用于分离基质血管组分的方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年7月10日提交的新加坡专利申请号2013053095的优先权的权 益，该新加坡专利申请的内容出于所有目的在此W引用方式整体并入。
技术领域
[0003] 本发明设及分子生物学领域。具体地说，本发明设及用于细胞分离中的设备。
【背景技术】
[0004] 干细胞是用于开发再生疗法的理想资源。通常，存在于人体中的干细胞数目有限， 并且完全优化其纯化和使用效率的方案仍在开发之中。脂肪组织已经日益被视为是对再生 医学潜在有益的干细胞的有前景的来源。除了成熟的脂肪细胞外，脂肪组织在基质血管组 分（SVF)中还含有相对丰富的祖细胞和间充质干细胞(MSC)群体(参见图1)。据估计，多达 1 %的基质血管组分细胞是间充质干细胞，其在本公开中也被称为脂肪来源的干细胞 (ASC)。运与在骨髓中仅占0.001-00.2%的间充质干细胞不同，骨髓被认为是成体干细胞的 标准中屯、（化日361·等人，2006)。
[0005] 考虑到新加坡和全世界肥胖症的上升，脂肪组织充当了可充足获取且相对容易获 得的独特的干细胞储库。脂肪抽吸术(一种去除过多脂肪组织的操作)是在发达国家进行的 最常见的整形外科手术之一。例如，已知2012年在美国有超过313,000例脂肪抽吸手术。另 夕h与需要W高密度(超过50,000个细胞/cm 2)进行初始平板接种的骨髓来源的间充质干细 胞不同，脂肪来源的干细胞可W低到3,000个细胞/cm2的密度接种，用于后续的培养生长 (Sotiropoulou，P.A.等人，2006)。脂肪来源的干细胞和骨髓来源的间充质干细胞是增殖性 的和多能的，具有分化成有限的细胞类型如脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞和肌细胞的能力。 另外，脂肪来源的干细胞被显示分化成将可用于组织和细胞替代疗法的膜内分泌细胞、神 经元、上皮和内皮(Cawthorn 等人，2012;Gimble 等人，2007W 及 0ng，W.K.和 S.Sugii，2013)。 由于脂肪来源的干细胞固有地分泌免疫调节因子、血管生成因子、抗细胞调亡因子和造血 因子，因此它们还可潜在地用于组织和创面修复。当前全世界使用基质血管组分细胞或脂 肪来源的干细胞在各种各样的疾病领域中正在进行超过80个临床试验化im等人，2014)。
[0006] 还证实脂肪来源的干细胞也可被理想地"再程序化"为诱导型多能干（iPS)细胞 (Sugii，S.等人，2011;Sugii，S.等人，2010)。脂肪来源的干细胞的再程序化效率大大高于 对于人成纤维细胞所报道的那些（高达100倍）并且可进行所述过程而无需动物饲养细胞 (W02011/032025A2)。通过建立生成来源于脂肪来源的干细胞的巧S细胞的无饲养细胞的、 无异源物的方案，运开辟了脂肪组织的应用的甚至更宽的可能性，尤其是在iPS细胞如胚胎 干细胞在理论上能够成为人或动物体的任何细胞类型时。
[0007] 尽管脂肪来源的干细胞有用于细胞替代和再生疗法的潜力，但加工和开发脂肪组 织来源的产品的技术仍处于早期阶段。典型的脂肪来源的干细胞分离方案设及通过胶原酶 消化分离的脂肪组织，之后离屯、W分开上浮的脂肪细胞和沉淀物组分中的含有脂肪来源的 干细胞的基质血管组分化im等人，2014)。几家公司也已开发加工脂肪组织和分离基质血管 组分的半自动化装置，所述装置设及具有一次性用品的封闭系统，其将通过脂肪抽吸收获 的脂肪组织消化成细胞，分离它们并将它们浓缩成用于立即递送到患者中的悬液化im等 人，2014)。当前，本领域内已知的多数方法主要使用用于消化的胶原酶或其它解离酶。然 而，使用诸如胶原酶的酶可能引起安全担忧，因为胶原酶通常是从革兰氏阳性细菌溶组织 梭状芽胞杆菌(Clostridium Μstol}fticum)产生的。使用酶还使得难W进行质量控制，因 为它具有保存期限且其活性存在批次间的变异性。另外，胶原酶消化要求长的加工时间（约 1小时）并且常常导致W细胞数目表示的产量的不一致性。考虑到使用了源于细菌的胶原 酶，所述方法还需要进行充分洗涂，运导致分离或回收过程所设及的总的时间和成本增加。 另外，本领域内已知的方法还需要技术人员的大量手工处置，运增加了污染风险。
