检测肠球菌耐药性的组合物及方法
【专利摘要】本发明涉及用于检测肠球菌耐药性的组合物和方法，其特征在于利用一对或多对特异性引物和多重PCR方法对肠球菌耐药性进行检测，其中组合物包含以下寡核苷酸引物对：肠球菌16s?RNA特异性引物对：SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2；以及以下耐药基因特异性引物对中的一对或多对：aac-aph特异性引物对：SEQ?ID?No.3和SEQ?ID?No.4，tetM特异性引物对：SEQ?ID?No.5和SEQ?ID?No.6，ermB特异性引物对：SEQ?ID?No.7和SEQ?ID?No.8，TEM特异性引物对：SEQ?ID?No.9和SEQ?ID?No.10以及aad特异性引物对：SEQ?ID?No.11和SEQ?ID?No.12。使用本发明，能够简便、快速、灵敏度高且特异性强地测定食品中肠球菌的耐药性。
【专利说明】检测肠球菌耐药性的组合物及方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及用于检测肠球菌耐药性的组合物，使用所述组合物进行的PCR检测方法以及该组合物在实际样品检测中的应用。 【背景技术】
[0002]肠球菌(Enterococcus)属链球菌科，是人类和动物肠道正常菌群的一部分。肠球菌是圆形或椭圆形、呈链状排列的革兰阳性球菌，无芽胞，无鞭毛，为需氧或兼性厌氧菌。该菌对营养要求较高，在含有血清的培养基上生长良好。在血平板上经37°C培养18小时后，可形成灰白色、不透明、表面光滑、直径0.5~Imm大小的圆形菌落，不同的菌株表现为不同的溶血现象。
[0003]根据其利用糖类的特征可将肠球菌分为3组:第一组以鸟肠球菌(E.avium)为代表，包括灰黄色肠球菌(E.givusl)、病臭肠球菌(E.malodoratus)、淡黄色肠球菌(E.paenlls)等；第二组以粪肠球菌(E.faecalis)为代表,包括尿肠球菌(E.faecium)、血过氧化物肠球菌(E.haemoperoxidus)、铅黄肠球菌(E.casselifIavus)、鹁鸡肠球菌(E.gal I inarum)等；第三组以坚韧肠球菌(E.durans)为代表，包括小肠肠球菌(E.dispar)、鼠肠球菌(E.ratti)、绒毛肠球菌(E.villorum)、殊异肠球菌(E.dispar)等，其中对人类致病的主要为粪肠球菌和尿肠球菌。
[0004]肠球菌存在于人类和动物的口腔、阴道，是肠道的正常菌群之一，且广泛分布于自然界，通常不引起发病，是一种重要的条件致病菌。近些年，随着存在于食品中的肠球菌成为人们食物中毒的主要原因，才引起广泛关注。随着肠球菌耐药菌株的日益增加，感染后治疗也越来越困难。不同的肠球菌耐药性不同所用的抗生素也随之不同，故耐药基因的检测就显得尤为重要。
[0005]面对日趋严重的细菌耐药问题，为了维护人们的正常生活及控制肠球菌病，国内外许多学者采用了多种手段对肠球菌耐药基因进行研究，常用的方法有药敏试验、PCR、荧光PCR、K-B法等。由于肠球菌中含有的耐药基因易受种及来源等因素的影响，成分相对复杂；尤其是近年来随着抗菌药物的广泛应用，使许多单一检测耐药基因的传统方法不再快速、有效。
[0006]现代生物技术以其方便、准确、迅速、简洁的特点，从基因水平分析菌株的耐药性和耐药机制，灵敏度更高、特异性更强，其结果为证明菌株的耐药性提供了真实、可靠的依据，给菌种鉴别、菌种耐药性研究等菌株相关研究注入了新鲜血液，已成为近年来世界各国的许多机构和学者致力的研究方向。
[0007]聚合酶链式反应(PCR)是通过扩增待测样品的DNA，使其能够从最初的微小数量增至足以达到检测限量的巨大数量。PCR方法已用于多种多样的基因检测中。近几年，在分子生物学研究中，利用定量PCR对基因表达结果进行检测，获得了应用。由于其大大提高了检测的灵敏度、特异性和精确性并能有效地减少实验过程中产生污染的危险，目前已广泛应用于各个领域。[0008]多重PCR(multiplex PCR)是在同一 PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR反应相同。其特点有:①高效性，在同一 PCR反应管内同时检出多种病原微生物，或对有多个型别的目的基因进行分型，特别是用一滴血就可检测多种病原体；②系统性，多重PCR很适宜于成组病原体的检测；③经济简便性，多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支。
