专利名称：：真菌免疫调节蛋白在抑制△5-去饱和酶中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及真菌免疫调节蛋白的新用途。
背景技术：
：花生四烯酸(arachidonicacid,ARA)是co-6多元不饱和脂肪酸代谢过程的产物。在自然状况下，ARA极少以游离形式存在于细胞内，一般都存在于细胞膜的磷脂上，特别是在卵磷脂、磷脂酰肌醇和磷脂酰乙醇胺的第二个碳的位置上。当细胞受外来刺激活化时(包括物理性、化学性、生理性或其它物质)，细胞膜的磷脂可藉由磷脂酶的活化与作用，而将磷脂上的ARA水解并释出游离的ARA。而游离的ARA经由环氧化酶(cyclooxygenases,COX)或脂质氧化酶(lipoxygenases,LOX)的酶促反应，会快速形成一些可以提供细胞内外信息的脂质介体一也称为类二十酸。这些ARA的代谢产物将会影响生物反应的程序，包含发炎反应。这些产物可以很快地形成并作用在受刺激或感染的地方，然后再以自发性的衰退或借助酶而被破坏。所述类二十酸包括前列腺素和凝血噁烷。前列腺素与凝血噁烷根据其结构可被分为PGD、PGE、PGG、PGH或TXA、TXB;或根据其具有的双键数量前列腺素可被分为PGE1、PGE2或PGE3，其中与引起发炎(pro-inflammaotry)有关的是PGE2、PGD2与TXA2。每一种类二十酸皆由其它特别的酶衍生而来，这些酶有些是分布于特定的组织中，例如TXA2就是由含有凝血噁烷合成酶的血小板产生的。PGD2主要是肥大细胞经由环氧化酶路径^j射产生的。同时，前列腺素与发炎反应中热与痛的发病现象有关，其中PGE2与痛觉过敏有关，即其可以促使皮肤对于疼痛具有高度的过敏现象，随后，组织胺与緩动素与细胞激素相互作用而产生发热现象。亚麻酸(linolenicacid，LA)是一种co-6多元不饱和脂肪酸，经过A6-去饱和酶的作用后，会转变为，亚麻酸(gamma-linolenicacid，GLA)。GLA是人类或动物代谢亚麻酸的第一个产物，上述步骤的反应速率相当緩慢，是多元不饱和脂肪酸代谢的速率决定步骤。在延伸酶(elongase)的作用下，绝大部份的GLA会立即转变为二高-Y-亚麻酸(dihomo-g-linolenicacid，DGLA),然后经过A5-去饱和酶的作用，部分DGLA就会形成ARA。而另一部分DGLA则经过COX的作用，形成抗发炎性的类二十酸PGE1，形成的PGE1会显著抑制发炎性的类二十酸PGE2的形成。在o)-6多元不饱和脂肪酸的代谢过程中，A6-去饱和酶与A5-去饱和酶是两个决定反应速率的酶，特别是A5-去饱和酶，它决定了体内ARA的形成。GLA主要来自几种特殊植物的种子，例如含有23%的玻璃苣籽油(BorageOil)、18%的黑醋栗籽油(BlackcurrantSeedOil)以及9%的月苋草籽油(EveningPrimoseoil)。在动物体内则是极少出现。许多实验结果都证实GLA具有抗发炎以及调节免疫能力的功效。A6-去饱和酶极易受到年纪、体内荷尔蒙以及疾病状态的影响而减低活性，相应地，其体内GLA含量也较低。在体内，A6-去饱和酶的活性也会随着各种疾病，包括关节炎，糖尿病，高血压，湿渗和牛皮癣而下降。除此以外，生活模式因素如压力、吸烟、酒类、亚麻酸以及饱和与反式脂肪酸过高的相关产品，以及维生素B6、锌和镁的缺乏等都会抑制A6-去饱和酶的活性。上述原因皆会减少GLA的在体内的生成，GLA含量的减少相对也减少DGLA在体内的含量，而进一步导致DGLA与ARA共同竟争环氧化酶/脂质氧化酶的情况失去平衡，使得ARA大量产生发炎性前列腺素。近年来，有不少研究机构尝试找出抑制A5-去饱和酶的有效物质。但是效果皆不理想，且现有的抗发炎药物在患者体内容易产生抗药性，故效果不佳。因此，有必要提供一种新型抗炎药物以满足发炎患者的需求。
