专利名称：淀粉海藻糖基合成酶及其编码基因与表达方法和工程菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程和酶工程领域中一种淀粉海藻糖基合成酶及其编码基因与表达方法和工程菌。
背景技术：
海藻糖是一种非还原二糖，常态下为白色晶体，爽口甘甜且无后味，其甜度为砂糖的45％；因为该糖具有独特的生物学功能，对多种生物大分子和细胞膜有显著的保护作用，其用途和潜在作用十分广泛，可作为生物制品及活菌制剂的保护剂和稳定剂，也可在食品及化妆品中用做天然添加剂。传统的海藻糖制备方法有酵母抽提法和磷酸化酶法等。近年来，在细菌中发现了能利用淀粉合成海藻糖的新酶类，即淀粉海藻糖基合成酶。这种淀粉酶法合成海藻糖是至今各种海藻糖生产方法中最有发展前途的一种。1993年日本人发现从土壤中分离的根瘤菌(Rhizobium sp.)M-11(CCTCC M94031)和节杆菌(Artobacter sp.)Q36(CCTCC M94030)能产生淀粉海藻糖基合成酶，该酶与海藻糖基水解酶一起使用，可水解淀粉直接生产海藻糖(图1)，海藻糖基水解酶能够在常温中性条件下水解以上方法产生的非还原性淀粉糖中海藻糖部分和其余糖基部分之间的键，生成海藻糖。
随着全球生物技术的飞速发展，微生物基因组的研究方兴未艾，每年都有大量新的微生物酶基因被发现报道。但据统计，目前已报道的微生物酶基因主要还是来自于实验室里可培养的微生物。然而这些微生物的数量还不及预计的所有微生物总量的1％。由于培养条件、分离手段等因素的限制，环境中大量的微生物基因资源被白白闲置；而通过未培养微生物技术，无需经过微生物的分离、培养和鉴定，可直接获得环境样品中的DNA并构建相关样品的基因文库；并通过合适的筛选方法，得以迅速地获得所需的基因资源。
未培养微生物技术的关键之一是从各种样品中高效地获得可进行分子操作的混合基因组DNA并进行有效地纯化。从环境样品中提取DNA一般采用直接裂解法。直接裂解法是直接从环境样品中裂解细胞释放DNA，然后用碱法抽提回收DNA，最后通过乙醇沉淀、CsCl密度梯度离心和羟基磷灰石柱层析纯化DNA的方法。它根据对细胞的裂解作用程度又可分为物理法和化学法。前者一般采用剧烈的物理处理来裂解细胞，这些物理处理包括多次冻融、超声波、玻璃珠匀浆、微波加热和研磨等方法；这些处理所得的DNA片段长度一般在5kb至10kb或更小。化学法是指用化学手段处理来裂解细胞，它包括溶菌酶、蛋白酶K、SDS、热酚、硫氰酸胍、蛋白水解酶、丙酮和EDTA等；这些处理所得的DNA片段一般较大(几十个kb)。
发明创造内容本发明的目的是提供一种淀粉海藻糖基合成酶及其编码基因。
一种淀粉海藻糖基合成酶，名称为G135，它是具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列或将SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №1相同活性的由SEQ ID №1衍生的蛋白质。
序列表中SEQ ID №1的蛋白质由732个氨基酸残基组成。
为了便于纯化，可在所述淀粉海藻糖基合成酶C-末端增加多肽标签，如6个组氨酸多肽尾巴的氨基酸序列。
淀粉海藻糖基合成酶编码基因，具有下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №2；2)编码序列表中SEQ ID №1蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中的SEQ ID №2由2243个碱基组成，其开放阅读框架为自5′端第1位-2199位碱基。为了便于纯化，可在SEQ ID №2的第2196位碱基后增加多肽标签的编码基因，如编码6个组氨酸多肽尾巴的核苷酸序列。
含有本发明的淀粉海藻糖基合成酶编码基因的载体、细胞系及宿主菌，如pM75质粒(图6)和于2004年04月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)、保藏号为CGMCC № 1133的工程菌—大肠埃希氏菌(Escherichia coli) DE3(pM75)，均属于本发明的保护范围。
pM75大小为6.3kb，由淀粉海藻糖基合成酶基因和载体pET3a的一个4.1kb片段组成。大肠埃希氏菌(Escherichia coli)DE3(pM75)包含该重组DNA分子。