[0009]目前，国内外少见报道能快速、简单、特异且灵敏地检测肠球菌对抗生素耐药性的方法。
[0010]因此，本领域需要一种快速、特异性好、灵敏度高的肠球菌耐药性检测方法。
【发明内容】
[0011]本发明的目的在于，提供检测肠球菌耐药性的组合物。
[0012]本发明的另一目的在于，提供检测肠球菌特耐药性的多重PCR检测方法。
[0013]针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案。
[0014]一方面，本发明提供了利用多重PCR方法检测肠球菌耐药性的组合物，所述组合物包含针对肠球菌特异性16S rRNA的特异性引物对以及针对以下五种耐药基因中一种或多种的寡核苷酸引物对，所述引物对针对通过GenBank获得的肠球菌五种耐药基因:氨基糖昔类耐药基因 aac-aph (aminoglycoside acetyltransferases-aminoglycosidephosphotransferases)、四环素耐药基因(tetM)、氛基糖昔类耐药基因aad(alcoholacetaldehydedehydrogenase)、0内酰胺类耐药基因(TEM)、红霉素耐药基因ermB。
[0015]在一个实施方式`中，针对肠球菌特异性16S rRNA的特异性引物对为:
[0016]16S rRNA-F:GTGTCGCTGATGGATGG (SEQ ID N0.1)
[0017]16S rRNA-R:GCAAGCCGAACTGAGAGA (SEQ ID N0.2),
[0018]扩增产物为1096bp ；
[0019]氨基糖苷类耐药基因aac-aph的特异性引物对为:
[0020]aac-aph-F:ACAGAGCCTTGGGAAGATGA (SEQ ID N0.3)
[0021]aac-aph-R:CTCCAATAATTTGGCTCTCCT(SEQ ID N0.4),
[0022]扩增产物为176bp ；
[0023]四环素耐药基因tetM的特异性引物对为:
[0024]tetM-F:TGAAAATCCGCACCCTCTAC (SEQ ID N0.5)
[0025]tetM-R:ACTGCATTCCACTTCCCAAC(SEQ ID N0.6)，
[0026]扩增产物为362bp ；
[0027]红霉素耐药基因ermB的特异性引物对为:
[0028]ermB-F:AAAGGGCATTTAACGACGAA (SEQ ID N0.7)
[0029]ermB-R:CTGTGGTATGGCGGGTAAGT(SEQ ID N0.8),
[0030]扩增产物为424bp ；
[0031]P内酰胺类耐药基因TEM的特异性引物对为:
[0032]TEM-F:TTTGCCTTCCTGTTTTTGCT (SEQ ID N0.9)
[0033]TEM-R:TTGCCGGGAAGCTAGAGTAA(SEQ ID N0.10)，[0034]扩增产物为560bp ；
[0035]氨基糖苷类耐药基因aad的特异性引物对为:
[0036]aad-F:TGACCCTGGTATGGTCCAAT(SEQ ID N0.11)
[0037]aad-R:ATCCCGGTATCTGCTGTGAC(SEQ ID N0.12)，
[0038]扩增产物为50Ibp。
[0039]一方面，本发明提供了检测肠球菌耐药性的试剂盒，所述试剂盒包括本发明用于检测肠球菌耐药性的组合物。
[0040] 另一方面，本发明提供了检测肠球菌耐药性的方法，所述方法包括使用本发明用于检测肠球菌耐药性的组合物或试剂盒进行多重PCR扩增的步骤。
[0041]多重PCR (multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定和病原微生物某些遗传病及癌基因的分型鉴定。多重PCR是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR相同。因此可以同时检测整个多重PCR反应过程中所有引物和DNA的结合情况，并最终检测出待测样品的耐药基因，从而可检测待测肠球菌的耐药性。