发明内容本发明的目的在于提供真菌免疫调节蛋白(fUngiimmunodulatoryprotein,FIP)在抑制△5-去饱和酶中的应用。所述真菌免疫调节蛋白优选为灵芝免疫调节蛋白或金针菇免疫调节蛋白。其中该抑制A5-去饱和酶活性是用于预防或治疗由△5-去饱和酶、花生四烯酸、或发炎性类二十酸的浓度失调所引发的慢性或急性发炎反应、发炎症状或发炎疾病。所述发炎疾病为气喘、动脉硬化、肥胖、糖尿病、肠胃疾病、心血管疾病、关节炎、骨质疏松、牙周病、癌症、自体免疫性疾病、过敏、类风湿关节炎、月经痛或痛风。在本发明的另一个实施方式中，在抑制A5-去饱和酶时还应用Y-亚麻酸。所述Y-亚麻酸来自于植物或微生物食品的萃取物。本发明所述预防或治疗发炎反应为以下两种成分的作用机制的加成效果(a)通过真菌免疫调节蛋白抑制A5-去饱和酶的作用，并减少花生四烯酸的浓度，进而降低发炎性类二十酸的浓度，及(b)"亚麻酸可以转变为二高-Y-亚麻酸并增加其浓度，大量形成抗发炎性类二十酸的浓度。在本发明的其他实施方式中，在在抑制△5-去饱和酶时还应用二高-y-亚麻酸。通过抑制A5-去々包和酶的活性，可降低ARA的生成量，从而降^f氐由ARA转变而成的类二十酸的量；或者，增加DGLA的浓度，而A5-去饱和酶的含量不变，则体内的DGLA无法大量转变为ARA，进而使DGLA的浓度高于ARA。本发明借助对co-6多元不饱和脂肪酸代谢的调控，而提供一种新型抗炎药，帮助患者减轻不舒服的症状。灵芝免疫调节蛋白，于1989年由日本学者Kino等人自G./M"WMm菌丝体中分离出来，命名为LZ-8(LingZhi-8)。LZ-8由110个氨基酸所组成，分子量为12,420Da，并且与免疫球蛋白重链区的可变区域的氨基酸序列及二级结构有某种程度的相似性。LZ-8原态(nativeform)是以同源二聚体的形式存在，具有促进淋巴球增殖以及抑制全身性过敏反应(systemicanaphylaxisreaction)和局部过敏反应(Arthusreaction)的作用。此外，LZ-8对于绵羊红血球会产生凝集作用，对人类红血球却不发生任何凝集反应，这显示LZ-8在人体医学上有其应用的潜力。本发明所述的"抑制A5-去饱和酶活性"，可用于预防或治疗由A5-去饱和酶、ARA或发炎性(pro-inflammatory)类二十酸的浓度失调所引发的发炎反应、症状与疾病。此类疾病较佳的具体实例包括但不限于，气喘(JoftheAmericanDieteticAssociation,January2005，98-106)、动脉硬化(Prostaglandins,LeukotrienesandEssentialFattyAcids76(2007)251-268)、肥胖(Nutrition，2001;17,953-966)、糖尿病(JLipidRes.2006Sep;47(9):2028-41.;ProstaglandinsLeukotEssentFattyAcids.2003Feb;68(2):151画62;)、肠胃疾病、溃疡性结肠炎(Clin.Sci.,1987,73，361-364)、克罗恩氏病(Clin.Sci.，1987,73,361—364)、心血管疾病、关节炎(JointBoneSpine.2005Dec;72(6):533國9.Epub2004Dec15)、骨质疏松(Clin.Nutr.,2000,19,271-276)、牙周病(Clin.Nutr.,2000,19，271-276)、癌症(RecentResultsCancerRes,2007;174:37-47.;Toxicology.2000Nov16;153(1-3):1l國26.)