[0008] 考虑到本领域内所遇到的问题，存在着对提供用于从样品回收基质血管组分的替 代方法的需要。
【发明内容】
[0009] 在一个方面，提供用于从样品回收基质血管组分的方法。在一个示例中，所述方法 包括提供能够将样品破碎成单细胞悬液、同时维持完整的基质血管组分细胞的细胞结构的 机械力，其中所述机械力是切碎和/或均质化。
[0010] 在另一方面，提供治疗需要细胞疗法的受试者的方法。在一个示例中，该方面的治 疗受试者的方法包括向有此需要的受试者施用由本公开的方法获得的基质血管组分的细 胞。
[0011] 在再一方面，提供治疗需要细胞疗法的受试者的方法。在一个示例中，该方面的治 疗受试者的方法包括向需要细胞疗法的受试者施用由本公开的方法获得的脂肪来源的干 细胞。
【附图说明】
[0012] 当结合非限制实施例和附图考虑时，参考【具体实施方式】将更好地理解本发明，其 中：
[0013] 图1显示可在基质血管组分中发现的细胞类型的图解说明。图1提供可通过本公开 的方法回收的细胞类型的示意图。
[0014] 图2显示使用本领域内已知的典型酶促方法分离并且培养W富集脂肪来源的干细 胞后的细胞生长和形态的显微镜图像。
[0015] 图3显示如在培养的第4天通过本领域内已知的方法（即通过酶方法)获得的分离 的细胞样品的显微镜图像(在培养的第4天；WlOOx放大率）。
[0016] 图4显示在37°C解育1小时、之后均质化65秒后的细胞样品的显微镜图像(在培养 的第4天；WlOOx放大率）。图4显示使用本公开的一种方法回收的细胞的细胞形态的显微镜 图像。
[0017] 图5显示均质化65秒后的分离的细胞样品的显微镜图像(在培养的第4天；WlOOx 放大率）。图5显示使用本公开的一种方法回收的细胞的细胞形态的显微镜图像。
[0018] 图6显示切碎5分钟后的分离的细胞样品的显微镜图像(在培养的第4天；WlOOx放 大率）。图6显示使用本公开的一种方法回收的细胞的细胞形态的显微镜图像。
[0019] 图7显示在37°C预处理1小时、之后切碎5分钟后的分离的细胞样品的显微镜图像 (在培养的第4天；WlOOx放大率）。图7显示使用本公开的一种方法回收的细胞的细胞形态 的显微镜图像。
[0020] 图8显示描绘在进行本公开的方法之一（即切碎)后获得的活细胞计数的数目的条 形图。具体地说，条形图显示每5ml分离的脂肪组织的活细胞计数(在培养的第7天）。切碎组 的测量结果是Ξ个样品的平均值。代表至少10次独立实验的数据。使用本领域内已知的方 法获得阳性对照，所述方法使用酶促消化;将阴性对照切碎10秒。
[0021] 图9显示描绘在与脂解剂（异丙肾上腺素和异下基甲基黄嚷岭-IBMX)组合进行本 公开的方法之一后获得的活细胞计数的数目的条形图。具体地说，条形图显示每5ml分离的 脂肪组织的活细胞计数(在培养的第7天）。试剂组的测量结果是两个样品的平均值。代表至 少5次独立实验的数据。使用本领域内已知的方法获得阳性对照，所述方法使用酶促消化； 将阴性对照切碎30秒。
[0022] 图10显示描绘在进行本公开的方法之一（即切碎10秒，之后均质化65秒)后获得的 活细胞计数的数目的条形图。均质化组的测量结果是Ξ个样品的平均值。代表至少7次独立 实验的数据。使用本领域内已知的方法获得阳性对照，所述方法使用酶促消化;将阴性对照 切碎10秒。
[0023] 附表简述
