一种松香基功能高分子固定化淀粉酶及其制备方法

专利名称：：一种松香基功能高分子固定化淀粉酶及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种松香基功能高分子固定化淀粉酶及其制备方法，更具体地说本发明是马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉,及其制备方法。
背景技术：
：酶作为一种生物催化剂，具有催化效率高、专一性强、反应条件温和、可生物降解不会引起环境污染等优点；但是酶对环境影响十分敏感，各种化学、物理和生物因素(包括温度、压力、有机溶剂、离子强度、PH等)都可以使酶丧失生物活性。因此固定化酶的研究受到重视，固定化酶既具有催化特性，有具有能回收，反复使用等优点，并且生产工艺可以连续化、自动化。自从1916年Nelson和Griffin利用活性炭吸附蔗糖酶、1969年成功运用固定化酰化氨基酸水解酶生产L一氨基酸以来，固定化酶由于其良好的理化性质越来越广泛深入，目前常用的固定化酶方法有四种，吸附法、包埋法、共价键结合法及交联法，马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物及马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶的制备方法到目前为止未见文献报导。
发明内容本发明的目的是提供一种原料易得，价格低廉、具有合适的刚性和较好的机械稳定性，以共价键固定的一种马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶及其制备方法。本发明解决上述技术问题的方案是1.一种松香基功能高分子固定化淀粉酶，即马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶，其制备方法是以马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物为载体，首先用S0Cl2将马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物酰化得到酰化树脂，再将马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物酰化树脂在环己烷和淀粉酶溶液中磁力搅拌512h，洗涤，过滤树脂，树脂与淀粉酶反应得到马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶，具体步骤如下1).用环己垸浸泡马来松香乙二醇丙烯酸酯和丙烯酸共聚物2024h，过滤，放置在三颈瓶中，加入环己垸作溶剂，共聚物与环己烷的质量比为1:220，用恒压漏斗缓慢的向三颈瓶中加入S0Cl2，共聚物与S0Cl2质量比为1:l10，搅拌，约lh滴完，加热升温，温度控制在758(TC，回流58h，反应结束后，改蒸馏装置，蒸出多余的S0Cl2和环己烷，得到酰化树脂，最后用环己烷洗涤酰化树脂3次；2).向盛放酰化树脂的三颈瓶中分别加入环己烷和淀粉酶溶液，用磁力搅拌搅动溶液5-12h，整个过程中要在干燥条件下操作。洗涤，抽滤树脂，得到马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶；马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶的特点1克马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物以共价键固定0.10.2g淀粉酶，固定化酶的活性为2030mg.g\5min—、重复使用13次后剩余活性不低于6mg.gi.5mirf、相对保留活性不低于20%。2.马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶的制备方法，以马来松香乙二醇丙烯酯-丙烯酸共聚物为载体，以淀粉酶为原料，以环已烷作溶剂，SOCl2作酰化剂，将马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物酰化得到酰化树脂，再与淀粉酶反应得到马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物酰化树脂固定化淀粉酶，制备步骤如下1).用环己烷浸泡马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物2024h，过滤，放置在三颈瓶中，加入环己垸作溶剂，共聚物与环己垸的质量比为1:220，用恒压漏斗缓慢的向三颈瓶中加入S0Cl2,共聚物与SOCl2质量比为1:l10，搅拌，约lh滴完，加热升温，温度控制在758(TC，回流58h，反应5结束，蒸馏装置，蒸出多余的S0Cl2和环己垸，得到酰化树脂，最后用环己垸洗涤酰化树脂3次；2).向盛放酰化树脂的三颈瓶中分别加入环己烷和淀粉酶溶液，用磁力搅拌搅动溶液5-12h，整个过程中要在干燥条件下操作。洗涤，抽滤树脂，得到马来松香乙二醇丙烯酸酯和丙烯酸共聚物固定化淀粉酶。