一种经卵磷脂处理的脂肪基质血管组分制备技术的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种经卵磷脂处理的脂肪基质血管组分制备技术，包括从腹部抽取脂肪组织，经卵磷脂处理，离心过滤后即可获得基质血管组分。本发明技术简单易行，能更有效地从脂肪组织中获取富含各种类型干细胞的基质血管组分，同时有效的保护各组分干细胞的活性和功能，并可直接安全的应用于临床治疗。
【专利说明】一种经卵磷脂处理的脂肪基质血管组分制备技术
【技术领域】
[0001]本发明属生物【技术领域】，具体涉及一种适用于临床的经卵磷脂处理的脂肪基质血管组分制备技术。
【背景技术】
[0002]脂肪基质血管组分(SVF)是指脂肪组织去除成熟脂肪细胞后，所获得的具有干细胞特性的基质细胞，包括脂肪前体细胞(MUSE CELL)、间充质干细胞(MSC)、造血干(祖)细胞(HSC)、内皮祖细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等，是一组混合细胞群体。
[0003]SVF可以通过分化为内皮细胞或分泌促血管生成因子如VEGF等，促进新生血管生成，防止脂肪细胞凋亡，提高脂肪组织存活，有利于自体脂肪移植。以SVF作为三维生物支架，可以更大程度还原细胞生长的微环境，这种微环境有利于SVF与脂肪细胞各自释放细胞因子，如VEGF、HGF、SDF-1等，其协同发挥促血管生成和促细胞再生作用。SVF中的巨噬细胞通过分泌高水平的抗炎细胞因子IL-4，IL-1OjTGF-B等，达到抗炎症作用。以往研究证实，SVF中的MSCs和Treg细胞均具有免疫抑制作用，因此认为，SVF可用于自身免疫疾病治疗，如多发性硬化、风湿性关节病等。多发性硬化症(MS)是免疫系统攻击中枢神经系统而导致脱髓鞘的一种自身免疫疾病，Riordan等采用SVF治疗三例多发性硬化病人，其症状得到有效改善。
[0004]目前常用的脂肪干细胞分离培养方法是从脂肪组织分离获取细胞，大多采用不同浓度胶原酶法消化的方式，获得细胞，用PBS洗涤除去红细胞等成熟细胞后，采用含10%胎牛血清的培养基进行继代培养(专利:200810001107.2 ;201010568873.4 ;201010580537.1 ；201210018269.3 ；201010120944.4)。含 10% 胎牛血清的培养基虽可促进脂肪干细胞的增殖，但难以维持其未分化状态，使得继代培养的脂肪干细胞容易老化；而且这种酶消化经贴壁培养的方式获得的脂肪干细胞主要是间充质干细胞，只是脂肪丰富干细胞组分中的一种。研究者已经从脂肪上发现了亚全能干细胞，是介于全能的胚胎干细胞与成体干细胞(间充质干细胞)的亚全能干细胞。而经过目前常规的培养方法培养后，这些亚全能干细胞就会分化成成熟的干细胞，而逐渐散失其干性，失去了其更优越的治疗能力。
[0005]现有技术方法主要存在的问题:1)使用胶原酶， 胰蛋白酶等消化酶消化，对细胞活性等影响较大。2)这些消化酶需要使用血清来终止其活性(如胎牛血清)，这容易造成一些过敏反应的发生。3)获得的基质组分中残留的消化酶，并不直接适用于临床治疗。4)经培养后更多种类的干细胞失去了其干性，失去了更优越的治疗能力。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是为了更有效地从脂肪组织中获取富含各种类型干细胞的基质血管组分，同时有效的保护各组分干细胞的活性和功能，并可直接安全的应用于临床治疗。
[0007]本发明的技术方案如下:
一种经卵磷脂处理的脂肪基质血管组分制备技术，其特征在于:具体步骤如下:1)无菌从腹部抽取脂肪组织，加入riOOmg/ml卵磷脂IO-1OOml，剧烈震荡5_15min；
2)100目筛网加压滤过，去除残余组织；
3)收集细胞悬液，1800rpm离心5_10分钟，去除上清中成熟脂肪细胞；
4)加l~100mg/ml入卵磷脂IO-1OOml,重悬沉淀基质血管组分；
5)200目滤网过滤，收集过滤物即为具备基质血管组分。
[0008]其中，所述的卵磷脂的优选浓度为12mg/ml。
[0009]获得的基质血管组分为混合干细胞群，含有亚全能干细胞，间充质干细胞，造血干细胞，血管前体干细胞，内皮祖细胞，脂肪干细胞。
[0010]所述的混合干细胞群表达或部分表达SSEA-3，⑶117，CD34,⑶29，⑶31，⑶90，CD73, CD105, CD271。
[0011]本发明的显著优点:
I)本发明使用的卵磷脂是临床批准使用的药物，是静脉营养的组成部分之一，为机体提供能量和必需脂肪酸。可直接用安全的用于临床治疗。
[0012]2)本发明使用的卵磷脂是构成细胞生物膜(细胞膜、核膜、线粒体膜)脂双层的基本骨架，还是构成各种脂蛋白的主要组成成分，能够保护获得的基质血管组分干细胞群的活性和功能。
