为空白对照。每种处理3个重复。28°C培养。每隔12h观察菌落形态，并计数。(共4*3*3 = 36次)
[0030]对照组培养基S上I?2d后细菌布满平板如图7。培养3d后，SKl培养基平板上出现少量细菌菌落，如图8 ;SK2、SK3、SK4培养基平板无细菌菌落出现，如图9_11。培养5d后，SK2和SK3培养基平板上真菌菌落菌落边缘清晰，形态较规则；培养基SK4上真菌数目仍较少，到6?7d真菌数目接近35个。故培养基中抑制细菌生长的最适卡那霉素浓度为54 μ g/mLο
[0031]3.3真菌抗生素种类和浓度的筛选
[0032]为筛选最适真菌抗生素，取活化的白云边中温大曲菌悬液10_2、10_3和10 _4三个梯度各 100 μ L，分别在 SK3N1—4、SK3K1—3、SK3A1—3、SK3G1—3 和 SK3C1—3 培养基上涂布平板。每种处理3个重复。28°C培养。每隔12h观察菌落形态，并计数。(共16*3*3 = 144次)2d后，SK3K1—2培养基平板上出现真菌。培养3d后，SK3K1—3培养基培养平板上真菌菌落较小，丝状，难以计数，其中SK3K1培养基平板真菌菌落如图12。SK3C1—3培养基平板在5d后真菌菌落仅有几个，其中SK3C1培养基平板如图13。SK3G1—3培养基平板培养近2d后占据整个平板，其中SK3G3培养基平板真菌菌落生长如图14。SK3A1-3培养基平板在培养近2d后开始出现真菌菌落，菌落较小，不规则，不容易计数