本发明与现有技术比较具有经下优点(1)马来松香乙二醇丙烯酸酯含三元环菲骨架，具有合适的刚性，得到的马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物具有较好的机械稳定性；(2)制得马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶是通过共价健固定，牢固；(3)原料易得，价格低廉，有应用前景，本发明固定化淀粉酶可用于催化淀粉水解生成糊精和还原糖，在食品、轻工和医药领域应用广泛。图1是马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物的红外光谱谱图；图2是马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物酰化树脂的红外光谱谱图；图3是马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶的红外光谱谱图。具体实施例方式马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶的确认1.马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶的制备1)用环己烷浸泡马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物2024h，过滤。放置在三颈瓶中，加入环己烷作溶剂。用恒压漏斗缓慢的向三颈瓶中加入S0C12，搅拌，约lh滴完。加热升温，温度控制在7580。C，回流58h。反应结束后，改蒸馏装置，蒸出多余的S0Cl2和环己烷。最后用环己烷洗涤酰化2)向盛放酰化树脂的三颈瓶中分别加入环己垸和淀粉酶溶液。用磁力搅拌搅动溶液5-12h，整个过程中要在干燥条件下操作。洗涤，抽滤树脂，树脂与淀粉酶进行？反应得到马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶，备用。马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物的制备方法，于2008年6月18日由广西民族大学申请的发明
专利名称：为"一种松香基功能高分子及其制备方法"中公开。2.马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶活性测定(i).指示剂溶液的配制:取1.0g3，5—二硝基水杨酸(C晶編与少量蒸馏水拌和，添加20ml2mol/L的氢氧化钠溶液后此酸便溶解。取30.0g四水酒石酸钾钠(C4H4KNa06.4H20)溶于此溶液，并用蒸馏水将此指示剂定容至100ml。(ii).麦芽糖标准曲线称取100mg—水麦芽糖(C^H^Ou.H20)，用蒸馏水定容至100ml。取7支25ml刻度试管编号，分别加入麦芽糖标准溶液(lmg/ml)0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.0ml，然后用吸管向各管加蒸馏水，使溶液达2ml，再各加3，5—二硝基水杨酸试剂2ml，沸水浴中准确煮沸5min，取出冷却。用蒸馏水稀释25ml，用分光光度计在波长520nm处进行比色，绘制横坐标为麦芽糖含量，纵坐标为吸光度的标准曲线。Y=ll.029x-0.0028(R2=0.9979)(iii).ra值为5.6的柠檬酸一柠檬酸钠缓冲溶液:A液:称取柠檬酸20.01g，溶解后稀释至1L。B液:称取拧檬酸钠29.41g，溶解后稀释至1L。取A液13.7ml与B液26.3ml混匀，即为PH值为5.6的缓冲溶液。(iv).淀粉酶溶液的配制:称取5g粗淀粉酶溶解在100ml蒸馏水中，放lh，期间要不断搅拌。用离心机离心，取上层清液。即为实验所用酶液。(v).淀粉酶活性测定采用3，5—二硝基水杨酸法游离酶活性测定在lmlPH值为5.6的拧檬酸一柠檬酸钠缓冲溶液中，加入lml酶溶液，于40(±0.5)。C恒温水浴中预热15min，加入1%淀粉溶液准确反应5min后，迅速加入4ml0.4mol/LNa0H溶液，令酶反应停止。从混合液中量取2.0ml溶液，加2.0ml3，5—二硝基水杨酸显色液，显色反应后在波长520nm处比色，测定麦芽糖的生成。用麦芽糖同步作标准曲线，以单位时间内转化麦芽糖的量表示酶的活性mg/ml.5min。固定化酶活性测定分别称取一定质量的固定化淀粉酶于带过滤膜的反器中，加入柠檬酸钠缓冲溶液，测定方法与游离酶相同，以单位质量的固定化酶在5分钟内水解淀粉生成麦芽糖量表示酶活性mg/g.5min。3.马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶的特点通过酶活性测定，固定化酶的活性为2030mg.g、5mirf1，重复使用13次后剩余活性不低于6mg.g—'.5min—'，相对保留活性不低于20%。4.图1、图2和图3是马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物、马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物酰化树脂、马来松香乙二醇丙烯酸酯_丙烯酸共聚物固定化淀粉酶的红外光谱谱图。