分离的哺乳动物膜蛋白基因和相关试剂的制作方法

专利名称：分离的哺乳动物膜蛋白基因和相关试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及与在淋巴细胞，例如，在免疫系统中起作用的细胞中发现的基因有关的组合物。这些基因在控制哺乳动物免疫系统的发育、分化和/或生理中起作用。具体地，本申请提供了核酸、蛋白质、抗体，和使用它们的方法。
背景技术：
哺乳动物循环系统的循环组分包括各种细胞类型，包括红细胞和骨髓细胞谱系的红细胞和白细胞。见，例如，Rapaport(1987)Introduction to Hematology(第二版)Lippincott，Philadelphia，PA；Jandl(1987)BloodTextbook of Hematology，Little，Brown和同事，Boston，MA.；和Paul(编者，1998)Fundamental Immunology(第四版)Raven Press，N.Y。
树突细胞(DC)是抗原加工或呈递细胞，并且被发现于身体的所有组织。可将它们分成各种类别，包括心脏、肾、内脏和肺的间质树突细胞；肾和粘膜中的朗格汉斯细胞；胸腺髓质和次级淋巴组织中的交错树突细胞；和血液和淋巴树突细胞。尽管这些隔室的每一种中的树突细胞都是表面上来自骨髓的CD45+白细胞，但是它们显示出与成熟状态和微环境有关的差异。
这些树突细胞将抗原有效加工并呈递到例如，T细胞。它们刺激次级淋巴器官的副皮质区中幼稚和记忆T细胞的应答。有证据证明树突细胞在诱导耐受性中的角色。
初级和次级B细胞滤泡含有滤泡树突细胞，其捕获并长时间保留完整抗原作为免疫复合体。这些树突细胞将天然抗原呈递给B细胞并且可能参与抗原的亲和性成熟、免疫记忆的产生和体液免疫应答的维持。
单核细胞是巨噬细胞性细胞，它们属于单核巨噬细胞体系并停留在循环中。见Roitt(编者)Encyclopedia of ImmunologyAcademicPress，San Diego这些细胞起源于骨髓并且一旦它们分化仅在髓隔室中短时间保留。然后它们进入循环并可以保持相对长的时间，例如，几天。单核细胞通过所称作的血细胞渗出过程可以进入组织和体腔，在那里它们分化成巨噬细胞并可能分化成树突细胞。在炎症反应中，循环中单核细胞数可以倍增，并且许多数量增加的单核细胞渗出到炎症部位。
抗原呈递指一种细胞事件，其中蛋白质抗原被摄入，被抗原呈递细胞(APC)加工，然后被识别而引起免疫应答。最具活性的抗原呈递细胞已经被鉴定为巨噬细胞(它们是单核细胞的直接发育产物)、树突细胞，和某些B细胞。
在多数组织中发现巨噬细胞并且它们在各种蛋白质抗原和微生物的内化中具有高度活性。它们具有高度发育的内吞活性，并且分泌对免疫应答的启动重要的许多产物。因为该原因，认为被单核细胞表达或者被单核细胞活化诱导的许多基因对于抗原摄入、加工、呈递或所导致的免疫应答的调节是重要的。
然而，树突细胞和单核细胞在它们所表达的蛋白质和许多它们的功能和作用机理，包括它们的活化状态方面都没有被良好表征。具体地，与免疫应答的启动(包括抗原加工和呈递)相关的过程和机理仍然不清楚。缺乏关于这些细胞的结构、生物学和生理学性质的知识限制了对它们的理解。从而，当医学病症中的抗原呈递细胞的调节、发育或生理不寻常时，仍然难以处理这些医学病症。
序列标识符描述SEQ ID NO1是灵长类SDCMP3 C-凝集素家族基因核苷酸序列。
SEQ ID NO2是灵长类SDCMP3 C-凝集素家族基因多肽序列。
SEQ ID NO3是啮齿类SDCMP3 C-凝集素家族基因核苷酸序列。
SEQ ID NO4是啮齿类SDCMP3 C-凝集素家族基因多肽序列。
SEQ ID NO5是灵长类SDCMP4长C-凝集素家族基因核苷酸序列。
SEQ ID NO6是灵长类SDCMP4长C-凝集素家族基因多肽序列。
SEQ ID NO7是灵长类SDCMP4短C-凝集素家族基因核苷酸序列。
SEQ ID NO8是灵长类SDCMP4短C-凝集素家族基因多肽序列。
SEQ ID NO9是全长人SDCMP3核苷酸序列。
SEQ ID NO10是全长人SDCMP3多肽序列。
发明概述本发明部分基于发现了各种哺乳动物Schering树突细胞膜蛋白(SDCMP)基因。分布数据表明了更广的细胞分布，结构数据提出了某些功能，并且通过特定SDCMP3和SDCMP4实施方案例证。SDCMP3和4显示了与凝集素和脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)类的相似性。本发明包括基因产物的激动剂和拮抗剂，例如，天然序列的突变(突变蛋白)、融合蛋白、化学模拟物、抗体，和其他结构或功能类似物。还涉及编码本发明蛋白质的分离的基因。还提供了这些不同蛋白质或核酸组合物的各种用途。
本发明提供了分离的结合组合物，其特异结合含有SEQ ID NO2、4、6、8、或10的多肽。在一些实施方案中，结合组合物是抗体或其抗体结合片段。通常，抗体结合片段是a)Fv片段；b)Fab片段；或c)Fab2片段，抗体是a)多克隆抗体；b)单克隆抗体；或c)人源化抗体。
本发明还提供了使用结合组合物的方法，该方法包括将结合组合物与含有抗原的样品接触形成结合组合物抗原复合体。在额外的实施方案中，样品是生物样品，包括体液；样品是人；抗原在细胞上；抗原被进一步纯化；或者方法提供抗原的空间定位或分布。
还提供了检测试剂盒，其含有结合组合物和a)关于试剂盒中试剂的使用或处理的使用说明材料；或b)隔室，其使得结合组合物或试剂盒的其他试剂分开。
本发明包括基本上纯的或分离的多肽，该多肽特异结合结合组合物。该多肽含有SEQ ID NO2、4、6、8或10。还提供了使用该多肽的方法，该方法包括将该多肽与抗体在适宜条件下接触以形成抗体多肽复合体。另一实施方案是检测试剂盒，该试剂盒含有多肽和a)关于试剂盒中试剂的使用或处理的使用说明材料；或b)隔室，其使得该多肽或试剂盒的其他试剂分开。
本发明提供了分离或纯化的编码结合该结合组合物的多肽的核酸。在另一实施方案中，该核酸含有SEQ ID NO1、3、5、7或9。
还包括分离或纯化的核酸，其在严格条件下与编码结合该结合组合物的多肽的核酸杂交。在另一实施方案中，本发明提供了含有该核酸的表达载体和宿主细胞。通常，该宿主细胞是a)哺乳动物细胞；b)细菌细胞；c)昆虫细胞；或d)酵母细胞。本发明还包括制备多肽的方法，该方法包括将宿主细胞在适宜条件下培养以表达该多肽和纯化该多肽。
本发明提供了调节树突细胞生理或功能的方法，该方法包括将细胞与SEQ ID NO2、4、6、8、或10的激动剂或拮抗剂接触。在另一实施方案中，拮抗剂是抗体。在另一实施方案中，接触是与抗原(包括细胞表面抗原、MHC I类或MHC II类抗原)相联合。
详述此处所引用的所有参考文献都被相同程度地并入作为参考，就像为了所有目的每个单独出版物或专利申请被特别和单独地指出被完整并入作为参考一样。
I.概要本发明提供了编码在树突细胞(DC)上表达的哺乳动物蛋白的DNA序列。关于树突细胞综述，见Steinman(1991)Annual Review ofImmunology9271-296；和Banchereau和Schmitt(编者，1994)Dendritic Cells in Fundamental and Clinical ImmunologyPlenumPress，NY。这些蛋白质被称为树突细胞蛋白质是因为它们在这些细胞上被发现并且它们的表达似乎表现出一定的特异性。
