专利名称：抗人内皮抑素的单克隆抗体及其杂交瘤细胞系与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及杂交瘤细胞系及其产生的单克隆抗体与应用，特别是涉及一种抗人内皮抑素的单克隆抗体和分泌该抗体的杂交瘤细胞系及其该抗体的应用。
背景技术：
内皮抑素是1997年由哈佛大学的O’Reilly等发现的一种内源性的血管生成抑制因子，由胶原XVIII降解产生，为胶原XVIII NC1结构域C末端184个氨基酸的小分子片段，相对分子量(Mr)为20kD，可以通过位于其表面的11个精氨酸构成的碱性区域与肝素结合。在体内、体外实验中内皮抑素显示出抑制内皮细胞增殖、抑制新血管形成及抑制肿瘤形成和转移的活性，并可使已形成的肿瘤消失且不产生耐药性。内皮抑素在体液中水平的高低与肿瘤的发生、发展具有密切的关系，特别是与肿瘤的转移性有关，有可能被用做临床预后的检测指标。最新的研究结果表明，在多发性硬化、阿尔兹海默等疾病患者体内，存在内皮抑素水平增高或沉积等现象，值得深入探讨。
目前，内皮抑素抑制内皮细胞的作用机制尚不清楚，可能是通过某种细胞表面受体而发挥作用，也有人认为内皮抑素是通过阻断VEGF受体或干扰内皮细胞与周围基质的粘附而发挥作用。众多研究人员一直在努力寻找内皮抑素在细胞表面的直接受体，而内皮抑素单抗在这些研究中是一个有力的工具。
发明内容
本发明的目的是提供能与人内皮抑素专一结合的单克隆抗体以及产生该抗体的杂交瘤细胞系。
能够分泌与人内皮抑素专一结合单克隆抗体的杂交瘤细胞系已于2004年04月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC № 1137。
本发明用纯度大于99％的重组人内皮抑素作为抗原免疫小鼠，采用杂交瘤技术，经过细胞融合并筛选得到一株能持续、稳定分泌抗人内皮抑素单克隆抗体的杂交瘤细胞株E47(CGMCC № 1137)。由该细胞系分泌的抗内皮抑素的单抗名称为mAb E47，其轻链序列为序列表中序列1；重链序列为序列表中序列2。
单抗mAb E47仅识别单一的抗原决定簇，与其它抗原无交叉反应，用于检测具有高特异性、高敏感性的优点，可以准确检测体液中内皮抑素的水平，在临床检测中将会得到广泛应用。由于本发明的抗体具有阻断内皮抑素功能的特性，可用于进一步深入研究内皮抑素的结构、功能及作用机制，同时通过筛选或结构模建分析方法还可以获得内皮抑素的结构和功能类似物，具有良好的应用前景。
图1为抗体SDS-PAGE电泳2为抗体免疫印迹分析3为抗体用间接ELISA测定的反应曲线图4为细胞HUVEC的细胞粘附实验数据5为细胞HUVEC的迁移实验数据6为小鼠角膜显微照片图7为小鼠角膜血管长度数据图具体实施方式
实施例1、杂交瘤细胞系的建立一、实验材料1、免疫原毕赤酵母表达的内皮抑素(冯怡 崔立斌 刘传暄 马清钧，人内皮抑素在毕赤酵母中的表达、纯化与生物功能研究生物工程学报Vol.17 No.3278-282.)2、培养基RPMI1640和IMDM培养基购于Gibco公司产品；HAT、HT选择培养基、降植烷购于Sigma公司。
3、实验动物Balb/c小鼠，8-12周龄，雌性，按一级动物喂养。
4、其他材料PEG 4000购于Fluka公司；HRP-山羊抗小鼠IgG购自北京中山公司；其余试剂均为国产分析纯。
二、杂交瘤细胞系的建立1、动物免疫1)基础免疫将抗原内皮抑素与福氏完全佐剂等体积混合并充分乳化，分点皮下注射，每只Balb/c小鼠每次注射量为100μg。
2)加强免疫加强免疫采用抗原与福氏不完全佐剂的乳化液。在进行细胞融合前3天，经腹腔注射含150μg抗原的生理盐水溶液。
2、杂交瘤细胞的制备按常规方法收集免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞按10∶1的比例以500g/L的PEG4000进行融合。用HAT培养液选择培养，融合后10～15d，取上清采用间接ELISA法筛选分泌抗内皮抑素mAb的杂交瘤细胞株。对所得阳性克隆株采用有限稀释法进行亚克隆。
间接ELISA法的操作步骤如下用200μg/L内皮抑素包被酶联板，用免疫小鼠血清1∶100作为阳性对照，无克隆生长的培养上清和正常小鼠血清作为阴性对照，每孔加1∶2000HRP-山羊抗小鼠IgG100μl，最后测定490nmOD值。凡OD490值大于阴性对照2倍以上者，即可初步判定为阳性克隆。