本发明的另一个目的提供一种表达淀粉海藻糖基合成酶的方法。
本发明所提供的表达淀粉海藻糖基合成酶的方法，是将含有上述淀粉海藻糖基合成酶编码基因的重组表达载体导入表达宿主菌，表达得到淀粉海藻糖基合成酶。
在本方法中，只要宿主菌表达本发明的淀粉海藻糖基合成酶基因，重组DNA分子在宿主菌中可被复制并且整合的基因可被稳定地保留，则对可利用的宿主/载体系统并无特殊限制。例如，宿主是大肠杆菌K-12的EK系统的成员和宿主为枯草芽孢杆菌的BS系统的成员都可以使用。利用包含许多种载体并且遗传学上被深入地研究过的EK系统可获得良好的结果，因而是优选的。宿主细菌的特定的例子包括EK系统的DH5α、HB101、BE3、TOP010和JM109，以及BS系统的BD170、MI112和ISW1214。
其中，所述淀粉海藻糖基合成酶编码基因的重组表达载体可通过将本发明的淀粉海藻糖基合成酶编码基因按照常规方法克隆入出发载体中得到，所述出发载体包括用于EK系统的pBR322、pET、pBV220、pBAD和pUC18，以及用于BS系统的pUB110和pHY300PLK。
对所述淀粉海藻糖基合成酶编码基因的重组表达载体转化宿主细菌的方法并无特殊的限制。例如在EK系统宿主的情况下可用氯化钙法(Mandel，M.和Higa，A.，《分子生物学杂志》，53，159(1970))，而在BS系统宿主的情况下可用原生质体法(Chang，C.和Cohen，S.N.，Mol.Gen.Genet.)，168，111(1978))。可通过载体本身的筛选标记进行重组子微生物(工程菌)的初步筛选，再利用淀粉海藻糖基合成酶的性质最终确定工程菌，例如，在利用EK系统的pBR322作载体并利用HindIII酶切本发明的淀粉海藻糖基合成酶编码基因将其插入pBR322的HindIII酶切位点时，四环素抗性基因失活，可以通过AmprTets来初步筛选转化子。随后，将所选的转化子利用如影印方法转移至含有麦芽五糖的琼脂平板上，然后进行培养以便形成菌落。因此靶重组子微生物在集落周围分解麦芽五糖，所以通过利用一种铜试剂溶液对在含有麦芽五糖的琼脂平板中所含的麦芽五糖染色可以对其进行筛选。
所述重组表达载体优选为pM75，可利用含有该载体的大肠埃希氏菌(Escherichia coli) DE3(pM75)CGMCC № 1133大规模生产淀粉海藻糖基合成酶，可使用常规方法从所获的培养物中收集淀粉海藻糖基合成酶。
本发明的淀粉海藻糖基合成酶编码基因的DNA进一步可被用来制备从其它微生物中分离其它的同源淀粉海藻糖基合成酶基因的探针。
本发明采用物理法与化学法相结合的未培养生物技术抽提云南腾冲温泉中采集的泥浆样品的DNA，即在SDS/蛋白酶K热处理法抽提DNA之前，辅以某些物理方法的处理，如多次冻融、液氮研磨、玻璃珠匀浆等，最后对DNA样品再进行CTAB和PVPP的纯化处理，获得了有较高产率的高纯度DNA样品。这些DNA样品再通过几种内切限制性酶切消化，片段进行电泳分析和筛选回收作为插入片段，构建起以pUC18为载体、大肠杆菌DH5α为受体细胞的未培养微生物基因组文库。在对这些构建的未培养微生物基因组文库中获得的亚克隆进行液体诱导培养后，利用检测淀粉海藻糖基合成酶酶活的方法进行筛选；并通过蛋白电泳检测外源蛋白的表达情况；获得了一个淀粉海藻糖基合成酶酶活阳性的菌株，通过对该重组子提取质粒进行电泳分析并进行测序，发现在这个大约4.1kb的DNA片段内含有编码一种完整的糖苷酶G135基因序列信息。该基因具有序列表中序列2的核苷酸序列，其编码具有序列表中序列1的氨基酸残基序列的蛋白质。本发明的淀粉海藻糖基合成酶编码基因与其它微生物产生的淀粉海藻糖基合成酶编码基因同源性分别为93％(芝田硫化叶菌B12)、63％(嗜酸热硫化叶菌ATCC33909)、48％(节杆菌Q36)、48％(根瘤菌M11)、50％(短杆菌)。
本发明的淀粉海藻糖基合成酶可以在高温环境下(最高达约75℃)特异性利用淀粉部分水解物，高效合成具有海藻糖结构作为末端单元的非还原性淀粉糖。任何物质只要是淀粉水解产生的还原性淀粉糖，就可作为本发明酶的底物，如麦芽三糖，麦芽四糖，麦芽五糖，麦芽六糖和麦芽七糖等。除这些底物外，其它通过用淀粉酶或酸部分水解淀粉类物质如淀粉、支链淀粉和直链淀粉而制备的还原性淀粉部分水解物也作为本发明酶的底物。