及自体免疫性疾病(Lipids.2003Apr;38(4):323國41.;ProcNutrSoc.1998Nov;57(4):555國62.)、过敏(CurrDrugTargetsInflammAllergy.2005Apr;4(2):151-5.)、类风湿关节炎(RheumatolInt.2003Jan;23(1):27-36.Epub2002Sep6.)、月经痛或痛风(ArthritisRheum.2000Aug;43(8):1779-89.;Inflammation.1997Apr;21(2):205画22)等慢性或急性发炎疾病(EquineVetJ.1984May;16(3):163-75)。本发明所述的"真菌免疫调节蛋白"包括但不限于，灵芝免疫调节蛋白(LZ-8，FIP-gts)或金针菇免疫调节蛋白(FIP-fVe)。本发明所述的"抗发炎，，是通过抑制A5-去饱和酶的作用，并减少花生四烯酸的浓度，进而降低发炎性类二十酸的浓度。本发明的药物中可包含Y-亚麻酸，其用于预防或治疗由A5-去饱和酶、花生四烯酸或发炎性类二十酸的浓度失调所引发的发炎反应、症状与疾病。该疾病较佳具体实例包括但不限于气喘、动脉硬化、肥胖、糖尿病、肠胃疾病、心血管疾病、关节炎、骨质疏松、牙周病、癌症、自体免疫性疾病、过敏、类风湿关节炎、月经痛或痛风的发炎疾病。详言之，预防或治疗发炎反应为以下两种成分的作用机制的加成效果:(a)借助真菌免疫调节蛋白抑制A5-去饱和酶的作用，并减少花生四烯酸的浓度，进而降低发炎性类二十酸的浓度，及(b)GLA可以转变为DGLA并增加其浓度，大量形成抗发炎性类二十酸的浓度，抑制发炎性类二十酸的形成。本发明中的GLA可来自于植物或微生物食品的萃取物，可从市场上购得或通过本领域普通技术人员熟知的方法制备而成。图1为co-6多元不饱和脂肪酸的代谢图；图2为rFIP的细胞毒性MTT分析结果；图3为GLA的细胞毒性MTT分析结果；图4为DGLA为100M时，rFIP对RAW264.7巨噬细胞的A5-去饱和作用、DGLA与ARA的影响；图5为DGLA为25M时，rFIP对RAW264.7巨噬细胞的A5-去饱和作用、DGLA与ARA的影响；图6为不同浓度的GLA与rFIP对RAW264.7巨噬细胞的A5-去饱和作用、DGLA与ARA的影响。具体实施例方式本发明提供真菌免疫调节蛋白(flmgiimmunodulatoryprotein,FIP)在A5画去饱和酶中的新应用。所述真菌免疫调节蛋白为灵芝免疫调节蛋白或金针菇免疫调节蛋白。本发明的应用中还可包括Y-亚麻酸。一、实验材料与测试l丄rFIP(重组真菌免疫蛋白)的制备与活性测试利用酵母菌(Saccharomycescerevisiae)表达载体系统来表达rFIP。依据酵母菌营养需求筛选出带有表达载体的转形面包酵母菌抹，经由Westernblot方式确认筛选出带有rFIP的酵母菌。测试蛋白质的纯度与rFIP活性。纯化的rFIP浓缩液保存于-20。C以供实验使用。1.2.RAW264.7巨噬细胞的培养RAW264.7细胞为小鼠巨噬细胞，由BALB/c小鼠以Abelson鼠白血病度引发而来，购自食品工业发展研究所。以含10。/。FBS的DMEM培养液培养于37。C、5。/。C02的培养箱中。待细胞生长至80%~90%汇合时，移除培养液同时添加少量的培养液，利用刮杓将细胞从75T烧瓶中将细胞刮干净，并放入离心管，离心后再加入培养液将细胞浓度调整为1x106细胞/ml，种入96孔组织培养盘或10-cm细胞培养亚，培养于37。C含有5。/oC02之培养箱，待细胞贴附4小时后，再加入不同浓度的rFIP或GLA反应24小时。