下面提供了这些蛋白质的特定人实施方案。下面的描述涉及(为了示例的目的)人DC基因，但是同样可应用于来自其他来源或哺乳动物种类的结构(例如序列)相关的实施方案，包括多态性变体或个体变体。这些蛋白包括，例如，在序列上显示出相对少的改变，例如，少于约5％，和数目上相对少的改变，例如，少于20个残基置换，通常少于15，优选少于10，更优选少于5个置换，包括4、3、2、或1个置换的蛋白质。这些蛋白质还包括如所描述的从全长截断的形式，和含有这些序列的实质片段的融合蛋白。
II.定义术语“结合组合物”指特异结合这些DC蛋白的分子(例如，在抗体-抗原相互作用中)。其他化合物，例如，蛋白质，也可以特异结合各自蛋白。通常，特异结合将是天然的生理上相关的蛋白质-蛋白质相互作用(共价或非共价)，并且可以包括多蛋白质复合体的成员，包括载体化合物或二聚体配偶体。该分子可以是聚合物，或化学试剂。功能类似物可以是具有结构修饰的蛋白质，或者可以是完全不相关的分子，例如，该分子的分子形状与适宜的相互作用决定簇相互作用。变体可以作为蛋白质的激动剂或拮抗剂。见例如，Goodman，等人(编者)(1990)Goodman和Gilman′sThe Pharmacological Bases ofTherapeutics(第八版)Pergamon Press，Tarrytown，N.Y。
如此处所用的，术语“结合剂DC蛋白复合体”指结合剂和DC蛋白的复合体。结合剂的特异结合指结合剂具有特异结合部位，该结合部位识别各自DC蛋白上的位点。例如，针对DC蛋白产生并识别该DC蛋白上的表位的抗体能够通过特异结合形成抗体DC蛋白复合体。通常，结合剂DC蛋白复合体的形成使得可以测量其他蛋白质和生物产品的混合物中的DC蛋白。术语“抗体DC蛋白复合体”指结合剂DC蛋白复合体，其中结合剂是抗体。抗体可以是单克隆的、多克隆的或者甚至是抗体的抗原结合片段，例如，包括Fv、Fab或Fab2片段。
“同源”核酸序列当被比较时显示出显著的相似性。核酸中同源性的标准是或者通过序列比较和/或种系发生关系，或者基于杂交条件测量的本领域一般使用的同源性。下面更详细的描述了杂交条件。
“分离的”核酸是一种核酸，例如，RNA、DNA或混合的聚合物，其与其他组分基本上分开，该其他组分天然地伴随着天然序列，例如，来自最初物种的蛋白质和侧翼基因组序列。该术语包括已经从其天然发生的环境除去的核酸序列，还包括重组或克隆的DNA分离物和化学合成的类似物或通过异源系统生物合成的类似物。基本上纯的分子包括分子的分离形式。分离的核酸将通常是分子的同源组合物，但是将在一些实施方案中含有微小的异质性。该异质性通常发现于聚合物末端或者对于所希望的生物学功能或活性不关键的部分。
如此处所用的，术语“SDCMP3蛋白”当用于蛋白质语境中时将包括具有如SEQ ID NO2、4或10中所示的氨基酸序列的蛋白质或者这种蛋白质的重要片段。该术语指与各自SDCMP3蛋白质特异结合组分相互作用的多肽。这些结合组分，例如，抗体，通常以高亲和性(例如，至少约100nM，通常高于约30nM，优选高于约10nM，更优选高于约3nM)结合SDCMP3蛋白。类似地，术语SDCMP4将关于SEQ ID NO6或8应用。
如此处所用的术语“多肽”或“蛋白质”包括蛋白质的重要片段或节段，并且包括一段氨基酸残基，其至少约8个氨基酸，通常至少10个氨基酸，更通常至少12个氨基酸，通常至少14个氨基酸，更通常至少16个氨基酸，典型地至少18个氨基酸，更典型地至少20个氨基酸，通常至少22个氨基酸，更通常至少24个氨基酸，优选至少26个氨基酸，更优选至少28个氨基酸，并且在尤其优选的实施方案中，至少约30个或更多氨基酸，例如，35、40、45、50、60、70个氨基酸等。
“重组”核酸通常由其结构定义。其可以是通过将非天然相邻的两个片段融合产生序列而得到的核酸，但是排除天然产物，例如，天然发生的突变形式。
某些形式由产生的方法定义。关于此，例如，通过一种方法产生的产物，该方法使用重组核酸技术，例如，包括人为干预核苷酸序列(通常为选择或制备)。
这样，本发明包括，例如，含有使用合成寡核苷酸方法得到的序列的核酸，和通过用编码这些蛋白质的非天然发生的载体转化细胞制备的产物。这通常将一个密码子用编码相同或保守氨基酸的冗余密码子代替，而通常导入或者除去序列识别位点，例如，限制酶的序列识别位点。备选地，将具有所希望的功能的核酸片段连接在一起以产生单一遗传实体，该遗传实体含有所希望的功能的组合，在通常可以得到的天然形式中没有发现该功能组合。限制酶识别位点通常是这些人工操作的靶标，但是其他位点特异靶标，例如，启动子、DNA复制位点、调节序列、控制序列，或其他有用的特征，例如，引物片段，可以通过设计而被掺入。对于重组体，例如，融合多肽，具有类似的概念。特别包括合成的核酸，其通过遗传密码冗余性编码了类似于这些抗原的片段的多肽，和来自各种不同物种变体的序列的融合。
“溶解度”由以Svedberg单位测量的沉降来反映，Svedberg单位是特定条件下分子的沉降速度的量度。沉降速度的确定通常在分析性超速离心机上进行，但是现在通常在标准超速离心机上进行。见，Freifelder(1982)Physical Biochemistry(第二版)Freeman和同事，San Francisco，CA；和Cantor和Schimmel(1980)Biophysical Chemistry，1-3部分，Freeman和同事，San Francisco，CA。作为粗略测定，将含有假定的可溶多肽的样品在标准完全大小的超速离心机中以约50K rpm旋转约10分钟，可溶分子将保留在上清液中。可溶微粒或多肽典型地将小于约30S，更典型地小于约15S，通常小于约10S，更通常小于约6S，并且，在具体实施方案中，优选小于约4S，更优选小于约3S。多肽或片段的溶解度取决于环境和该多肽。许多参数影响多肽溶解度，包括温度、电解质环境、该多肽的大小和分子特征，和溶剂的性质。通常，多肽所用的温度为约4℃到约65℃。通常所用的温度大于约18℃，更通常大于约22℃。对于诊断目的，温度将通常为约室温或更高温度，但是低于测定中组分的变性温度。对于治疗目的，温度将通常为体温，对于人通常约37℃，尽管在某些条件下可以在原位或体外升温或降温。
该多肽的大小和结构将通常处于基本上稳定的生理活性状态，并且通常不处于变性状态。该多肽可以与处于四级结构的其他多肽结合，例如，以赋予可溶性，或者以某种方式与脂质或去污剂结合而接近天然脂质双层相互作用。
溶剂将通常是用于生物学活性的保持的一种类型的生物学相容的缓冲液，并且将通常接近生理溶剂。通常，该溶剂将具有中性pH，通常约5到10，优选约7.5。在一些场合下，将加入去污剂，通常为温和的非变性去污剂，例如，CHS(胆醇烯基半琥珀酸盐)或CHAPS(3-([3-胆酰胺基丙基]二甲基氨)-1-丙磺酸盐)，或者处于足够低的去污剂浓度以便避免对蛋白质结构或生理性质的重大破坏。
“基本纯的”通常指，例如，在蛋白质语境中，该蛋白质与其他污染性蛋白质、核酸、或来自最初来源生物的其他生物制剂分离。纯净，或者“分离”可以由标准方法来分析，通常按重量计，并且将通常至少约50％纯，更通常至少约60％纯，通常至少约70％纯，更通常至少约80％纯，经常至少约85％纯，更经常至少约90％纯，优选至少约95％纯，更优选至少约98％纯，在最优选的实施方案中，至少约99％纯。通常加入载体或赋形剂，或者制剂可以是无菌的或者含有缓冲组分。
