专利名称：一种多肽血管组织工程基质材料及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物医学材料技术领域，具体地涉及一种合成作为血管组织工程基质材料的 多肽，本发明还涉及此多肽的应用。
背景技术：
组织工程中最具挑战性的一个课题是移植物的血管生长和血液供给，而在组织工程血 管的研究中，内皮细胞的黏附和生长是最困难的问题。内皮细胞对于血管组织非常重要， 它完成对营养物质和代谢废物的转运，维持血液成份的稳定，防止异常凝血，并对破坏的 内皮进行修复。
带有内皮细胞的组织工程化血管还有助于提高血液和组织相容性，是当前组织工程研 究的重点。在血管移植物腔内衬附单层血管内皮细胞，就能够将血液和血管壁的生物材料 隔离开，促进血液动力学，防止免疫反应和血栓。然而，由于动脉血管腔内急速的血流运 动，内皮细胞难以锚定在生物材料的表面，使得静态培养下形成的内皮细胞单层一旦移植 入体内后很快被血流破坏。因此必须开发新的生物材料，使组织工程血管衬附的内皮细胞 有效黏附并较快生长。
为了达到上述目的，不同的生物材料已被开发和尝试。胶原蛋白、纤维粘连蛋白、体 外粘连蛋白等都未达到预期效果。 一种经过设计的自组装多肽基质具备一定的细胞黏附功
能。这种多肽能够通过e -片层结构相互作用形成纳米纤维，能够用于生物材料的表面修饰。
它对骨细胞、神经细胞等具有较高的黏附能力(Genove E. The effect of fimctionalized self-assembling peptide scaffolds on human aortic endothelial cell function. Biomaterials 2005;26:3341-3351.)。然而，这种多肽的P-片层结合能力较低，导致基质材料的强度不甚 满意，经过一定的功能基团修饰后就失去了形成纳米纤维的能力。
发明内容
本发明的目的在于克服目前血管组织工程研究的难题，提供一种合成多肽，作为血管 组织工程基质材料。
本发明的另一个目的在于提供上述多肽化合物用于生物材料的表面修饰。 朊蛋白是自然界中存在的、能够形成较强e-片层结构的多肽。其中酵母朊蛋白Sup35p
具有特定的自组装序列，能够携带其他结构域共同形成e-片层结构。这种高效组装、能够 携带其他功能基团的特性非常符合组织工程基质材料的需要。本发明设计了相互重叠的10氨基酸序列多肽覆盖Sup35p全蛋白，并分别合成和测试每条多肽，以筛选Sup35p中的 自组装多肽序列。实验筛选出式SEQIDNO.l、 SEQIDN0.2、 SEQ ID N0.3所示的多肽序 列，能够高效组装成多孔、富含水的组织工程基质材料。由于酵母的Sup35p蛋白与哺乳 动物(包括人类)并无同源性，因此这种蛋白对人类没有感染性危害。
因此，本发明提供的合成多肽，其氨基酸序列如下SEQIDNO.l、 SEQIDN0.2、 SEQ IDN0.3，其中，SEQ ID N0.2为SEQIDNO.l前10个氨基酸组成的片段，SEQIDNO.3 为SEQ IDNO.l最后10个氨基酸组成的片断。 这些多肽序列中
Tyr表示英文名称为threonine,中文名称为苏氨酸的氨基酸的相应残基； Asn表示英文名称为asparagine，中文名称为天冬酰胺的氨基酸的相应残基； Leu表示英文名称为leucine,中文名称为苏氨酸的氨基酸的相应残基； Gin表示英文名称为Gliitamine，中文名称为谷氨酰胺的氨基酸的相应残基； Gly表示英文名称为glycine,中文名称为甘氨酸的氨基酸的相应残基； Ala表示英文名称为alanine,中文名称为丙氨酸的氨基酸的相应残基； Phe表示英文名称为phenylalanine,中文名称为苏氨酸的氨基酸的相应残基。 本发明所述的多肽序列，还包括所述序列的其类似物和同族物以及他们的衍生序列， 如反向序列和反手链。还包括与这些序列具有至少有90%相同性的氨基酸序列。
本发明所涉及的多肽序列，源于酵母朊蛋白Sup35p的自组装结构域，能够相互作用组 装成为纳米纤维及多孔富含水的基质材料，对血管内皮细胞有较强的黏附作用，能够促进 其生长并形成完全的单层结构。
本发明的有益效果本发明的合成多肽可用于促进血管内皮细胞的黏附和生长，对血 管组织工程研究有着重要的作用。这种多肽材料克服了现有血管组织工程支架材料的多种 问题①脱细胞血管基质来源有限、存在生物源污染和质量控制问题，可能引发医源性污 染和感染；②高分子聚合材料降解后生物利用率低或对生物体有害，如聚乳酸等分解后会 破坏酸碱平衡环境；③生物提取物如胶原和壳聚糖等对血管内皮细胞黏附力低，难以形成 具备抗凝和分泌功能的组织工程血管。本发明多肽血管组织工程基质材料具有以下优势-①纯度高，适合工业生产，能够避免生物源性污染和感染；②从储存状态达到功能状态时 间短、操作简单。多肽由干粉溶解于磷酸盐缓冲液后即开始自组装；③形成的基质材料富 水、多孔、强韧性高，对血管内皮细胞黏附性能较好，能够携带分子量较大的功能基团； ④降解完全，生物利用度高。多肽降解后成为氨基酸，可被机体吸收利用；(D很少引起毒 性反应和免疫反应等优点。