3、杂交瘤细胞系的建立重复步骤2，进行4次细胞融合，经过4次亚克隆和间接ELISA筛选，得到一株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系E47。
4、应用杂交瘤细胞系E47所得单抗的效价测定将E47细胞在含10％胎牛血清的IMDM培养基中培养传代，每3天传代一次，传代到16代后进行单抗效价测定。
1)细胞培养液上清效价测定将第16代细胞按1×105接种量接种到5ml含10％胎牛血清的IMDM培养基中，在37℃含5％CO2的细胞孵箱中培养3天；然后将细胞培养液在800rpm下离心10min，收集上清，用间接ELISA法测定上清中单抗效价，结果表明上清效价为1∶2000-1∶5000。
2)小鼠腹水效价测定选择健康的Balb/c小鼠，先向小鼠腹腔注射0.5mL降植烷，7-10天后每只小鼠腹腔注射第16代杂交瘤细胞1×106-2×106个。待小鼠腹部明显膨大到一定程度后，用9号针头抽取腹水。收获的腹水于4℃、13000rpm离心30min，收集上清。用间接ELISA法测定上清中单抗效价，效价为1∶10000-1∶100000。
5、E47细胞系的传代培养将E47细胞系在含10％胎牛血清的IMDM培养基中继续进行培养、传代，培养到60代后，杂交瘤细胞系E47仍然能生长良好、稳定传代，培养液上清效价仍然可以达到1∶2000以上。
以上结果表明，所得E47细胞系能够稳定传代，可以持续、稳定分泌抗人内皮抑素的单克隆抗体。
实施例2、应用E47细胞系制备抗人内皮抑素的单克隆抗体一、抗体制备选择健康的Balb/c小鼠，先向小鼠腹腔注射0.5mL降植烷，7-10天后每只小鼠腹腔注射第16代杂交瘤细胞1×106-2×106个。待小鼠腹部明显膨大到一定程度后，用9号针头抽取腹水。收获的腹水于4℃、13000rpm离心30min，收集上清。
收集的腹水用50mmol/LTris-HCl(PH 7.8)3mol/LNaCl按1∶8稀释后，用ProteinA Sepharose CL-4B进行纯化，柱层析洗脱液为0.1mol/L柠檬酸盐缓冲液(pH5.0)，收集洗脱液浓缩，得到抗人内皮抑素的单克隆抗体(mAb E47)。
二、抗体mAb E47鉴定1、抗体纯度鉴定将mAb E47用15％SDS-PAGE电泳鉴定纯度，产品纯度为99％，电泳图如图1所示，图中1为纯化的mAb E47，2为蛋白标记物。
2、抗体IgG类和亚类鉴定用内皮抑素包被酶联板后，加16代杂交瘤细胞E47的培养上清1∶1稀释作为一抗在37℃温育2h，用20mmol/L PBS-T(PH 7.4)洗板4次，每次3min。将包被好抗体的酶联板测定mAb E47亚类，测定结果表明mAb E47的Ig类型为IgG1、λ型。
3、抗体免疫印迹检测分别取毕赤酵母、大肠杆菌表达的内皮抑素及bFGF进行15％SDS-PAGE，将电泳后的凝胶对NC膜电转移(电压15V，1h半干转移)，再对转移后的NC膜行间接免疫反应，一抗为E47细胞培养上清1∶20稀释液，底物为DAB。显色适度加2mol/L硫酸终止。免疫印迹分析结果如图2所示，图中1-4为采用Coomassie Blue stain分析，1为蛋白标记物；2为内皮抑素(Endostatin)；3为内皮抑素—硫氧环蛋白融合蛋白(Endo-Trx)；4为bFGF。图中5-7为Western blot分析，5为内皮抑素；6为Endo-Trx；7为bFGF。
免疫印迹结果表明，mAb E47能特异性的识别毕赤酵母表达的内皮抑素及大肠杆菌表达的内皮抑素-硫氧环蛋白融合蛋白(Endo-Trx)，而不识别细胞因子bFGF。
4、抗体mAb E47的反应曲线将纯化所得mAb E47抗体用0.1M含5％BSA的磷酸盐缓冲液(PBS)从1∶1开始倍比稀释，用间接ELISA法测定抗体反应曲线，结果如图3所示，图中横坐标，25表示倍比稀释到第5次，其余与此类似。