二、实验药品氯仿；3-(4，5-二曱基p塞唑-2-基)-2，5-联苯四唑溴化物；噻唑兰)(MTT，Sigma,M國2128，USA)DMEM培养基、二曱基石充氧化物(DMSO)乙醇、胎牛血清(FBS)、异丙醇(J.T.Baker，USA)月旨多糖(LPS，Sigma，L-2755Escherichiacoli(E.Coli)SerotypeUSA)磷酸緩沖液(D-PBS,GIBCOBRL,USA)台盼兰(Sigma，USA)三、仪器设备二氧化>谈恒温培养箱无菌抽风拒恒温式水温槽血球计数器倒立式相位差显微镜酶联免疫吸附分析仪(ELISA)酸碱测定仪GC分析仪四、脂质萃取首先将细胞浓度为lxl()6细胞/mL的RAW264.7细胞植入在10mL/10cm培养盘，在37。C培养4小时后，加入不同浓度的rFIP或/和GLA反应24小时后，利用PBS洗净2次后，加入3mL的PBS，然后利用刮灼将培养盘上的RAW264.7细胞刮下，并放入已标示的8mL具螺旋盖的玻璃试管，将玻璃管放入离心机，以1000rpm离心5分钟将PBS移除，最后把玻璃螺旋管放入-20。C冰箱冷冻。玻璃螺旋管待测样品于室温解冻后，立即萃取细胞中总脂质于玻璃螺旋管加入0.5mL去离子水使细胞破裂，加入20ml的氯仿/曱醇混合液(2:1，v/v),至少静置1小时或置于冰箱隔夜，以萃取总脂质。萃取后，加入占总体积20%的0.9o/oNaCl溶液，以分离氯仿和水层。待测样品于4。C,1000rpm,离心5分后，分上下二层，将内含总脂质的氯仿层移置10mLTdfon-螺帽的玻璃管中。置于定速氮气流下，于40。C让氯仿蒸发至干。再将剩余吹干的脂质以0.5mL氯仿重新溶解。加入2mL三氟化硼甲醇溶液，涡旋(vortex),盖子旋紧，于90°C加热15min。冷却后，加入适量的己烷，均匀混合后，再将曱基化脂肪酸萃取出来，即可直接做GC分析。五、气相色谱分析条件(GC分析)取2^L上述处理后之样品(标准品、待测样品)，利用自动化气相色谱仪桌上型HP6890(HewlettPackard,PA，USA)配有火焰离子化侦测器(Flameionizationdetector)来分析脂肪酸的组成。所使用的气相层析管柱选用Omegawax320TM毛细血管柱(30,0mx320pmIDx0.25pm膜)其它条件设定如下载气i殳定H2流速为32mL/min;设定空气流速为350mL/min。入口设为分裂模式;加热器205。C;压力20psi;总流速14.7mL/min设定烘烤温度起始温度14(TC,起始时间l分钟，温度上升速率12。C/分钟，最终温度205。C维持20分钟。50。C/分钟，最终温度245°C维持5分钟设定注入口温度205°C设定检测器温度235°C六、评估rFIP或GLA的剂量对巨噬细胞存活率的影响RAW264.7巨噬细胞以lxl(T细胞/mL的浓度置入96孔培养板，加入不同浓度IOO、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125ug/mL的rFIP与500、200、100、50、25、10|iM的GLA培养24小时后，弃置培养液，剩下的细胞则进行MTT分析。MTT分析参考Mosmann等人(1983)的方法，MTT原是黄色的水溶性化合物，可被脱氢酶还原成紫色结晶，而当细胞活性高或数目多时，则细胞内脱氢酶活性也越高，细胞内则会有越多紫色的结晶形成。以DMEM将MTT储存液稀释10倍，将经过rFIP或/和GLA处理的细胞，加入55m1/孔MTT溶液，随后将其置37°C、5%0)2的培养箱中培养2小时，移除上清液，再加入100)a1/孔的O.04NHC1/异丙醇以150rpm震荡将色剂溶出，并于室温下避光l小时，最后以ELISA读取540nm的吸光值。