在核酸序列比较语境中的“基本相似性”指比较时，片段或它们的互补链当最适对比(具有适宜的核苷酸插入或缺失)时至少约50％的核苷酸相同，通常至少56％，更通常至少59％，通常至少62％，更通常至少65％，通常至少68％，更通常至少71％，典型地至少74％，更典型地至少77％，通常至少80％，更通常至少约85％，优选至少约90％，更优选至少约95到98％或更高，在特定实施方案中，高达约99％或更多的核苷酸相同。备选地，当片段在选择性杂交条件下与链或者其互补序列杂交时，存在基本相似性，杂交所用序列通常来自SEQID NO1、3或9。典型地，当在至少约30个核苷酸的一段序列上有至少约55％相似性，优选至少约25个核苷酸的一段序列上有至少约65％相似性，更优选至少约20个核苷酸的一段序列上有至少约75％和最优选约90％相似性时将发生选择性杂交。见，Kanehisa(1984)Nucl.Acids Res.12203-213。如描述的相似性比较的长度可以在更长序列上，在某些实施方案中将在至少约17个核苷酸，通常至少约20个核苷酸，更通常至少约24个核苷酸，典型地至少约28个核苷酸，更典型地至少约40个核苷酸，优选至少约50个核苷酸，更优选至少约75到100个或更多核苷酸的一段序列上。对SDCMP3比较的测量不反映对SDCMP4的比较测量。
对于序列比较，通常一个序列作为参比序列，受试序列与该参比序列比较。当使用序列比较算法时，将受试和参比序列输入计算机，如果需要，指定序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后序列比较算法基于所指定的程序参数计算相对于参比序列，受试序列的百分数序列同一性。
可以对用于比较的序列实施光学比对，这可以使用例如，Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2482的局部同源性算法，或者Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48443的同源性对比算法、或者Pearson and Lipman(1988)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA852444的方法搜寻相似性，这些算法的计算机化实现(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA，和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)，或者视觉检查(一般见Ausubel，等人，如前)。
有用的算法的一个实例是PILEUP。PILEUP从一组相关序列产生多序列比对，使用渐进性的成对对比来显示相互关系和百分数序列同一性。该算法还绘出树或系统树，其显示用于产生比对的聚类关系。PILEUP使用Feng和Doolittle(1987)J.Mol.Evol.35351-360的渐进性比对方法的简化方法。所用方法类似于Higgins和Sharp(1989)CABIOS5151-153描述的方法。该程序可以比对高达300个序列，每个序列的最大长度为5,000个核苷酸或氨基酸。该多重比对方法以两个最相似的序列的成对比对开始，产生两个比对序列的聚类。然后该聚类与下一个最相关的序列或者比对序列的聚类相比对。通过两个单独序列的成对比对的简单延伸来对比两个序列聚类。通过一系列渐进性、成对比对实现最后的比对。指定特定序列和它们的序列比较区域的氨基酸或核苷酸坐标并指定程序参数后运行该程序。例如，可以将参比序列与其他受试序列比较以确定百分数序列同一性关系，其中使用下面的参数默认缺口权重(3.00)、默认缺口长度权重(0.10)，和加权的末端缺口。
适于确定百分数序列同一性和序列相似性的算法的另一实例是BLAST算法，该算法在Altschul，等人(1990)J.Mol.Biol.215403-410中描述。用于实施BLAST分析的软件可公开通过国家生物技术信息中心(httpwww.ncbi.nhn.nih.gov/)得到。该算法包括通过鉴定查询序列中的长W的短字首先鉴定高得分序列对(HSPs)，该高得分序列对当与数据库序列中的相同长度的字对比时匹配或满足某一正值阈值得分T。T被称为相邻字得分阈值(Altschul，等人，如前)。这些最初邻域字采样作为种子启动搜索以发现含有这些字采样的更长HSPs。只要累积对比得分可以增加，那么将该字采样在两个方向沿着每个序列延伸。当累积对比得分从所实现的最大值下降的量为X；由于一个或多个负得分残基对比的积累，累积得分到达0或以下；或者到达一个序列的末端时，停止字采样在每个方向的延伸。BLAST算法参数W、T和X确定对比的灵敏性和速度。BLAST程序使用的默认值为字长(W)为11、BLOSUM62得分矩阵(见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA8910915)比对(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝4，和两个链的比较。
除了计算百分数序列同一性，BLAST算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析(见，例如，Karlin和Altschul(1993)Proc.Nat′lAcad.Sci.USA905873-5787)。BLAST算法提供了相似性的一个测量是最小和概率(P(N))，其提供了概率的指示，两个核苷酸或氨基酸序列之间的匹配将通过该概率偶然地发生。例如，如果在受试核酸和参比核酸的比较中最小和概率小于约0.1，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001，那么认为该核酸与参比序列相似。
多肽的两个核酸序列基本上相同的另一指示是第一个核酸编码的多肽与第二个核酸编码的多肽免疫学交叉反应，如下述。从而，例如，当两个肽仅通过保守置换而不同时，一种多肽与另一多肽通常基本上相同。两个核酸序列基本上相同的另一指示是两个分子在严格条件下相互杂交，如下述。
“严格条件”当在杂交语境中指同源性或基本相似性时，是盐、温度、有机溶剂和其他参数(通常在杂交反应中受控的参数)的严格的联合条件。参数的联合比任何单一参数的检测更重要。见，例如，Wetmur和Davidson(1968)J.Mol.Biol.31349-370。在严格条件下结合靶核酸的核酸探针对所述靶核酸是特异的。这种探针通常长11个核苷酸以上，并且在该探针的序列所限定的区域上与靶核酸足够相同或互补而在严格杂交条件下结合靶标。通常，阳性信号将显示出比背景高至少2倍信号，优选比背景高至少5倍，更优选至少15、25或甚至50倍。
通过密切相关的物种的种间杂交可以从其他哺乳动物，例如，灵长类或啮齿类物种克隆和分离对应的SDCMP蛋白。见，例如，下文。关系远的物种之间相似性可能相对较低，从而关系相对较近的物种的杂交是可取的。备选地，显示出较小的物种特异性的抗体制剂可用于表达克隆方法。
术语“特异结合抗体”或者“特异免疫反应性”当指蛋白质或肽时，指一种结合反应，其确定在异源蛋白质群体和其他生物学组分的存在下该蛋白质的存在。从而，在所指定的免疫测定条件下，所指定的抗体结合特定蛋白并且不显著结合样品中存在的其他蛋白。在这些条件下对抗体的特异结合可能需要一种抗体，该抗体由于对特定蛋白的特异性而被选中。例如，可以选择针对具有SEQ ID NO2或10中描绘的氨基酸序列的人SDCMP3蛋白免疫原产生的抗体以得到与SDCMP蛋白并且不与其他蛋白质特异免疫反应的抗体。这些抗体识别与同源人SDCMP3蛋白高度相似的蛋白。
III.核酸这些SDCMP基因在树突细胞上选择性表达。如所公开的优选实施方案将用于标准方法中以从其他物种，例如，温血动物，如鸟和哺乳动物分离基因。交叉杂交将允许从个体、株系或种分离相关蛋白。可以利用许多不同方法基于本文提供的信息成功分离适宜的核酸克隆。DNA印迹杂交研究将在适宜的杂交条件下鉴定其他物种中的同源基因。