5、抗体mAb E47的亲和常数测定按照Friguet等的方法(Friguet B，Alain F et al.Measurements of the TrueAffinity Constant in Solution of Antigen-Antibody Complexes by Enzyme-LinkedImmunosorbent Assay.J Immunol Methods.1985，77(2)305-319.)稀释抗原浓度梯度于2×10-7-4×10-10之间，总mAb E47的浓度为3×10-10，于37℃反应1h，再用间接ELISA法测定游离mAb E47的浓度，根据Scatchard方程，计算方程斜率即为亲和常数(Ka)，测定结果为mAb E47的亲和常数为4×108mol-1。
6、抗体mAb E47的轻、重链可变区序列测定提取E47杂交瘤细胞的mRNA，逆转录获得cDNA，参考小鼠轻重链可变区旁侧保守序列设计简并引物，通过PCR的方法从E47cDNA中扩增出编码轻重链可变区的DNA序列，测序，用所得cDNA序列推导出E47轻重链可变区的氨基酸序列，轻链序列为序列表中序列1；重链序列为序列表中序列2。
三、抗体mAb E47的生物活性鉴定(一)抗体mAb E47抑制内皮抑素的细胞实验1、胶原酶消化法获取原代人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)在无菌条件下取新生儿脐带，剪去钳痕和凝血块阻塞部分，用含双抗的PBS缓冲液初步清洗，找到脐静脉用50ml注射器吸取PBS反复灌注冲洗，洗净残留的血液后用止血钳封住一端，用注射器从另一端灌入约15ml 0.1％的II型胶原酶(D-Hanks配制，0.22μ过滤除菌，灌注体积视脐带长短而定)。超净台内温度一般高于室温在此条件下胶原酶作用20分钟，期间可不时晃动，消化完毕打开止血钳将消化液流入事先准备好的离心管中，用注射器吸取一倍消化液体积的内皮细胞培养基灌洗消化后的血管，收集合并于消化液，900转/分离心10分钟，弃上清。
事先配好内皮细胞培养液(含20％FBS，2ng/mlbFGF，1％BSA，90μg/ml肝素钠的IMDM培养基)并在孵箱内孵育至37℃，此时加入离心得到的细胞团中，吹打均匀，调整细胞数为2×104/ml。六孔细胞培养板事先灌注1％明胶并在37℃孵箱中预热，接种前吸去明胶，每孔加入内皮细胞悬液2.5ml，置于5％CO2、饱和湿度的37℃细胞培养箱中静置培养，24h后更换培养液以除去未贴壁的细胞，以后每隔3天半换培养液1次，至细胞长至汇合。
2、原代人脐静脉内皮细胞的传代培养原代分离的人脐静脉内皮细胞生长汇合后用IMDM培养基洗一次，然后用0.05％胰蛋白酶/0.05％EDTA 1∶1配制的消化液每孔0.5ml消化，于倒置显微镜下观察至细胞边缘略变圆时每孔加含血清的IMDM培养基1ml终止消化。用吸管充分吹打后移入15ml锥底离心管中在900rpm下离心10分钟。吸净上清，加入事先温至37℃的内皮细胞培养基，轻轻吹打均匀，血球计数板计数，调整细胞数为2×104/ml按每孔2.5ml接种于6孔细胞培养板中。置于含5％CO2、饱和湿度的37℃孵箱中静置培养，每隔3天半换培养液1次。
3、人脐静脉内皮细胞的鉴定在24孔塑料培养板孔内放置无菌的盖玻片0.5cm×0.6cm，每孔中接种1ml含有105个细胞的HUVEC悬液(第2代)。待内皮细胞生长至近融合状态时，取出盖玻片，用PBS洗3次，投入冷丙酮中(0℃-4℃)，细胞面向上，作用5min后用PBS冲洗3次，每次1min，而后进行免疫组化染色。先用封闭液37℃封闭4小时，第一抗体为鼠抗人vWF单克隆抗体，1∶100倍稀释，加入50μl于盖玻片上，放入湿盒内4℃过夜。同时不加一抗做阴性对照。然后用含0.05％吐温20的PBS冲洗3次后，加入1∶200倍稀释的辣根酶标记的羊抗鼠二抗50μl，37℃孵育2小时后，用PBS洗涤3次，用SABC显色试剂盒显色，显微镜下观察鉴定。
结果表明，所培养的细胞呈vWF阳性反应，是人内皮细胞，可用于内皮抑素抑制试验。
4、细胞粘附试验96孔板事先分别用20μg/ml内皮抑素、1％BSA于4℃包被过夜，用1％BSA封闭2小时。胰酶消化单层培养的第三代HUVEC，用无血清培养基洗两次，调整细胞数为1×105/孔，同时向培养板中分别加入20μg/ml内皮抑素、40μg/ml抗体mAb E47、40μg/ml小鼠IgG个100μl(均以PBS溶解)，每种处理重复3组，空白对照加入同样体积的PBS。将细胞培养板在37℃孵育1小时，用无血清培养基洗去未贴壁细胞，然后每孔用100μl 0.5％结晶紫溶液对已贴壁细胞进行染色，然后吸去染液用PBS洗两次，最后每孔用100μl 10％乙酸溶液溶解细胞吸附的结晶紫，在酶联仪上490nm波长处测定OD值，结果如图4所示，图中1为20μg/ml内皮抑素；2为40μg/ml抗体mAb E47；3为40μg/ml纯化的小鼠IgG；4为含1％BSA的PBS。