试剂配方1)MTT溶液以PBS配置成5mg/mLMTT储存液，再以0.2jum过滤膜过滤，并避光储存；2)酸-异丙醇0.06NHC1溶于异丙醇。七、I.评估rFIP和GLA的剂量对巨噬细胞存活率的影响首先须确定rFIP是否会抑制或毒杀RAW264.7巨噬细胞。将不同浓度的rFIP加入培养基中培养24小时，由MTT分析结果得知rFIP的浓度《10jig/mL时无显著的细胞毒性(图2)。不同浓度的GLA(10-500jliM)加入RAW264.7巨噬细胞培养24小时，观察其GLA对巨噬细胞的毒性。在MTT分析结果中得知GLA的浓度《100yM时并无显著的细胞毒性(图3)。II.利用脂肪酸分析方法来评估rFIP或rFIP+GLA对RAW264.7巨噬细胞的A5-去饱和酶的去饱和作用的影响l.rFIP对RAW264.7巨嗟细胞脂肪酸组成的影响将浓度为lxlO'细胞/ml的巨噬细胞种入含有培养液的组织培养亚中，培养于37。C含有5。/。c02的培养箱，待细胞贴附4小时后，再加入IOg/mL的rFIP,培养24小时后，以上述第四项的步骤萃取细胞的脂肪酸并进行分析。结果如表1所示，rFIP对于巨噬细胞的脂肪酸组成并没有造成显著的影响。表1rFIP对于巨噬细胞的脂肪酸组成的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>由于A5-去饱和作用是将DGLA转变为ARA，我们将DGLA的浓度固定为25^M与100^M,与不同浓度(2.5,5,10,20|ig/mL)的rFIP加入细胞的培养液中，培养24小时，再以上述第四项的步骤萃取细胞的脂肪酸并进行分析。2.不同浓度的rFIP对RAW264.7巨噬细胞的A5-去饱和作用(DGLA—ARA)、DGLA与ARA的影响从图4上可以清楚的看出，细胞脂肪酸的组成在加入了100M的DGLA与不同浓度(2.5，5，10&20g/ml)的rFIP培养之后，ARA的量逐渐降低；相对地，DGLA的量则增加。同时若计算并比较A5-去饱和作用的转换率气可以看到转换率由26.2%降至17.4%。*转换率的公式([ARA]/([ARA]+[DGLA])}x100%图5和图4的内容相似，只是将100M的DGLA的浓度降为25M。观察是否可以得到相似的结果。从结果发现，与图4的实验结果极为相似ARA的量逐渐降低;DGLA的量则上升。A5-去饱和作用的转换率也从66.8。/。降至48.3%。从图4与图5可以发现rFIP可以抑制A5-去饱和作用(DGLA—ARA)，而且抑制的能力随着rFIP浓度的增加而增加；同时rFIP也会影响细胞内DGLA与ARA的含量。3.不同浓度的GLA与rFIP对RAW264.7巨噬细胞的A5-去饱和作用(DGLA—ARA)、DGLA与ARA的影响由于GLA会经由巨噬细胞的延伸酶作用而转变为DGLA，所以本实验不必再外加DGLA。固定rFIP的浓度为10pg/mL,然后分别加入不同浓度的GLA(12.5,25,50,100joM)，培养24小时后，以上述第四项的步骤萃取细胞的脂肪酸并进行分析。由图6的结果可以看出，细胞生长在一般的培养基只含有少量的n-6PUFA，所以细胞生长在培养基内所产生的DGLA与ARA就偏低(0pM);但是当GLA开始加入之后(12.5pM),DGLA与ARA的量就开始上升。GLA浓度不断上升后，因为rFIP会抑制A5-去饱和作用，ARA的量就不再上升，反而开始下降(50一)；而DGLA的量却继续增加。等到lOOpM时，ARA的量持续往下降，但DGLA仍然上升。使两种脂肪酸的量差距变大。除此之外，rFIP+GLA的配方也使得A5-去饱和作用的转换率从88.0。/。降至30.4%。所以rFIP+GLA可以增加体内DGLA的含量，抑制ARA的含量，并抑制A5-去饱和作用(DGLA—ARA)。