通过下述标准方法，可以用纯化的蛋白或确定的肽产生抗体。合成肽或纯化蛋白可以被呈递到免疫系统以产生多克隆和单克隆抗体。见，例如，Coligan(1991)Current Protocols in ImmunologyWiley/Greene，NY；和Harlow和Lane(1989)AntibodiesALaboratory ManualCold Spring Harbor Press，NY，它们在此处被并入作为参考。备选地，SDCMP抗原结合组合物可用作特异结合试剂，并且可以利用其结合特异性用于，例如，纯化SDCMP蛋白。
特异结合组合物可用于筛选表达文库，该表达文库由表达各自SDCMP蛋白的细胞系制备。可以利用许多筛选方法，例如，表面表达的配体的标准染色，或者通过淘选。通过各种染色或免疫荧光方法也可以实施细胞内表达的筛选。结合组合物可用于亲和纯化或筛选表达该抗原的细胞。
序列分析表明这些SDCMPs是受体的凝集素/脱唾液酸糖蛋白超家族的成员。也见USSN 60/053,080，其在此处被并入作为参考。
对人SDCMP3的分析表明该蛋白是II型膜蛋白，跨膜片段为SEQ IDNO2或10的约残基22到约t42。胞质尾部将在N末端，SEQ ID NO2或10的残基1到21。C-型凝集素(CRD)结构域相应于SEQ ID NO10的约残基79到219。CRD的特点是在SEQ ID NO10的107、176、194和202位的4个保守半胱氨酸残基。此外，CRD具有相应于SEQ ID NO10的168-170残基的谷氨酸-脯氨酸-天冬酰胺序列，该序列预示着甘露糖、N-乙酰基葡糖胺和其他相关糖的依赖Ca++的结合部位。
人蛋白的预测分子量为约18,500道尔顿，等电点为约6，在pH7下的电荷为约-2.6。亲水性分析表明亲水性序列的重要节段为约1-22、42-63、94-106和142-162。这些节段可能更具抗原性。对小鼠SDCMP3的类似分析表明该蛋白也是II型跨膜蛋白，跨膜节段为约ser20到thr40。细胞质尾将从约met1到trp19；C-型凝集素结构域将相应于约cys79到至少arg162。两个假定的N-糖基化部位相应于asn131-ser133和asn183-ser185。通过计算机鉴定的人蛋白的尤其具有抗原性的一段序列为约met1-ser18；tyr43-arg53；lys72-ser85；ser94-asn106；和ser135-arg162。见，例如，Beattie，等人(1992)Eur.J.Biochem.21059-66。
对人SDCMP4的分析表明该蛋白是II型膜蛋白。其有两种形式长形式(SEQ ID NO5和6)和短形式(SEQ ID NO7和8)，其相应于长形式的缺失，并且可以从备选的剪接事件得到。序列中分类的变异可以反映测序错误或等位基因变体。
长形式的预测的跨膜节段为约leu45到met67。该蛋白的近氨基部分将在细胞质内。通过计算机鉴定的人蛋白的尤其具有抗原性的一段序列为约met1到arg44；trp70-thr113；和asn139到cys220。一个值得注意的特征是基序(YTQL，残基14-17)向胞质内结构域的内化。CRD将从长形式的约cys120到met247延伸，从短形式的约cys74到met201延伸。将预测长形式的分子量为约27.6kD，短形式为约22.5kD，其理论等电点为约4.6，在pH 7下电荷为-7.8。
SDCMP5蛋白质的细胞外结构域含有一个C-型(Ca++独立的)凝集素碳水化合物识别结构域(CRD)，这通过与其他凝集素的显著序列同源性所指出。II型跨膜C-型凝集素的原型是肝脱唾液酸糖蛋白-受体(ASGPR)。
肝ASGPR的CRD表现出对半乳糖的结合特异性。此外，ASGPR的细胞内结构域具有基于酪氨酸的基序，其使得配体内化。不像ASGPR或者巨噬细胞甘露糖受体，SDCMP4的CRD序列并不强烈暗示其糖特异性。这种暗示的缺乏也是其他C-型凝集素的特征，如通过NK细胞上的NGK2受体所例证的。
两种具体SDCMP4的胞内结构域都显示出YXXΦ型的内化序列(YTQL)，其中Φ代表疏水氨基酸。作为参照，肝脏ASGPRH1链的内化基序是YQDL。
值得注意的是，一些II型跨膜C-型凝集素(例如，人NKG2和DC-IR，小鼠Ly49和NKRP1)是免疫受体超家族(IRS)系统的成员。这些受体的一些形式能够通过胞内ITIM基序递送抑制信号。相反，其他形式缺少ITIM基序，并且同样不传输负信号。这种非抑制性IRS成员的一个标志是在跨膜区内存在带电氨基酸。备选地，截断形式可以与跨膜附属分子相互作用。见，例如，Lanier，等人，(1998)Nature391703-7；和USSN 60/069,639，它们都在此处被并入作为参考。
SDCMP4既不在其胞内结构域中显示出ITIM基序，也没有带电的跨膜残基。基于此，似乎SDCMP4不可能定义C型凝集素IRS基因的新家族。相反，可以认为SDCMP4与参与配体内化的分子的ASGPR系统有关。
已经鉴定了两种形式的SDCMP4，它们的区别是在胞外结构域中存在46个氨基酸近膜插入片段。在该区域的插入也在巨噬细胞和树突细胞(ETA10)ASGPR中发生。
最后，通过RT-PCR在骨髓细胞(树突细胞、单核细胞，和粒细胞)中已经观察到SDCMP4的表达。与SDCMP3相比，被PMA和离子霉素活化后DC中SDCMP4的表达不被下调。
与这些序列相近的序列是ETA10序列。见，例如，Suzuki，等人(1996)J.Immunol.156128-135；和Sato，等人(1992)J.Biochem.111331-336。细胞外结构域表现出许多特征，这些特征表明该结构域是C型(Ca++依赖的)碳水化合物识别结构域(CRD)。尽管人形式的CRD似乎在其羧基末端被截断，但是小鼠同系物(1469D4)的CRD未被截断并且明确地将该凝集素分类为C-型超家族的一个新成员。
C型跨膜II型凝集素的原型是肝脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)。然而，ASGPR含有胞质内基于酪氨酸的配体内化序列，该序列在人或小鼠SDCMP3中均未发现。编码人SDCMP3的基因定位于染色体12 p12-13，例如，人NK受体复合体中。值得注意地，该区域包括NKG2基因和CD94基因，这些基因编码C型跨膜II型凝集素并且代表免疫受体超家族(IRS)系统的实例。从而，杀伤细胞抑制受体(KIR)CD94-NKG2A/B异二聚体通过NKG2序列中细胞内基于酪氨酸的ITIM基序转导负信号。然而，NKG2的另一种形式缺少ITIM基序，并且用CD94产生的异二聚体无抑制性。
人SDCMP3的细胞内结构域不含有ITIM基序。然而，基于其染色体定位，以及其与IRS基因DC-IR的显著(36.2％)同源性，预测人SDCMP3是IRS基因的新型C型凝集素家族。由于与其他IRS基因类似，所以SDCMP3可能代表一个基因家族，该家族将含有一些成员，这些成员有抑制(ITIM)或者无抑制功能。
通过RT-PCR，将灵长类SDCMP3表达限制在骨髓细胞中，该表达在树突细胞(DC)、单核细胞和巨噬细胞中观察到。选择性地在CD14-衍生的DC而没有在CD1a-衍生的朗格汉斯型DC中看到表达。最后，用PMA与离子霉素激活可以下调SDCMP3的表达。
该肽节段也可用于设计和产生适宜的寡核苷酸用以筛选文库而确定类似基因，例如，相同或多态性变体的存在，或者鉴定DC。遗传密码可用于选择适宜的寡核苷酸以用作筛选的探针。与聚合酶链式反应(PCR)技术联合，合成的寡核苷酸将用于从文库选择所希望的克隆。