可用于部分水解淀粉的淀粉酶的可以是在Handbook of Amyloses and RelatedEnzymes(由Pergamon Press；Tokyo，Japan(1988)出版)中公开的α-淀粉酶、麦芽五糖形成淀粉酶和麦芽六糖形成淀粉酶等。也可以将这些淀粉酶与脱支酶如支链淀粉酶和异淀粉酶结合使用。
本发明的淀粉海藻糖基合成酶对用作底物的淀粉部分水解物的浓度没有特别的限制，甚至可以在含0.1％或50％底物的溶液中进行酶反应，形成非还原性淀粉糖。也可使用含过量底物的不可溶悬浮物。在本发明的淀粉海藻糖基合成酶反应中可用的反应温度可以是本发明酶不失活的温度，即最高达约75℃，优选的在55-70℃。在本发明酶反应中可用的反应pH是4.5-8.0，优选在pH5.0-6.0。在实际应用中，根据酶反应条件来选择本发明酶反应所用的时间，通常当以0.1-100单位/g底物使用本发明的酶时，大约需0.1-100小时。本发明的淀粉海藻糖基合成酶及其编码基因与工程菌-大肠埃希氏菌(Escherichia coli)DE3(pM75)CGMCC № 1133将在海藻糖的生产中发挥重要作用。
图1为酶法合成海藻糖示意2为本发明的淀粉海藻糖基合成酶的最适反应温度曲线图3为本发明的淀粉海藻糖基合成酶的最适反应pH曲线图4为本发明的淀粉海藻糖基合成酶的温度稳定性曲线图5为本发明的淀粉海藻糖基合成酶的pH稳定性曲线图6为质粒pM75的构建过程示意图
具体实施例方式
下面将要通过实施例更详细地描述本发明，这些实施例不应被认为是将本发明限定于此。在实施例中的浓度都是以(W/V)的％为基础。
实施例1、本发明的淀粉海藻糖基合成酶的表达1、本发明的淀粉海藻糖基合成酶编码基因的克隆(1)环境样品的处理和DNA的提取从云南腾冲温泉中采集泥浆样品，60℃烘干后，称取少许样品，放置于研钵中，然后加入液氮，充分研磨至样品呈均匀粉末状。研磨后的样品放置于50mL的离心管中，加入DNA抽提缓冲液(100mM Tris-HCl，pH8.0，100mM EDTA，100mM磷酸钠缓冲液，pH8.0，1.5M NaCl，1％CTAB)，充分混匀。然后反复进行三次液氮冻融处理。随后向混合液中加入蛋白酶K(20mg/mL)和SDS(10％)，混匀后，60℃水浴保温2-3小时，每隔15-20分钟上下颠倒混匀几次；7000g室温离心10分钟，收集上清，沉淀中加入水，60℃洗两次，每次10分钟；合并三次上清，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提两次；水相中加入酸洗PVPP，37℃水浴保温30分钟，经孔径为0.45nm的滤膜过滤除去PVPP，随后加入0.6倍体积的异丙醇，室温30分钟后，12000g 4℃离心15分钟，70％乙醇洗；沉淀用TE缓冲液(10mMTris-HCl，pH8.0，1mM EDTA pH8.0)溶解。
(2)目的DNA片段的制备分别用EcoRI或Pst I两种限制性内切酶部分酶切步骤(1)中制备的DNA样品。经0.8％低熔点琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL溴化乙锭)电泳，在长波长(365nm)紫外灯下，于分子量为3kb处切一切口，插入DEAE-纤维素膜，继续电泳，直至分子量为8kb的DNA酶切片段到达膜上，停止电泳，从膜上回收DNA。将最终回收的DNA酶切片段溶于20μl的TE缓冲液中。
(3)环境样品DNA文库的构建将经过同样EcoRI或Pst I酶切的质粒pUC18用牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)去磷酸化后和步骤(2)中制备的EcoRI或Pst I酶切回收的DNA片段用T4DNA连接酶在16℃，进行连接反应2-14小时后，立即用感受态E.coli DH5α进行化学转化，并随后冰置30分钟，加SOC培养基(1％胰蛋白胨、0.5％酵母粉、1％NaCl，1％葡萄糖，pH值7.0)在37℃，225rpm摇动恢复培养45-60分钟，涂于氨苄青霉素(Amp)-LB平板上(1％胰蛋白胨、0.5％酵母粉、1％NaCl，1.5％琼脂，60μg/ml氨苄青霉素、8μg/mL异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)和9μg/mL X-gal，pH值7.0)37℃培养16-18小时，挑取白斑。将阳性菌落挑至含Amp的LB固体培养基上，37℃培养16-18小时后，用含Amp的LB液体培养基(1％胰蛋白胨、0.5％酵母粉、1％NaCl)洗下平皿上的菌落，加入含10％甘油的LB液体培养基混匀，室温放置2小时，液氮速冻，-70℃保存。