马来松香乙二醇丙烯酸酯_丙烯酸共聚物酰化树脂在3500cm—i吸收峰消失，这是-OH的伸展振动，说明共聚物中COOH中的OH被取代，马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶的红外光谱谱图在3500cm—'吸收峰，说明共聚物中有新的-OH产生。5.马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶的元素分析测定马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物、马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶和淀粉酶三种物质中C、H、N元素的百分含量，结果见表l。表1马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶元素分析<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由表1可知，树脂中氮元素含量为0.184%，淀粉酶中氮元素的含量为4.018%，固定化淀粉酶中氮元素的含量为0.713%。据氮元素守恒，计算出l克树脂固定O.16g酶蛋白。说明树脂上已经固定上了酶分子。6.马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶的重复使用称取0.2g2040目的马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶，放入反应器中加入pH=5.6，柠檬酸盐缓冲溶液lml，1%的淀粉溶液lml。在T32t:按3，5—二硝基水杨酸法测定酶的活性，然后用蒸馏水洗涤固定化酶，再测定固定化酶的活性，以某一单位时间内生成的最大麦芽糖量活性表示为100，用第n次单位时间内生成的麦芽糖量与最大麦芽糖量的比值表示固定化酶的相对保留活力。表2马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶的重复使用<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>从表2可以看出，固定化酶重复使用了13次后相对保留活性还有20.81%，且在22。C、pH二5.6测得最大活性为25.57mg.g\5min—'。与其它固定化淀粉酶比较，它的重复使用次数多，酶活性较大，说明了此法制备的固定化酶，酶与载体结合较为牢固，不易脱落。7.马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶的用途马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶可用于催化淀粉水解生成糊精和还原糖，在食品、轻工和医药领域应用广泛。从以下实施例将进一步理解本发明表3本发明用仪器名称、规格、产地<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表4本发明制备方法用原材料名称、规格、产地<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例1称取15g马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物，用环己烷浸泡丙烯酸基树脂24h，过滤。放置在三颈瓶中，加入30ml环己烷。用恒压漏斗缓慢的向三颈瓶中加入15mlS0Cl2，搅拌，约lh滴完。加热升温，温度控制在758CTC，回流7h。反应结束后，改蒸馏装置，蒸出多余的S0Cl2和环己垸。最后每次用20ml环己烷洗涤酰化树脂3次。得到马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物酰化树脂。称取10g马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物酰化树脂，加入40ml环己烷和50ml3。/。的淀粉酶溶液。用磁力搅拌搅动溶液约10h，整个过程中要在干燥条件下操作。洗涤，抽滤树脂，得到马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶llg。经测定产品活性为25.6mg.g—、5mirf1，重复使用13次后剩余活性为5.3mg.g'.5min—、相对保留活性为20.7%。实施例2称取40g马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物，用环己烷浸泡丙烯酸基树脂约1天，过滤。放置在三颈瓶中，加入50ml环己垸。用恒压漏斗缓慢的向三颈瓶中加入25mlS0Cl2，搅拌，约1.5h滴完。加热升温，温度控制在7580°C，回流7h。反应结束后，改蒸馏装置，蒸出多余的S0Cl2和环己烷。最后每次用30ml环己烷洗涤酰化树脂3次。得到马来松香乙二醇丙烯酸酯_丙烯酸共聚物酰化树脂。称取20g马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物酰化树脂，加入40ml环己垸和60ml4Q/。的淀粉酶溶液。用磁力搅拌搅动溶液约12h，整个过程中要在干燥条件下操作。洗涤，抽滤树脂，得到马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶21.5g。