互补序列将也可以用作探针或引物。基于可能的氨基末端的鉴定，其他肽将尤其有用，例如，与锚定载体或者多聚A互补PCR技术或者与其他肽的互补DNA偶联。
关于编码这些DC蛋白的基因的核酸操作的技术，例如，将编码多肽的核酸序列亚克隆到表达载体、标记探针、DNA杂交等一般在Sambrook，等人(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual(第二版)卷1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor Press，NY中描述，其在此处被并入作为参考并且在下文中被称为“Sambrook，等人”。还见，Coligan，等人(1987和定期增刊)Current Protocols in Molecular BiologyGreene/Wiley，New York，NY，将其称为“Coligan，等人”。
有各种方法可用于分离编码这些DC蛋白的DNA序列。例如，使用标记的寡核苷酸探针从基因组或cDNA文库分离DNA，该探针具有与此处公开的序列相同或互补的序列。可以使用全长探针，或者通过将所公开的序列与其他蛋白相比较并选择特异引物产生寡核苷酸探针。这些探针可直接用于杂交测定中以分离编码DC蛋白的DNA，或者可以设计探针以用于扩增技术如PCR，用以分离编码DC蛋白的DNA。
为了制备cDNA文库，从表达DC蛋白的细胞分离mRNA。从mRNA制备cDNA并将其连接到重组载体。将该载体转染到重组宿主中以增殖、筛选和克隆。制备和筛选DNA文库的方法是熟知的。见Gubler和Hoffman(1983)Gene 25263-269；Sambrook，等人；或Coligan，等人。
对于基因组文库，可以从组织提取DNA并将其机械剪切或用酶消化以产生约12-20kb的片段。然后将片段通过梯度离心并克隆到λ噬菌体载体中。这些载体和噬菌体在体外包装，如，例如，Sambrook，等人，或Coligan等人中描述的。通过Benton和Davis(1977)Science196180-182中描述的噬菌斑杂交分析重组噬菌体。通常如在例如，Grunstein，等人(1975)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 723961-3965中描述的实施菌落杂交。
可以在cDNA或基因组文库中鉴定编码DC蛋白的DNA，这可通过该DNA能够在例如，菌落或噬菌斑杂交实验中与此处描述的核酸探针杂交进行鉴定。通过本领域中技术人员熟知的标准方法分离相应DNA区域。见Sambrook等人。
扩增靶序列的各种方法，如聚合酶链式反应，也可用于制备编码DC蛋白的DNA。聚合酶链式反应(PCR)技术被用于从mRNA、cDNA和从基因组文库或cDNA文库直接扩增这些核酸序列。分离的编码DC蛋白的序列也可用作PCR扩增的模板。
在PCR技术中，合成与所要扩增的DNA区域中的两个5’区互补的寡核苷酸引物。然后使用这两种引物实施聚合酶链式反应。见Innis，等人(编者1990)PCR ProtocolsA Guide to Methods andApplicationsAcademic Press，San Diego，CA。如所希望的，可以选择引物扩增编码所选全长DC蛋白的完整区域或者扩增更小的DNA片段。具体地，所提供的序列提供了例如，15-30个核苷酸的引物，这些引物可用于扩增所希望的编码序列，或者其片段。一旦这些区域被PCR扩增，可以对它们测序并用标准技术从所得序列制备寡核苷酸探针。然后用这些探针分离编码DC蛋白的其他形式的DNA。
根据首先由Beaucage和Carruthers(1983)Tetrahedron Lett.221859-1862描述的固相亚磷酰胺三酯方法或者使用如Needham-VanDevanter，等人(1984)Nucleic Acids Res.126159-6168中描述的自动化合成仪化学合成用作探针的寡核苷酸。通过例如，非变性丙烯酰胺凝胶电泳或通过如Pearson和Regnier(1983)J.Chrom.255137-149中描述的离子交换HPLC实施寡核苷酸纯化。使用Maxam和Gilbert在Grossman和Moldave(编者1980)Methods inEnzymology65499-560 Academic Press，New York中的描述的化学降解方法可以验证合成的寡核苷酸的序列。
本发明提供了编码DC蛋白的分离的DNA或片段，如所述。此外，本发明提供了分离的或重组DNA，其编码生物活性蛋白或者多肽，该DNA在适宜条件例如，高严格条件下能够与此处描述的DNA序列杂交。所述生物活性蛋白或者多肽可以是天然发生的形式，或者重组蛋白或片段，并且具有如SEQ ID NO2、4、6、8或10中公开的氨基酸序列。优选实施方案将是全长天然分离物(例如，来自灵长类的分离物)。在糖基化形式中，该蛋白将显示出更大的大小。此外，本发明包括使用分离的或重组DNA，或者其片段，该DNA或者该片段编码与每种各自DC蛋白同源的蛋白。这些SDCMP3和4的片段与抗-CD3抗体联合可以共刺激细胞，例如，树突细胞或T细胞。该活化可以与抗原联合。所分离的DNA可以在5’和3’侧翼中具有各自调节序列，例如，启动子、增强子、多聚A加入信号，等等。
本发明包括DC多核苷酸序列，该序列与在正常细胞中的表达相比可以以改变的方式表达，因此，可能设计针对这些序列的适宜的治疗或诊断技术。从而，当一种失调与DC核酸的表达相关时，可以使用在翻译水平上干扰DC表达的序列。该方法利用了，例如，反义核酸，包括导入双链RNA(dsRNA)以遗传干扰基因功能，如例如，在Misquitta，等人(1999)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA961451-1456中描述，和核酶以阻断特定DC mRNA的翻译。这些失调包括与表达错误调节相关的失调。
反义核酸是DNA或RNA分子，例如，至少与特定mRNA分子的一部分互补的寡脱氧核糖核苷酸，见Weintraub(1990)ScientificAmerican26240-46。寡脱氧核糖核苷酸能够以可饱和的、序列独立的，和温度与能量独立的方式进入细胞。见，例如，Jaroszewski和Cohen.(1991)Advanced Drug Delivery Reviews6235-250；Akhtar，等人(1992)“反义寡核苷酸的生物稳定性和膜转运性质的药学方面”，133-145页，Erickson和Izant(编者)Gene RegulationBiology of Antisense RNA and DNARaven Press，New York；和Zhao，等人(1994)Blood 843660-3666。
已经表明一些免疫细胞，例如，淋巴细胞中寡脱氧核糖核苷酸的摄入受到细胞活化的调节。用B细胞有丝分裂原LPS刺激的脾细胞显著增强了B细胞群体中寡脱氧核糖核苷酸摄入，而用T细胞有丝分裂原ConA处理的脾细胞表现出T但不是B细胞增加的寡脱氧核糖核苷酸摄入。见，例如，Krieg，等人，(1991)Antisense Research andDevelopment1161-171。
使用反义方法抑制基因的体外翻译是本领域中熟知的。见，例如，Marcus-Sakura(1988)Anal.Biochem172289-295；和Akhtar(编者1995)Delivery Strategies for AntisenseOligonucleotideTherapeuticsCRC Press，Inc。