*转换率的7>式{[ARA]/([ARA]+[DGLA])}x100%本发明的真菌免疫调节蛋白可制成具有完整细胞的酵母菌，可以直接以口服方式施用并可以在生物体中发挥生物活性，不用任何纯化的步骤，从而减少生产上的成本。本发明提供有关纯化的真菌免疫调节蛋白或含真菌免疫调节蛋白宿主细胞的服用途径。服用方式可以是用静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、口服、经黏膜层吸收、皮肤接触吸收或以浸泡于液体中的形式或其它可应用的药物传递路径。而其中以口服应用方式为优先考虑方法。本发明提供的纯化的真菌免疫调节蛋白或含真菌免疫调节蛋白宿主细胞可以广泛使用于哺乳类、鱼类、曱壳类及畜产、家禽类。这里所指的哺乳类及家禽类为猪、鸡。所指鱼类是石斑鱼、鲑鱼、鳟鱼。所指曱壳类是虾、龙虾、草奸、斑节奸、白奸。本发明应用在淡水或海水动物，如鱼类时，也可以浸泡在含有灵芝免疫调节蛋白的液体中，通过鳃吸附到鱼体内。本发明提供口服包含本发明真菌免疫调节蛋白组合物的应用而达到免疫调节的功能。此灵芝免疫调节蛋白可以是从灵芝制备出来或从大肠杆菌(Aco//,或真菌例如面包酵母菌(&rcw/cei1cerer/i7aej制备获得。权利要求1.真菌免疫调节蛋白在抑制Δ5-去饱和酶中的应用。2.如权利要求l所述的应用，其中该抑制A5-去饱和酶活性是用于预防或治疗由厶5-去饱和酶、花生四烯酸、或发炎性类二十酸的浓度失调所引发的慢性或急性发炎反应、发炎症状或发炎疾病。3.如权利要求2所述的应用，其中所述发炎疾病为气喘、动脉硬化、肥胖、糖尿病、肠胃疾病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、心血管疾病、关节炎、骨质疏松、牙周病、癌症及自体免疫性疾病、过敏、类风湿关节炎、月经痛或痛风。4.如权利要求l所述的应用，其中所述真菌免疫调节蛋白为灵芝免疫调节蛋白或金针菇免疫调节蛋白。5.如权利要求2所述的应用，其中所述预防或治疗发炎反应、发炎症状或发炎疾病是通过抑制A5-去饱和酶的作用，并减少花生四烯酸的浓度，进而降低发炎性类二十酸的浓度来实现的。6.如权利要求1所述的应用，进一步包括应用Y-亚麻酸。7.如权利要求6所述的应用，其是用于预防或治疗由A5-去饱和酶、花生四烯酸或发炎性类二十酸的浓度失调所引发的发炎反应、发炎症状或发炎疾病。8.如权利要求6所述的应用，其中所述真菌免疫调节蛋白为灵芝免疫调节蛋白或金针菇免疫调节蛋白，且所述Y-亚麻酸来自于植物或微生物食品的萃取物。9.如权利要求7所述的应用，其中所述发炎疾病为气喘、糖尿病、肠胃疾病、心血管疾病、关节炎、骨质疏松、牙周病、癌症、自体免疫性疾病、过敏、类风湿关节炎、月经痛或痛风的发炎疾病。10.如权利要求7所述的应用，其中所述预防或治疗发炎反应为以下两种成分的作用机制的加成效果(a)通过真菌免疫调节蛋白抑制A5-去饱和酶的作用，并减少花生四烯酸的浓度，进而降低发炎性类二十酸的浓度，及(b)Y-亚麻酸可以转变为二高-Y-亚麻酸并增加其浓度，大量形成抗发炎性类二十酸的浓度。全文摘要本发明提供真菌调节免疫蛋白抑制Δ5-去饱和酶的新用途，通过抑制Δ5-去饱和酶活性，可预防或治疗由Δ5-去饱和酶、花生四烯酸、或发炎性类二十酸的浓度失调所引发的慢性或急性发炎反应、发炎症状或发炎疾病。特别地，在使用该真菌调节免疫蛋白时，同时应用γ-亚麻酸，抑制Δ5-去饱和酶的效果更佳。所述真菌免疫调节蛋白优选灵芝免疫调节蛋白或金针菇免疫调节蛋白。文档编号A61K38/16GK101376020SQ20071014722公开日2009年3月4日申请日期2007年8月29日优先权日2007年8月29日发明者庄路德,杨乾隆,陈子智,黄永胜申请人:益生生技开发股份有限公司