经测定产品活性为23.5mg.g\5min—'，重复使用13次后剩余活性为5.6mg.g—\5min—\相对保留活性为23.8%。实施例3丙烯酸酯-丙烯酸共聚物，用环己烷浸泡丙烯酸基树脂约1天，过滤。放置在三颈瓶中，加入50ml环己烷。用恒压漏斗缓慢的向三颈瓶中加入35mlS0Cl2，搅拌，约2h滴完。加热升温，温度控制在758(TC，回流8h。反应结束后，改蒸馏装置，蒸出多余的S0Cl2和环己烷。最后每次用50ml环己烷洗涤酰化树脂3次。得到马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物酰化树脂。称取30g马来松香乙二醇丙烯酸酯_丙烯酸共聚物酰化树脂，加入50ml环己垸和70ml5y。的淀粉酶水溶液。用磁力搅拌搅动溶液约5h，整个过程中要在干燥条件下操作。洗涤，抽滤树脂，得到马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶34g。经测定产品活性为28.3mg.g、5min1，重复使用13次后剩余活性为6.7mg.g'.5min—、相对保留活性为23.7%。实施例4称取100g马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物，用环己烷浸泡丙烯酸基树脂约24h，过滤。放置在三颈瓶中，加入50ml环己烷。用恒压漏斗缓慢的向三颈瓶中加入60mlS0Cl2，搅拌，约2h滴完。加热升温，温度控制在758(TC，回流8h。反应结束后，改蒸馏装置，蒸出多余的S0Cl2和环己垸。最后每次用80ml环己烷洗涤酰化树脂3次。得到马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物酰化树脂。称取80g马入120ml环己烷和100ml5y。的淀粉酶水溶液。用磁力搅拌搅动溶液约12h来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物酰化树脂，力Q，整个过程中要在干燥条件下操作。洗涤，抽滤树脂，得到马来松香乙二醇丙烯酸酯_丙烯酸共聚物固定化淀粉酶83g。经测定产品活性为26.2mg.g—\5min—、重复使用13次后剩余活性为6.9mg.g—1.5min—、相对保留活性为26.3%。权利要求1.一种松香基功能高分子固定化淀粉酶，其特征是其名称为马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶，它的制备方法是1).以马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物为载体，首先用SOCl2将马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物酰化得到酰化树脂，再将马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物酰化树脂在环己烷和20ml1％的淀粉酶溶液中磁力搅拌5～12h，洗涤，过滤树脂，得到马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶，具体步骤如下A)用环己烷浸泡马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物20～24h，过滤，放置在三颈瓶中，加入环己烷作溶剂，共聚物与环己烷的质量比为1∶2～20，用恒压漏斗缓慢的向三颈瓶中加入SOCl2，共聚物与SOCl2质量比为1∶1～10，搅拌，约1h滴完，加热升温，温度控制在75～80℃，回流5～8h，反应结束后，改蒸馏装置，蒸出多余的SOCl2和环己烷，得到酰化树脂，最后用环己烷洗涤酰化树脂3次；B)向盛放酰化树脂的三颈瓶中分别加入环己烷和淀粉酶溶液，用磁力搅拌搅动溶液5～12h，整个过程中要在干燥条件下操作。洗涤，抽滤树脂，得到马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶；2)固定化淀粉酶的特点1克马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物以共价键固定0.1～0.2g淀粉酶，固定化酶的活性为20～30mg.g-1.5min-1，重复使用13次后剩余活性不低于6mg.g-1.5min-1，相对保留活性不低于20％。全文摘要本发明公开了一种松香基功能高分子固定化淀粉酶及其制备方法。它是由马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物与淀粉酶制备的马来松香乙二醇丙烯酸酯-丙烯酸共聚物固定化淀粉酶，其活性为20～30mg.g^-1.5min^-1，重复使用13次后剩余活性不低于6mg.g^-1.5min^-1，相对保留活性不低于20％。并公开了该固定化淀粉酶的制备方法。本发明固定化淀粉酶可用于催化淀粉水解生成糊精和还原糖，在食品、轻工和医药领域应用广泛。文档编号C12N11/08GK101319211SQ20081007362公开日2008年12月10日申请日期2008年6月18日优先权日2008年6月18日发明者刘祖广,卢建芳,姚兴东,李鹏飞,蓝虹云,雷福厚申请人:广西民族大学