核酶是能够以类似于DNA限制性内切酶的方式特异切割其他单链RNA的RNA分子。通过编码这些RNA的核苷酸序列的修饰，可以工程化分子，这些分子特异识别RNA分子中的特定核苷酸序列并将其切割。见，例如，Cech(1988)J.Amer.Med.Assn.2603030-3034。该方法的一个主要优点是因为它们是序列特异的，所以仅具有特定序列的mRNA被失活。
有两种基本类型的核酶，即，四膜虫型和“锤头”型。见，例如，Haseloff(1988)Nature334585-591。四膜虫型核酶识别长为4个碱基的序列，而“锤头”型核酶识别长为11-18个碱基的碱基序列。识别序列越长，该序列仅在靶mRNA种类中发生的可能性越大。因此，锤头型核酶比四膜虫型核酶优选用于失活特定mRNA种类，并且18碱基识别比更短的识别序列优选。
IV.制备DC基因产物通过化学合成、筛选cDNA文库，或者通过筛选从各种细胞系或组织样品制备的基因组文库可以得到编码这些DC蛋白或其片段的DNA。
这些DNA可以在各种宿主细胞中表达以合成全长蛋白或片段，该全长蛋白或片段可以，例如，用于产生多克隆或单克隆抗体；用于结合研究；用于构建和表达修饰分子；和用于结构/功能研究。这些DC蛋白或它们的片段的每一种都可以在用适宜的表达载体转化或转染的宿主细胞中表达。这些分子可被基本上纯化而没有蛋白质或细胞污染物，不同于从重组宿主得到的那些分子，并且因此当与药学上可接受的载体和/或稀释剂组合时可用于药物组合物。该抗原，或者其部分可以作为与其他蛋白的融合蛋白表达。
表达载体通常是自身复制的DNA或RNA构建体，其含有所希望的DC基因或其片段，该DC基因或其片段通常与适宜的遗传控制元件可操作地连接，这些遗传控制元件在适宜的宿主细胞中被识别。这些控制元件能够在适宜宿主中实现表达。实现表达所需的控制元件的特定类型将取决于所用的最终宿主细胞。通常，遗传控制元件可以包括原核启动子系统或真核启动子表达控制系统，并且通常包括转录启动子，和任选操纵子用以控制转录的开始，转录增强子用以升高mRNA表达水平，编码适宜的核糖体结合部位的序列，和终止转录和翻译的序列。表达载体通常还含有复制原点，其允许载体独立于宿主细胞复制。
本发明的载体含有编码各种DC蛋白的DNA，或其片段，通常编码例如，生物活性多肽，或蛋白。该DNA可处于病毒启动子的控制下并且可以编码选择标记。本发明还涉及这些表达载体的用途，该载体能够在原核或真核宿主中表达编码DC蛋白的真核cDNA，其中该载体与宿主相容并且其中编码该蛋白的真核cDNA被插入到载体中，从而含有该载体的宿主的生长表达所述cDNA。通常，设计表达载体以在它们的宿主细胞中稳定复制或者扩增而极大地增加每个细胞所希望的基因的拷贝总数。不必总是要求表达载体在宿主细胞中复制，例如，使用不含有被宿主细胞识别的复制原点的载体可以实现在各种宿主细胞中该蛋白质或其片段的瞬时表达。可能使用载体，该载体通过重组导致DC基因或其片段整合到宿主DNA中，或者整合启动子，该启动子控制内源基因的表达。见，例如，Treco，等人，WO96/29411。
如此处所用的，载体包括质粒、病毒、噬菌体、可整合的DNA片段，和能够将DNA片段整合到宿主基因组的其他载体。表达载体是专门的载体，它们含有遗传控制元件，这些元件可以实现可操作地连接的基因的表达。质粒是最通常使用的载体形式，但是起等价功能的载体的所有其他形式也适于用于此处。见，例如，Pouwels，等人(1985和增刊)Cloning VectorsA Laboratory ManualElsevier，N.Y.；和Rodriguez，等人(编者1988)VectorsA Survey of MolecularCloning Vectors and Their UsesButtersworth，Boston，MA。
适宜的宿主细胞包括原核生物、低级真核生物，和高级真核生物。原核生物包括革兰氏阴性和革兰氏阳性生物，例如，大肠杆菌(E.coli)和枯草杆菌(B.subtilis)。低级真核生物包括酵母，例如，酿酒酵母(S.cerevisiae)和毕赤酵母(S.Pichia)，和Dictyostelium属的种。高级真核生物包括从动物细胞建立的组织培养细胞系，这些动物细胞来自非哺乳动物来源，例如，昆虫细胞，和鸟类，还来自哺乳动物来源，例如，人、灵长类、和啮齿类。
原核宿主载体系统包括许多不同物种的各种载体。如此处所用的，将一般地使用大肠杆菌和其载体以包括用于其他原核生物的等价载体。用于扩增DNA的一种代表性载体是pBR322或其衍生载体。可用于表达DC蛋白或片段的载体包括，但不限于，含有lac启动子的载体(pUC-系列)；含有trp启动子的载体(pBR322-trp)；含有Ipp的启动子(pIN-系列)、含有λ-pP或pR启动子的载体(pOTS)；或者含有杂交启动子如ptac的载体(pDR540)。见，Brosius，等人(1998)“使用λ-、trp-、lac-、和Ipp-衍生的启动子的表达载体”，Rodriguez和Denhardt(编者)VectorsA Survey of MolecularCloning Vectors and Their Uses10205-236，Buttersworth，Boston，MA。
可以用含有DC基因序列的载体转化低级真核生物，例如，酵母和Dictyostelium。为了本发明的目的，最常用的低级真核生物宿主是面包酵母酿酒酵母。其将通常代表低级真核生物，尽管也可以利用许多其他株系和物种。酵母载体通常由复制原点(除非整合型)、选择基因、启动子、编码所希望的蛋白的DNA或者其片段、翻译终止序列、多腺苷酸化序列、和转录终止序列组成。酵母的适宜表达载体包括组成性启动子，如3-磷酸甘油酸激酶和各种其他糖酵解酶基因启动子或者可诱导的启动子，如乙醇脱氢酶2启动子或者金属硫蛋白启动子。适宜的载体包括下列类型的衍生物自复制低拷贝数(如YRp-系列)、自复制高拷贝数(如YEp-系列)、整合型(如YIp-系列)，或者微-染色体(如YCp-系列)。
高级真核生物组织培养细胞是用于DC蛋白表达的优选宿主细胞。原则上，可以使用多数任一高级真核生物组织培养细胞系，例如，杆状病毒表达系统，该细胞系可来自无脊椎动物或脊椎动物来源。然而，优选用哺乳动物细胞以实现共翻译时或翻译后的正确加工。这些细胞的转化或转染和增殖是常规的。可用的细胞系包括HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、幼大鼠肾(BRK)细胞系、昆虫细胞系、鸟细胞系、和猴(COS)细胞系。这些细胞系的表达载体通常包括复制原点、启动子、翻译起始位点、RNA剪接位点(例如，如果使用基因组DNA)、多腺苷酸化位点、和转录终止位点。这些载体可以还含有选择基因或扩增基因。适宜的表达载体可以是质粒、病毒，或逆转录病毒，这些质粒、病毒，或逆转录病毒携带来自如例如，腺病毒、SV40、细小病毒、牛痘病毒或巨细胞病毒来源的启动子。适宜的表达载体的代表性实例包括pCDNA1、pCD，见Okayama，等人(1985)Mol.Cell Biol.51136-1142；pMC1 neo Poly-A，见Thomas，等人(1987)Cell51503-512；和杆状病毒载体，如pAC373或pAC 610。此外，通过基因打靶可以调节DC基因的上游非编码区或者DC基因内的编码或非编码序列，在基因靶定中产生新的DC转录单位，其表达DC蛋白。例如，通过增加细胞中所表达的基因的表达、改变调节模式或诱导或减少或消除基因的表达导入和靶定调节DC蛋白的外源序列在例如，标题为“蛋白质产生和递送”的Treco等人(1998)WO96/29411中描述。