从图4可以看出，HUVEC可以粘附于内皮抑素包被的细胞培养板上，外加PBS不影响HUVEC对内皮抑素的粘附，1％BSA包被的培养板为阴性对照，HUVEC不能很好的粘附于BSA包被的培养板上，而游离的内皮抑素20μg/ml可以抑制HUVEC对内皮抑素的粘附，抗内皮抑素的单克隆抗体E4740μg/ml也可抑制HUVEC对内皮抑素的粘附，而同样浓度的对照抗体不影响HUVEC对内皮抑素的粘附。结果表明，本发明所得抗内皮抑素的单抗mAb E47可以拮抗固定化的内皮抑素促进内皮细胞(HUVEC)粘附的功能。
5、趋化诱导的HUVEC迁移试验脐静脉内皮细胞用含20％胎牛血清的IMDM传代培养，用直径6.5mm、孔径8μm的聚碳酸酯膜的细胞迁移培养板进行迁移试验。滤膜的底面预先铺上一层厚度约0.1mm的基质胶，37℃温箱中放置30分钟形成稳定胶层。在迁移培养板下槽中加入含有1％胎牛血清及10ng/ml bFGF的IMDM培养基，37℃、5％CO2培养箱中孵育1h以上后使用。生长状态良好的脐静脉内皮细胞经0.05％胰酶、0.02％EDTA消化悬浮后，无血清培养基洗涤两遍，用含1％胎牛血清的IMDM培养基调整细胞浓度为1×106个/毫升，按表1进行各种分组处理①PBS(下槽中无bFGF)，②PBS，③内皮抑素20μg/ml，④内皮抑素10μg/ml，⑤内皮抑素20μg/ml+E4740μg/ml，⑥E4740μg/ml，室温孵育30分钟。上槽中每孔加入100μl细胞悬液，每种处理重复3孔，37℃、5％CO2孵育4h后，将上层小槽取出，倾去培养液，用棉签擦去迁移膜上表面的细胞，再用生理盐水轻轻洗涤。迁移膜经甲醇固定后用0.5％结晶紫染色，再次用生理盐水洗涤去掉不结合细胞的染料，用10％乙酸(v/v)溶解细胞中的结晶紫后，490nm测OD值，结果如图5所示。
表1.分组实验条件表
图5中纵坐标用吸光度显示发生迁移的细胞数量，图中1为不加任何刺激的对照组中HUVEC的自发迁移；2为10ng/mlbFGF刺激下的HUVEC迁移；3为在20μg/ml内皮抑素的抑制下HUVEC受同样浓度bFGF刺激时的迁移，可以见到抑制作用明显；4为内皮抑素浓度10μg/ml时的抑制效果；5显示的是20μg/ml内皮抑素对10ng/ml的bFGF诱导下HUVEC的迁移抑制作用被40μl/ml单抗E47拮抗的效果，可见内皮抑素的抑制作用几乎消失；6显示的是单独使用40μg/ml的E47对HUVEC的迁移的影响。结果表明，人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在细胞因子bFGF诱导下的迁移可被内皮抑素抑制，外加单抗E47可以拮抗此抑制作用。
(二)抗体mAb E47抑制内皮抑素的动物实验小鼠采用0.3-0.8ml/kg速眠新肌注全麻，0.5％丁卡因溶液局部滴眼表面麻醉，取约2毫米直径小滤纸片于1N的NaOH中浸泡30秒，在角膜中央放置1分钟，用大量0.9％生理盐水冲洗角膜后，用0.15％氧氟沙星滴眼预防感染。随机分组后滴眼给药对照组用PBS；治疗组用内皮抑素(30μg/ml)；拮抗组用内皮抑素30μg/ml+mAb E4740μg/ml，每天给药6-7次，间隔时间约3-4小时，每次用药0.003ml，连续用药7天观察结果。
图6为角膜4×10倍显微照片，其中a为正常小鼠眼睛角膜；b为碱烧伤刺激下的角膜新血管生成可见丰富血管生长(对照组)；c为内皮抑素对碱烧伤小鼠角膜新血管生成的抑制效果，可见有较少血管生长(治疗组)；d为单抗E47和内皮抑素共同使用时，内皮抑素对角膜新血管生成的抑制作用消失，可见丰富血管生长(拮抗组)。