(4)筛选从步骤(3)中已构建的腾冲温泉微生物基因组文库中进行酶活筛选，通过培养诱导，检测海藻糖基合成酶的酶活并通过蛋白电泳检测外源蛋白的表达情况；对具有酶活性表达的阳性重组子提取质粒并进行电泳分析并进行部分测序，发现在该质粒的DNA片段内含有一个部分的开放阅读框架。利用基因库中已发表的微生物相关糖苷酶基因序列的信息，对已获得的部分测序结果进行网上检索和生物软件分析，获得一系列糖苷酶基因序列对比资料，确定该基因片段中含有其他几个海藻糖基合成酶共有保守活性序列。顺次对其余片段进行全基因测序，拼接出完整的新酶基因G135(本发明的淀粉海藻糖基合成酶编码基因)序列信息。该基因具有序列表中序列2的核苷酸序列，其编码具有序列表中序列1的氨基酸残基序列的蛋白质。经过同源性比较，结果表明本发明的淀粉海藻糖基合成酶编码基因与其它微生物产生的淀粉海藻糖基合成酶编码基因同源性分别为93％(芝田硫化叶菌B12)、63％(嗜酸热硫化叶菌ATCC33909)、48％(节杆菌Q36)、48％(根瘤菌M11)、50％(短杆菌)。
其中，按下述方法检测本发明海藻糖基合成酶的活性将0.1ml酶溶液加到0.1ml 2％(w/v)麦芽五糖的50mm醋酸缓冲液(pH5.5)中，60℃反应10分钟后沸水浴10分钟以灭活，反应混合物用水稀释20倍，然后取稀释液400ul用Somogyi-Nelson方法确定还原能力。作为对照，在100℃将酶溶液预热15分钟以使酶失活，按与上述相同的方法检测。将1单位的酶活性定义为在该条件下，每分钟去除1μmol麦芽五糖还原能力所需的酶量。
表1.G135基因的序列分析
2、本发明的淀粉海藻糖基合成酶的表达(1)表达载体的构建参照已知序列，设计G135基因的PCR引物(上游5′-GCGCCATATGATAATAGGTACGTA-3′下游5′-CGCGGATCCCTGAGTAATGCATATCTG-3′)进行PCR扩增。PCR扩增条件为94℃预变性1分钟，94℃变性1分钟，48℃退火1分钟，71℃延伸2分钟，30个循环，71℃后保温10分钟，电泳检测扩增产物约2.2kb。扩增产物大小与预期结果相符。将片段纯化、经NdeI和BamHI酶切，与经NdeI和BamHI酶切的载体pET-3a相连后，转入受体菌大肠杆菌DE3中，用NdeI和BamHI酶切检测筛选出含重组质粒的菌株大肠埃希氏菌(Escherichia coli)DE3(pM75)(图6)。
(2)诱导培养工程菌大肠埃希氏菌(Escherichia coli)DE3(pM75)表达本发明的淀粉海藻糖基合成酶将获得的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)DE3(pM75)于2ml含有50ug/ml氨苄青霉素LB液体培养基中振荡培养12小时。将2ml培养物接种于50ml LB培养基(含有50ug/ml氨苄青霉素)中，然后在37℃振荡培养2小时，当三角瓶中培养液的菌体密度OD600为0.6-0.8左右时，加入5ul 20％的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷溶液进行诱导表达，在37℃条件下继续培养4小时，于6000转/分离心10分钟，分别收集菌体和培养液上清。将通过离心分离收集的细胞悬于醋酸缓冲液(pH5.5)中，并通过超声处理破坏细胞。细胞被超声处理后，通过离心分离清除细胞碎片，并将所获的细胞上清液作一种无细胞提取物。以转入pET-3a的大肠杆菌DE3(pET)菌株的无细胞提取物作为对照。分别检测培养上清液、细胞上清液中淀粉海藻糖基合成酶的活性，结果如表2所示。
其中，按下述方法检测本发明海藻糖基合成酶的活性将0.1ml酶溶液加到0.1ml 2％w/v麦芽五糖的50mm醋酸缓冲液(pH5.5)中，60℃反应10分钟后沸水浴10分钟以灭活，反应混合物用水稀释20倍，然后取稀释液400ul用Somogyi-Nelson方法确定还原能力。作为对照，在100℃将酶溶液预热15分钟以使酶失活，按与上述相同的方法检测。将1单位的酶活性定义为在该条件下，每分钟去除1μmol麦芽五糖还原能力所需的酶量。