在一些实施方案中，DC蛋白不必糖基化以在一些测定中引起生物学应答。然而，通常希望在一些系统中表达DC多肽，该系统提供特定或明确的糖基化模式。在该情况中，通常的模式将是该表达系统天然提供的模式。然而，通过将例如，未糖基化形式的多肽暴露于导入异源表达系统的适宜的糖基化蛋白可以修改该模式。例如，可以用编码哺乳动物或其他的糖基化酶的一种或多种基因共转化DC基因。还理解过度糖基化对于DC蛋白的生物学活性是有害的，并且技术人员可以进行常规试验以优化糖基化程度，该优化的糖基化程度赋予最佳生物学活性。
可以将DC蛋白，或者其片段工程化以通过磷脂酰肌醇(PI)连接到细胞膜，但是通过用磷脂酰肌醇切割酶，例如，磷脂酰肌醇磷脂酶C处理可以从细胞膜除去DC蛋白，或者其片段。这释放了生物学活性形式的抗原，并允许通过蛋白质化学的标准方法进行纯化。见，例如，Low(1989)Biochem.Biophys.Acta988427-454；Tse，等人(1985)Science2301003-1008；Brunner，等人(1991)J.Cell Biol.1141275-1283；和Coligan，等人(编者)(1996和定期增刊)CurrentProtocols in Protein Science，John Wiley and Sons，New York，NY。
既然已经表征了这些SDCMP蛋白，那么通过合成肽的常规方法可以制备其片段或衍生物。这些方法包括如在Stewart和Young(1984)Solid Phase Peptide SynthesisPierce Chemical Co.，Rockford，IL；Bodanszky和Bodanszky(1984)The Practice of PeptideSynthesisSpringer-Verlag，New York，NY；和Bodanszky(1984)The Principles of Peptide SynthesisSpringer-Verlag，New York，NY中描述的方法。还见Merrifield(1986)Science232341-347；和Dawson，等人(1994)Science266776-779。例如，可以使用叠氮化物方法、酰基氯方法、酸酐方法、混合酸酐方法、活性酯方法(例如，对-硝基苯酯、N-羟基琥珀酰亚胺酯，或氰基甲酯)、碳二咪唑方法、氧化-还原方法、或二环己基碳二亚胺(DCCD)/加成法。固相和液相合成都可用于前面的方法。
通过肽分离，例如，通过提取、沉淀、电泳和各种形式的层析等可以从反应混合物分离和纯化所制备的蛋白质和其片段。根据所希望的用途，可以得到不同纯度的本发明的DC蛋白。使用公知的蛋白质纯化技术或者通过使用此处描述的抗体或结合配偶体，例如，在免疫吸附亲和层析中完成纯化。该免疫吸附亲和层析的实施过程为首先将抗体连接到固体支持体并将所连接的抗体与适宜的来源细胞的可溶裂解物、表达该蛋白的其他细胞的裂解物，或者由于DNA技术而产生这些蛋白的细胞的裂解物或上清液接触，见下文。
可以对多种细胞系筛选一种与其他细胞相比高水平表达所述蛋白的细胞系。对各种细胞系，例如，小鼠胸腺基质细胞系TA4进行筛选并由于其有利的操作性质而被选中。可以从天然来源分离天然DC细胞蛋白，或者通过用适宜的表达载体转化的细胞的表达得到天然DC细胞蛋白。所表达蛋白的纯化可以通过标准方法实现，或者可以与工程化方法联合以从细胞裂解物或上清液以高效率有效纯化。FLAG或His片段可用于这些纯化特征。
V.抗体可以针对各种DC蛋白产生抗体，这些DC蛋白包括个体的、多态性、等位基因的、株系或物种变体，和它们的片段，这些蛋白和它们的片段可以是天然发生的(全长)形式或者重组形式。此外，可以针对活性形式或者失活形式产生抗体。也可使用抗独特型抗体。
a.抗体制备许多免疫原可用于制备与这些DC蛋白具有特异反应性的抗体。重组蛋白是产生单克隆或多克隆抗体的优选免疫原。也可以使用纯的或不纯形式的天然发生的蛋白。使用此处描述的人DC蛋白序列制备的合成肽也可用作免疫原以产生DC蛋白的抗体。可以在如此处描述的真核或原核细胞中表达并如所描述的纯化重组蛋白。然后将产物注射到能够产生抗体的动物中。可以产生单克隆或多克隆抗体以随后用于免疫测定中以测量该蛋白。
产生多克隆抗体的方法是本领域中技术人员公知的。简言之，将免疫原，优选纯化蛋白与佐剂混合并用该混合物免疫动物。通过采集待测血并确定对目标DC蛋白的反应性的效价监视动物对免疫制剂的免疫应答。当得到对该免疫原的适当高的效价抗体时，从该动物收集血液并制备抗血清。如果希望，可以将抗血清分级分离以富集对该蛋白具有反应性的抗体。见，例如，Harlow和Lane。
通过本领域中技术人员熟悉的各种技术可以得到单克隆抗体。简言之，用所希望的抗原免疫动物，从该动物得到脾细胞，并通常通过与骨髓瘤细胞融合使脾细胞永生化。见，例如，Kohler和Milstein(1976)Eur.J.Immunol.6511-519，其在此处被并入作为参考。永生化的备选方法包括用EB病毒、癌基因或逆转录病毒或本领域中公知的其他方法转化。对从单一永生化细胞产生的菌落进行筛选能够产生对该抗原具有所希望的特异性和亲和性的菌落，并且这些细胞产生的单克隆抗体的产率可以通过各种技术提高，这些技术包括注射到脊椎动物宿主的腹膜腔。备选地，通过根据Huse，等人(1989)Science2461275-1281所概述的一般方案从人B细胞筛选DNA文库可以分离编码单克隆抗体或者其结合片段的DNA序列。
通过将这些DC蛋白的预定片段与如上述的载体蛋白的缀合物免疫动物可以产生针对这些DC蛋白的预定片段的抗体，包括结合片段和单链形式的抗体。从分泌所希望的抗体的细胞制备单克隆抗体。可以对这些抗体筛选与正常或有缺陷的DC蛋白的结合，或者筛选激动剂或拮抗剂活性。这些单克隆抗体结合的KD为通常至少约1mM，更通常至少约300μM，典型地至少约10μM，更典型地至少约30μM，优选至少约10μM，更优选至少约3μM或以上。
在一些情况中，希望从各种哺乳动物宿主，如小鼠、啮齿类、灵长类、人等制备单克隆抗体。制备这些单克隆抗体的技术的描述可以见Stites，等人(编者)Basic and Clinical Immunology(第四版)Lange Medical Publications，Los Altos，CA，和其中引用的参考文献；Harlow和Lane(1988)AntibodiesA Laboratory ManualCSHPress；Goding(1986)Monoclonal AntibodiesPrinciples andPractice(第二版)Academic Press，New York，NY；尤其Kohler和Milstein(1975)Nature256495-497，其讨论了产生单克隆抗体的一种方法。简单总结，该方法包括用免疫原注射动物以引起体液免疫应答。然后处死动物并从其脾脏取出细胞，然后将该细胞与骨髓瘤细胞融合。得到杂交细胞，或者“杂交瘤”，其能够体外增殖。然后筛选杂交瘤群体以分离单个克隆，每个克隆分泌针对该免疫原的单一抗体种类。这样，所得单个抗体种类是来自免疫动物的永生化和克隆的单一B细胞应答免疫原物质上所识别的特定部位的产物。
其他适宜的技术包括选择噬菌体或类似载体中抗体的文库。见，Huse，等人(1989)“在λ噬菌体中产生免疫球蛋白所有组成成分的大组合文库”Science 2461275-1281；和Ward，等人(1989)Nature 341544-546。所用的本发明的多肽和抗体可以被修饰或不被修饰，包括嵌合或人源化抗体。通常，该多肽和抗体将通过共价或非共价连接提供可检测的信号的一种物质而被标记。各种标记和缀合技术是公知的并且在科学和专利文献中被广泛报导。适宜的标记包括放射性核素、酶、底物、辅因子、抑制剂、荧光部分、化学发光部分、磁性微粒，等等。教导这些标记的使用的专利包括美国专利号3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149、和4,366,241。还可以产生重组免疫球蛋白。见，Cabilly，美国专利号4,816,567；和Queen，等人(1989)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA8610029-10033。