图1为电镜下观察到的多肽形成了多孔网状结构，平均孔径为7.5纳米。其中，(a)多 肽溶解后24小时电镜观察；(b).多肽溶解后36小时电镜观察)。
图2为多肽修饰的(a)培养皿与胶原蛋白修饰的(b)培养皿上血管内皮细胞的生长 情况。
图3用多肽修饰的胶原管状支架与未修饰的支架形成细胞数(a)与一氧化氮分泌水 平(b)的对比。
具体实施例方式
实施例1多孔富含水基质的形成
将多肽(SEQ IDNO.l、 SEQ IDN0.2或SEQ IDN0.3)以0.75%的浓度溶解于磷酸盐缓 冲液(pH=7.5)中，至于25'C下36小时，可见胶状物质形成。电镜下观察为多孔网状结 构，平均孔径为7.5纳米(如图1) 实施例2培养皿的表面修饰
经合成和纯化的多肽(SEQ ID NO.l 、 SEQ ID N0.2、 SEQ ID N0.3),以0.75%的浓度溶 解于磷酸盐缓冲液(pH=7.5)中，震荡10秒钟，均匀浸润培养皿(未进行过表面修饰的) 内表面。在室温内放置36小时后，用磷酸盐缓冲液冲洗2次。以含有10%胎牛血清的DMEM 培养基接种血管内皮细胞，培养48小时后相差显微镜下观察生长密度。多肽修饰的培养 皿内血管内皮细胞连续性达到95%，贴壁良好，呈多角形。对照组的胶原修饰的培养皿细 胞连续性为50%，细胞呈椭圆形(如图2)。 实施例3管状胶原支架的内表面修饰
利用模具制作内径6mm，外径9mm的管状胶原支架。向腔内注入溶解后6小时的多 肽，并以12周/小时的速率旋转孵育24小时，形成内修饰层。将血管内皮细胞以 9xl0、ells/cr^的密度接种于管腔内，6周/小时旋转培养6小时，然后置入生物反应器中， 使管壁形变5%，继续培养48小时，检测细胞活力和一氧化氮分泌情况。可见经过多肽修 饰的胶原支架比未经修饰的支架形成更高的细胞活力和一氧化氮分泌水平(见图3)。图3 显示多肽基质内衬的细胞数约为141,300个/平方厘米，高于胶原内衬的39,600个/平方厘 米；而多肽内衬组的血管内皮细胞分泌氧化氮水平约为61纳摩尔/百万细胞，亦显著高于 对照组的12纳摩尔/百万细胞。序列表SEQIDNO.l:
NH2 - TyrlAsn - Asn - Asn - Leu - Gin - Gly - Tyr - Gin - Ala - Gly - : he - Gin —门OOH
SEQIDNP2:
NH2 - Tyr-Asn - Asn - Asn - Leu - Gin - Gly - Tyr - Gin - Ala— COOH
SEQ ID NO.3:
NH2 - Asn - Leu - Gin - Gly - Tyr - Gin - Ala - Gly - Phe - Gin - 80H
权利要求
1、 一种作为血管组织工程基质材料的多肽，其特征在于具有SEQ ID NO.1、SEQID NO.2、SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，及其类似物和衍生序列。
2、 根据权利要求1所述的多肽，其特征在于具有所述多肽、类似物或衍生物的氨 基酸序列至少有90%的相同性的氨基酸序列。
3、 如权利要求1或2所述的多肽作为血管组织工程基质材料在生物材料表面修饰 中的应用。
全文摘要
本发明属于生物医学材料技术领域，具体为一种多肽血管组织工程基质材料及其应用。本发明提供的多肽序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3，以及它们的类似物和衍生物等。该多肽可以自组装形成多孔基质，促进血管内皮细胞黏附和增殖，因此可以作为血管组织工程基质材料，可用于生物材料的表面修饰等。这种多肽材料克服了现有血管组织工程支架材料的多种问题，具有①纯度高，适合工业生产；②从储存状态达到功能状态时间短、操作简单；③形成的基质材料富水、多孔、强韧性比较高，对血管内皮细胞黏附性能较好；④降解完全，生物利用度高；⑤很少引起毒性反应和免疫反应等优点。
文档编号A61L27/22GK101284149SQ200810038570
公开日2008年10月15日 申请日期2008年6月5日 优先权日2008年6月5日
发明者杰 许 申请人:上海市第十人民医院