表2
实施例2、本发明的海藻糖基合成酶的纯化合并大肠杆菌DE3(pM75)培养上清液和细胞上清液作为海藻糖基合成酶G135的粗酶液，并在70℃水浴中加热30分钟后再次离心，弃去热变性蛋白沉淀，收集上清，用VIVAFLOW50超滤膜包进行超滤，浓缩液连续上DEAE-Sepharose FAST FLOW离子交换柱和Phenyl-Sepharose疏水柱层析和Sephacryl S-200分子凝胶过滤柱进行分离纯化，其总酶活性、比活性及收率如表3所示，表明获得电泳纯的酶蛋白。
表3.纯化步骤中新酶G135的总酶活性、比活性及收率。
实施例3、本发明的海藻糖基合成酶G135的性质用SDS-PAGE测得本发明的海藻糖基合成酶G135的分子量约为84kD，与序列分析结果相似。根据对酶活性的分析来研究温度和pH对该酶活性和稳定性的影响。pH5.5时，在不同温度条件下测定G135酶的活力，获得温度—活力曲线(图2)；60℃时，在不同pH条件下测定G135酶的活力，获得pH-活力曲线(图3)；将酶液在不同温度中分别保温60分钟后，各自测定残余酶活力，以未保温的酶液活力为100％，获得温度—稳定性曲线(图4)；将酶液在不同pH条件下分别在30℃保温30分钟，各自测定残余酶活力，以未处理的原酶液活力为100％，获得pH-稳定性曲线(图5)。结果表明当于pH5.5保存30分钟时，该酶的适宜温度为75℃，在30℃保存30分钟时，该酶的适宜pH为约5.5；该酶在温度高达约70℃和pH约4-11下是稳定的。
序列表<160>2<210>1<211>732<212>PRT<213>未知<400>1Met Ile Ile Gly Thr Tyr Arg Leu Gln Leu Asn Lys Lys Phe Thr Phe1 5 10 15Tyr Asp Val Ile Glu Asn Leu Asp Tyr Phe Lys Glu Leu Gly Val Ser20 25 30His Leu Tyr Leu Ser Pro Ile Leu Asn Gly Arg Pro Gly Ser Ala His35 40 45Gly Tyr Asp Val Val Asp His Ser Glu Ile Asn Glu Glu Leu Gly Gly50 55 60Lys Glu Gly Tyr Phe Thr Leu Val Lys Glu Ala Lys Ser Arg Gly Leu65 70 75 80Gly Ile Ile Gln Asp Ile Val Pro Asn His Met Ala Ile His His Thr85 90 95Asn Trp Arg Leu Met Asp Leu Leu Lys Asn Trp Lys Asn Ser Lys Tyr100 105 110Tyr Asn Tyr Phe Asp His Tyr Asp Asp Asn Lys Ile Ile Leu Pro Ile115 120 125Leu Glu Asp Glu Leu Asp Thr Val Ile Asp Lys Gly Leu Ile Lys Val130 135 140Gln Lys Asp Lys Ile Glu Tyr Arg Gly Phe Ile Leu Pro Ile Asn Asp145 150 155 160Glu Gly Val Glu Phe Leu Lys Lys Ile Asn Cys Phe Asp Asn Ser Cys165 170 175
Leu Lys Lys Glu Asp Ile Lys Lys Leu Leu Leu Met Gln Tyr Tyr Arg180 185 190Leu Thr Tyr Trp Lys Lys Asp Tyr Pro Asn Tyr Arg Arg Phe Phe Ala195 200 205Val Asn Asp Leu Ile Ala Val Arg Val Glu Leu Asp Glu Val Phe Arg210 215 220Glu Ser His Glu Ile Ile Gly Lys Leu Leu Val Asp Gly Leu Arg Ile225 230 235 240Asp His Ile Asp Gly Leu Tyr Asn Pro Lys Glu Tyr Leu Asp