将小鼠经0.3-0.8ml/kg速眠新肌注全麻，0.5％丁卡因溶液局部滴眼表面麻醉后，在体视显微镜下(40×)，用游标卡尺测量新生血管长度，每眼按12点、3点、6点、9点位置均匀测量四个检测点的新生血管长度，取血管长度的平均值采用SPSS单向方差分析进行统计学分析，结果如图7所示。图中1为碱烧伤后小鼠角膜新生血管平均长度(对照组)；2为内皮抑素治疗组的新生血管平均长度；3为拮抗组的血管平均长度，接近对照组。
血管密度和平均长度指标表明，单抗mAb E47可拮抗内皮抑素的活性。
序列表<160>2<210>1<211>85<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>1Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu Thr Val1 5 10 15Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Ser Tyr Leu Ala Trp20 25 30Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr Ser Ala35 40 45Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser50 55 60Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe65 70 75 80Gly Ile Tyr Tyr Cys85<210>2<211>93<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>2Glu Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Asn Leu Ser1 5 10 15Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His Trp Met Gln Trp Val20 25 30Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro35 40 45
Gly Asp Gly Glu Thr Thr Tyr Ser Gln Lys Phe Glu Gly Lys Ala Thr50 55 60Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Gly Tyr Met Gln Leu Ser Ser65 70 75 80Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg85 90
权利要求
1.具有保藏号为CGMCC № 1137的杂交瘤细胞系E47。
2.与人内皮抑素专一结合的单克隆抗体，由保藏号为CGMCC № 1137的杂交瘤细胞系E47产生。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于所述单克隆抗体轻链的氨基酸序列为序列表中SEQ ID №.1的氨基酸残基序列。
4.根据权利要求2或3所述的单克隆抗体，其特征在于所述单克隆抗体重链的氨基酸序列为序列表中SEQ ID №.2的氨基酸残基序列。
5.人内皮抑素专一结合的单克隆抗体在内皮抑素检测中的应用。
6.人内皮抑素专一结合的单克隆抗体在筛选内皮抑素功能类似物中的应用。
全文摘要
本发明公开了抗人内皮抑素的单克隆抗体及其杂交瘤细胞系与应用，目的是提供能与人内皮抑素专一结合的单克隆抗体。本发明拥有能够分泌与人内皮抑素专一结合的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，保藏号为CGMCC № 1137。本发明所得单抗仅识别单一的抗原决定簇，与其它抗原无交叉反应，用于检测具有高特异性、高敏感性的优点，可以准确检测体液中内皮抑素的水平，可应用于临床检测；同时可用于进一步深入研究内皮抑素的结构、功能及作用机制，具有良好的应用前景。
文档编号C12N5/12GK1712523SQ20041004809
公开日2005年12月28日 申请日期2004年6月15日 优先权日2004年6月15日
发明者冯怡, 冯玉梅, 马清钧, 朱旭东 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所