[0013]3)本发明不使用胶`原酶或胰蛋白酶等对细胞作用比较强烈的消化酶，不需要使用胎牛血清等来终止消化，获得的基质血管组分不残留胶原酶、血清等对病人治疗不利的成分。
[0014]4)本发明技术简单，获得的基质血管组分含有更丰富的干细胞群。
[0015]
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1:基质血管组分的流式细胞仪检测结果
图2:获得的含有造血干细胞的组分在流式细胞仪中的检测结果图3:获得的含有丰富的间充质干细胞的组分在流式细胞仪中的检测结果图4:获得的含有血管内皮组细胞的组分在流式细胞仪中的检测结果图5:获得的含有少量表达胚胎干细胞标志物的亚全能干细胞的基质血管组分在流式细胞仪中的检测结果
图6:培养的基质血管组分
【具体实施方式】:
以下是本发明的具体实施例，进一步描述本发明，但是本发明不仅限于此。
[0017]实施例1:
1.试剂来源:卵磷脂为临床批准使用药品，含脂肪乳。生理盐水为临床使用注射用生理盐水。
[0018]2.实验步骤如下:
1)利多卡因皮下局部麻醉，注射器无菌从腹部抽取脂肪组织20ml；
2)加入12mg/mL卵磷脂20ml,剧烈震荡15min ；3)加压滤过100目滤网，去除残余组织；
4)收集细胞悬液，1800rpm离心10分钟，弃去上清中成熟脂肪细胞；
5)加入生理盐水50ml，离心洗涤；
6)加入卵磷脂30ml重悬沉淀基质血管组分；
7)200目(75 iim)滤网过滤；
8)收集过滤物即为基质血管组分。
[0019]9 )制备的基质血管组分可直接用于局部注射、静脉注射等治疗。
[0020]3.脂肪基质血管组分流式细胞鉴定
获得的基质血管组分，1800rpm离心IOmin,弃去上清，加入PBS, 1800rpm离心洗涤2次，弃上清，加入2mlPBS重悬，分成若干管，分别加SSEA-3，⑶117，⑶34，⑶29，CD31，CD38 CD90，CD73，CD105，CD271及同型对照抗体，室温避光孵育30min，加PBS离心洗涤2次，流式细胞仪进行分析。如图1所示，所获得的基质血管组分为混合细胞群。含有不同时期的造血干细胞和血细胞(表达造血干细胞特异标志⑶34，⑶45)，如图2所示，阳性率分别为⑶34 8.559%,⑶45 42.1% ;含有约13%_15%的间充质干细胞，表达间充质干细胞的标志如图3所示，CD29 30.356%%，CD73 13.596%, CD105 14.31% (间充质干细胞没有特异性标志，根据国际干细胞协会制定的标准为表达CD73，CD105,不表达造血干细胞标志的一群细胞);含有血管内皮祖细胞，表达血管内皮细胞标志⑶31，阳性率为24.4% (图4);以及含有少量的亚全能干细胞(图 5)，表达胚胎干细胞标志SSEA-3，阳性率约为0.647%，表达神经干细胞营养受体⑶271，阳性率约为4.541%,干细胞生长因子受体⑶117，阳性率为
2.799%。
[0021]4.脂肪基质血管组分中脂肪干细胞培养
获得的基质血管组分，1800rpm离心lOmin，弃去上清，加DMEM或a MEM培养基重悬细胞，离心洗涤2次，加入完全培养基(含血清DMEM或a MEM或无血清培养基)，37 V，5% CO2培养箱培养，每3-4天换液一次，7-14天加胰蛋白酶消化传代，可获得脂肪干细胞。如图6所示。
【权利要求】
1.一种经卵磷脂处理的脂肪基质血管组分制备技术，其特征在于:具体步骤如下: 1)无菌从腹部抽取脂肪组织，加入1~1OOmg/ml卵磷脂1O-1OOml，剧烈震荡5-15min； 2)100目筛网加压滤过，去除残余组织； 3)收集细胞悬液，1800rpm离心5-10分钟，去除上清中成熟脂肪细胞； 4)加入l~100mg/ml卵磷脂1O-1OOml,重悬沉淀基质血管组分； 5)200目滤网过滤，收集过滤物即为基质血管组分。
2.如权利要求1所述的一种经卵磷脂处理的脂肪基质血管组分制备技术，其特征在于:所述的卵磷脂的优选浓度为12mg/ml。
3.如权利要求1所述的一种经卵磷脂处理的脂肪基质血管组分制备技术，其特征在于:获得的基质血管组分为混合干细胞群，含有亚全能干细胞，间充质干细胞，造血干细胞，血管前体干细胞，内皮祖细胞，脂肪干细胞。
4.如权利要求3所述的基质血管组分，其特征在于:所述的混合干细胞群表达或部分表达 SSEA-3, CD117, CD34, CD29, CD31, CD90, CD73, CD105, CD271。
【文档编号】C12N5/074GK103484427SQ201310379606
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年8月28日 优先权日:2013年8月28日
【发明者】谭建明, 陈津, 黄梁浒, 徐秀敏 申请人:中国人民解放军南京军区福州总医院