[0024] 当结合非限制实施例和附表考虑时，参考【具体实施方式】将更好地理解本发明，其 中：
[0025] 表1显示使用本公开的方法回收的脂肪来源的干细胞的百分比产率。
[0026] 表2显示使用本公开的方法回收的脂肪来源的干细胞的百分比产率，其中所述方 法进一步包括使用如本文所述的非酶促试剂。
[0027] 表3显示使用本公开的方法回收的脂肪来源的干细胞的百分比产率，其中所述方 法进一步包括其它分离方法的组合。
【具体实施方式】
[0028] 考虑到源于基质血管组分的脂肪来源的干细胞可在医学中提供的巨大可能性，需 要具有用于回收基质血管组分的方法。因此，在一个方面，提供用于从样品回收基质血管组 分的替代方法。如本文所用的，短语"基质血管组分"、"基质血管组分的细胞"或"基质血管 组分细胞"是指源于脂肪组织的血管（或设及携带血液的脉管）成分的细胞组分，其包含不 同的细胞类型，包括但不限于脂肪来源的干细胞(例如间充质干细胞）、间充质细胞、造血细 胞、造血干细胞/祖细胞、软骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、内皮前体细胞或祖细胞、内皮细 胞、平滑肌细胞、周细胞、CD34+细胞(通常在厮带中发现）、CD29+细胞、CD 166+细胞、Thy-1+ 或CD90+干细胞、CD44+细胞、免疫细胞如单核细胞、白细胞、淋己细胞、B细胞和T细胞、NK细 胞、巨隧细胞、树突细胞、嗜中性白细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、粒细 胞、红细胞、巨核细胞、血小板等，包括表达一种或多种W下标志物的免疫细胞和其它细胞： CD3、CD 14 (巨隧细胞标志物）、CD 19、CD20 (B细胞标志物）、CD29 (整联蛋白单元）、CD31 (内皮 细胞、血小板、巨隧细胞、树突细胞、粒细胞、T/NK细胞、淋己细胞、巨核细胞、破骨细胞、中性 粒细胞等）、CD44(透明质酸受体）、CD45(B细胞和Τ细胞标志物）、CD56、CD73(淋己细胞分化 标志物)和CD105。此外，基质血管组分还可包括表达本公开中所公开的任一标志物或其任 意组合的细胞。如本文和本领域内所用的，短语"前体细胞"、"祖细胞"和"干细胞"可互换使 用，并且是指多能或谱系未定（lineage-uncommitted)的祖细胞，所述细胞潜在能够进行无 限次数的有丝分裂W自我更新或W产生将分化成期望的细胞类型的后代细胞。与多能干细 胞不同，谱系未定的祖细胞通常被认为不能产生大量表型上彼此不同的细胞类型。
[0029] 如本文所用的，术语"回收"、"分离"或"收获"是指从组织的通常与组织的期望组 分或成分缔合的周围基质提取所述组织的所述组分或成分的过程。在一个示例中，术语"回 收"、"分离"或"收获"是指从脂肪组织提取基质血管组分的动作。在另一示例中，术语"回 收"、"分离"或"收获"是指从如由本公开的方法获得的基质血管组分提取脂肪来源的干细 胞的动作。
[0030] 由于用于回收基质血管组分的已知方法通常设及解离酶如胶原酶，因此本公开提 供用于从样品回收基质血管组分的非酶促方法。也就是说，如本文所述的方法可不包括酶 消化，运与本领域内已知的方法不同，本领域内已知的方法包括在进行回收基质血管组分 的方法之前或当时将酶添加到样品中的步骤。换句话说，如本文所述的方法可不包括外源 酶消化。如本文所用的，术语"酶"是指能够消化将细胞结合在一起W形成组织的细胞外基 质的生物分子。在本公开中，所述酶可W是促进对细胞与细胞的接触的消化或解离的解离 酶，如可促进组织消化成单细胞悬液的胶原酶、膜蛋白酶等。在本公开的方法中排除酶是为 了确保回收基质血管组分和具有临床等级的最终脂肪来源的干细胞并且具有最低污染风 险。如本文所用的，术语"消化(digestion)"、"消化(digesting)