Lys Leu245 250 255Arg Gln Leu Val Gly Asn Asp Lys Ile Ile Tyr Val Glu Lys Ile Leu260 265 270Ser Ile Asn Glu Lys Leu Arg Asp Asp Trp Lys Val Asp Gly Thr Thr275 280 285Gly Tyr Asp Phe Val Asn Tyr Val Asn Met Leu Leu Val Asp Gly Ser290 295 300Gly Glu Glu Glu Leu Thr Lys Phe Tyr Glu Asn Phe Ile Gly Arg Lys305 310 315 320Ile Asn Ile Asp Glu Leu Ile Ile Gln Ser Lys Lys Leu Val Ala Asn325 330 335Gln Leu Phe Lys Ala Asp Ile Glu Thr Leu Ser Asn Leu Leu Asn Val340 345 350Asn Tyr Asp Tyr Leu Val Asp Phe Leu Ala Cys Met Lys Lys Tyr Arg355 360 365Thr Tyr Leu Pro Tyr Glu Asp Ile Asn Gly Ile Arg Glu Cys Asp Lys370 375 380Glu Gly Lys Leu Lys Asp Glu Lys Gly Ile Met Arg Leu Gln Gln Tyr385 390 395 400Met Pro Ala Ile Phe Pro Lys Gly Tyr Glu Asp Thr Thr Leu Phe Ile405 410 415Tyr Asn Arg Leu Ile Ser Leu Asn Glu Val Gly Ser Asp Leu Arg Arg420 425 430
Phe Ser Leu Ser Ile Asp Asp Phe His Asn Phe Asn Gln Ser Arg Val435 440 445Asn Thr Ile Ser Met Asn Thr Leu Ser Thr His Asp Thr Lys Phe Ser450 455 460Glu Glu Leu Arg Ala Arg Ile Ser Val Leu Ser Glu Ile Pro Lys Glu465 470 475 480Trp Glu Glu Arg Val Ile Tyr Trp His Asp Leu Leu Arg Pro Asn Ile485 490 495Asp Lys Asn Asp Glu Tyr Arg Phe Tyr Gln Thr Leu Val Gly Ser Tyr500 505 510Glu Gly Phe Asp Asn Lys Glu Arg Ile Lys Asn His Met Ile Lys Val515 520 525Ile Arg Glu Ala Lys Val His Thr Thr Trp Glu Asn Pro Asn Ile Glu530 535 540Tyr Glu Asn Lys Val Leu Asp Phe Ile Asp Glu Ala Phe Glu Asn Ser545 550 555 560Asn Phe Thr Asn Asp Phe Glu Thr Phe Glu Lys Arg Ile Val Tyr Phe565 570 575Ala Tyr Met Lys Ser Leu Val Ala Thr Thr Leu Lys Phe Leu Ser Pro580 585 590Gly Val Pro Asp Ile Tyr Gln Gly Thr Glu Val Trp Arg Phe Leu Leu595 600 605Thr Asp Pro Asp Asn Arg Met Pro Val Asp Phe Lys Lys Leu Arg Glu610 615 620Leu Leu Asn Asn Leu Thr Gln Lys Asn Leu Glu Leu Ser Asp Pro Arg625 630 635 640Val Lys Met Leu Tyr Val Lys Lys Leu Leu Gln Leu Arg Arg Glu Tyr645 650 655Ser Leu Asn Asp Tyr Lys Pro Leu Pro Phe Gly Phe Gln Arg Gly Lys660 665 670Val Thr Val Leu Phe Ser Pro Ile Val Thr Arg Glu Val Lys Glu Lys675 680 685