[0042]在一个实施方式中，多重PCR反应体系(25iiL)包含:10XPCR缓冲液(含Mg2+)，2.L ;dNTPs (2.5mol/ii L)，2ii L ;Taq DNA 聚合酶(5U/y L)，0.2 y L ;SEQ IDNos.1-12 (IOuM)均为L ;混合模板DNA,3ii L ;余量为去离子水。
[0043]在一个实施方式中，多重PCR扩增条件为:95 °C 5min ；95 V 30s, 57 V 45s，72°C 45s, 35 个循环；72°C IOmin0
[0044]本发明的多重PCR检测方法采用一管同时检测，无需多步PCR处理，节省了时间。本发明的方法巧妙地运用了多重PCR技术的DNA高效扩增、核酸杂交的特异性和多重检测技术的快速和简便性，具有操作简单、省时省力和结果可靠等优点。使用本发明的多重PCR检测方法，其简单、快速且特异的特点适合用于肠球菌耐药性的检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0045]图1是肠球菌属16s rRNA特异性引物对检测，其中1_27为27株肠球菌属菌株显示为阳性，28-42为2株气球菌属菌株、10株链球菌属菌株、3株明串珠菌属菌株共计15株阴性对照菌株均未见条带出现，43为空白对照。
[0046]图2是所示多重PCR检测肠球菌特异性及耐药基因的结果，其中I是aph基因扩增产物、2是tetM基因扩增产物、3是ermB基因扩增产物、4是aad基因扩增产物、5是TEM基因扩增产物、6是16S rRNA基因扩增产物、7是6重PCR扩增产物、8是空白对照。
[0047]图3是检测肠球菌特异性及耐药基因组合的灵敏度结果，其中1-5中进行多重PCR扩增的 DNA 溶液的浓度依次为 20ng/ii L、2ng/ii L、200pg/ii L、20pg/ii L、2pg/ii L，6 是空白对照。
[0048]图4是21株食品分离菌株的检测结果，其中I是阳性对照，C为空白对照，2-22号样品分别为食品分离株。
【具体实施方式】
[0049]通过实施例的方式对本发明作进一步的说明，但是本发明并不局限于以下实施例。
[0050]实施例1:不同菌株DNA提取
[0051]待测链球菌科菌株均来自中国检科院食品安全微生物菌种保藏管理中心，具体
为:27株肠球菌属菌株、2株气球菌属菌株、10株链球菌属菌株、3株明串珠菌属菌株。菌株
目录见下表1。
[0052]表1:待提取DNA的菌株
[0053]
【权利要求】
1.利用多重PCR方法检测肠球菌耐药性的组合物，所述组合物包含以下寡核苷酸引物对: 肠球菌16s RNA特异性引物对:SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2 ;以及 以下耐药基因特异性引物对中的一对或多对: aac-aph 特异性引物对:SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4 ； tetM 特异性引物对:SEQ ID N0.5 和 SEQ ID N0.6 ； ermB 特异性引物对:SEQ ID N0.7 和 SEQ ID N0.8 ； TEM特异性引物对:SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10 ;和 aad 特异性引物对:SEQ ID N0.11 和 SEQ ID N0.12。
2.用于通过多重PCR方法检测肠球菌耐药性的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的组合物。
3.检测肠球菌耐药性的多重PCR检测方法，所述方法包括使用权利要求1所述的组合物或权利要求2所述的试剂盒。
4.权利要求1所述的组合物或权利要求2所述的试剂盒在检测肠球菌耐药性中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103484538SQ201310379432
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年8月27日 优先权日:2013年8月27日
【发明者】陈颖, 王娉, 胡玥, 田雪, 赵勇胜, 杨海荣, 赵贵明, 刘洋 申请人:中国检验检疫科学研究院