Ile Ser Ile Arg Gln Lys Ser Val Asp Trp Ile Arg Asn Glu Glu Ile690 695 700Ser Ser Gly Val Tyr Asn Leu Ser Glu Leu Ile Gly Glu His Arg Val705 710 715 720Val Ile Leu Thr Glu Lys Val Gly Glu Leu Pro Ile725 730<210>2<211>2243<212>DNA<213>未知<220>
<221>
<222>
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1.一种淀粉海藻糖基合成酶，它是具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列或将SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №1相同活性的由SEQ ID №1衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的酶，其特征在于所述淀粉海藻糖基合成酶具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列。
3.一种淀粉海藻糖基合成酶编码基因，具有下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №2；2)编码序列表中SEQ ID №1蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述淀粉海藻糖基合成酶编码基因具有序列表中SEQ ID №2的核苷酸序列。
5.含有权利要求3所述基因的的载体、细胞系及宿主菌。
6.大肠埃希氏菌(Escherichia coli)DE3(pM75)CGMCC № 1133。
7.一种表达淀粉海藻糖基合成酶的方法，是将含有淀粉海藻糖基合成酶编码基因的重组表达载体导入表达宿主菌，表达得到淀粉海藻糖基合成酶；所述淀粉海藻糖基合成酶编码基因，具有下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №2；2)编码序列表中SEQ ID №1蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述宿主菌为大肠杆菌K-12的EK系统成员或枯草芽孢杆菌的BS系统成员。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述EK系统成员包括DH5α、HB101、BE3、TOPO10和JM109；所述BS系统成员包括BD170、MI112和ISW1214。
10.根据权利要求7、8或9所述的方法，其特征在于用于构建所述重组表达载体的出发载体包括用于EK系统的pBR322、pET、pBV220、pBAD和pUC18，以及用于BS系统的pUB110和pHY300PLK；所述重组表达载体为pM75。
全文摘要
本发明公开了一种淀粉海藻糖基合成酶及其编码基因与表达方法和工程菌。本发明所提供的淀粉海藻糖基合成酶，它是具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列或将SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №1相同活性的由SEQ ID №1衍生的蛋白质。本发明的淀粉海藻糖基合成酶及其编码基因与工程菌－大肠埃希氏菌(Escherichia coli)DE3(pM75)CGMCC № 1133将在海藻糖的生产中发挥重要作用。
文档编号C12N9/00GK1712525SQ20041004807
公开日2005年12月28日 申请日期2004年6月14日 优先权日2004年6月14日
发明者吴襟 申请人:中国科学院微生物研究所