本发明的抗体也可用于亲和层析以分离每种DC蛋白。当抗体连接到固体支持体，例如，微粒，如琼脂糖、SEPHADEX，等时，可以制备柱子，其中细胞裂解物可以穿过该柱子，洗涤柱子，然后增加温和变性剂的浓度，从而，将释放纯化的DC蛋白。
该抗体还可用于筛选表达文库的特定表达产物。通常，用于这种方法的抗体将被某一部分标记，该部分允许通过抗体结合容易地检测抗原的存在。
SDCMP蛋白的抗体可用于分析，或者鉴定表达各自蛋白的特定细胞群体组分。通过测定表达DC蛋白的细胞的表达产物，可能诊断疾病，例如，免疫-受损的病症、DC衰竭病症，或DC的过量产生。
针对每种DC产生的抗体也可用于产生抗-独特型抗体。抗-独特型抗体将可用于检测或诊断与各自抗原的表达有关的各种免疫学病症。
b.人源化非人来源的使用可以限制单克隆抗体的治疗效率。来自鼠或其他非人来源的抗体可以引起免疫应答，效应物功能的低效募集，和从血流的快速清除(Baca，等人(1997)J.Biol.Chem.27210678-10684)。由于这些原因，希望通过人源化(Carpenter，等人(2000)J.Immunol.1656205；He，等人(1998)J.Immunol.1601029；Tang，等人(1999)J.Biol.Chem.27427371-27378)制备治疗抗体。人源化抗体含有来自亲本小鼠抗体的6个互补确定区(CDRs)的氨基酸序列，这些序列被嫁接到人抗体框架上。为了实现最优结合，可能需要通过改变通常与维持CDRs的构象有关的某些框架氨基酸，将人源化抗体微调回到在亲本小鼠抗体中发现的相应氨基酸。
人源化的一个备选方案是使用噬菌体上展示的人抗体文库(Vaughan，等人(1996)Nat.Biotechnol.14309-314；Barbas(1995)Nature Med.1837-839；de Haard，等人(1999)J.Biol.Chem.27418218-18230；McCafferty等人(1990)Nature348552-554；Clackson等人(1991)Nature352624-628；Marks等人(1991)J.Mol.Biol.222581-597)，或转基因小鼠中所含的人抗体文库(Mendez，等人(1997)Nature Genet.15146-156)。噬菌体展示技术可用于筛选和选择具有高结合亲和性的抗体(Hoogenboom和Chames(2000)Immunol.Today 21371-377；Barbas，等人(2001)Phage DisplayA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York；Kay，等人(1996)Phage Display of Peptides and ProteinsALaboratory Manual，Academic Press，San Diego，CA)。使用噬菌体展示方法可以提供一种DNA序列，其提供紧密结合的单价抗体，如在丝状噬菌体的表面上展示的。使用该DNA序列，研究人员可以构造紧密结合的人源化二价抗体。噬菌体展示文库可以含有单链抗体，其中重链和轻链可变区通过连接体融合于单一基因中，或者该单链抗体可以含有共表达的重链和轻链(de Bruin，等人(1999)Nat.Biotechnol.17397-399)。
c.免疫测定通过各种免疫测定法可以测量具体蛋白。关于一般的免疫学和免疫测定方法的综述，见Stites和Terr(编者)1991 Basic andClinical Immunology(第7版)。此外，本发明的免疫测定可以以几种方法的任一种实施，这些方法在Maggio(编者1980)EnzymeImmunoassayCRC Press，Boca Raton，Florida；Tijssen(1985)″Practice and Theory of EnzymeAntibodies，A LaboratoryManual，如前广泛综述，这些文献的每一个都被并入本文作为参考。还见Chan(等人)(1987)ImmunoassayA Practical GuideAcademic Press，Orlando，FL；Price和Newman(编者)(1991)Principles and Practice of linmunoassaysStockton Press，NY；和Ngo(编者1988)Non-isotopic ImmunoassaysPlenum Press，NY。
通过本领域中技术人员公知的各种方法可以实施免疫测定以测量这些DC蛋白。简言之，测量该蛋白的免疫测定可以是竞争性或非竞争性结合测定。在竞争性结合测定中，所要分析的样品与被标记的分析物竞争结合到固体表面的捕获剂的特异结合位点。优选地，捕获剂是与如上述产生的DC蛋白特异反应的抗体。结合到捕获剂的标记分析物的浓度与样品中存在的游离分析物的量成反比例。
在竞争性结合免疫测定中，样品中存在的DC蛋白与标记蛋白竞争结合特异结合剂，例如，与DC蛋白特异反应的抗体。该结合剂可以结合到固体表面以实现结合的标记蛋白与未结合的标记蛋白的分离。备选地，竞争结合测定测定可以在液相中实施，并且可以用本领域中公知的各种技术将结合的标记蛋白与未结合的标记蛋白分离。分离后，确定结合的标记蛋白的量。样品中存在的蛋白质的量与标记的蛋白质结合的量成反比例。
备选地，可以实施同质免疫测定，其中不需要分离步骤。在这些免疫测定中，通过蛋白质与其特异结合剂的结合而改变该蛋白质上的标记。标记蛋白中的该改变导致标记所发出的信号的减少或增加，从而测量免疫测定末的标记就可以检测或者定量该蛋白质。
通过各种非竞争性免疫测定方法也可以定量确定这些DC蛋白。例如，可以使用两位点、固相夹心免疫测定。在这种类型的测定中，蛋白质的结合剂，例如，抗体，被附着到固体支持体。标记第二种蛋白质结合剂，其也可以是抗体，并且在不同位点结合该蛋白。发生蛋白质上两个位点的结合后，除去未结合的被标记的结合剂并测量结合到固相的标记结合剂的量。结合的标记结合剂的量与样品中该蛋白质的量直接成比例。
可以用蛋白质印迹分析确定样品中DC蛋白的存在。对例如，怀疑含有该蛋白质的组织样品实施电泳。电泳分离样品，并将蛋白质转移到适宜的固体支持体，如硝酸纤维素滤器后，将固体支持体与可以与变性蛋白反应的抗体孵育。该抗体可被标记，或者备选地可通过将该抗体随后与结合最初抗体的另一标记的抗体孵育来检测该抗体。
上面描述的免疫测定形式使用标记的测定组分。该标记可以为各种形式。根据本领域中熟知的方法，该标记可以直接或间接偶联到测定的所希望的组分。可以使用各种标记。通过几种方法的任一种可以标记该组分。通常使用掺入3H、125I、35S、14C或32P的放射性标记。非放射性标记包括结合标记抗体的配体、荧光团、化学发光剂、酶和可以作为标记蛋白的特异结合对成员的抗体。标记的选择取决于所需要的灵敏性、与化合物缀合的容易性、所需要的稳定性，和可以利用的仪器。关于可以使用的各种标记或信号产生系统的综述，见，美国专利号4,391,904，其被并入本文作为参考。
通过各种免疫测定方法也可以测量与特定蛋白反应的抗体。关于可用于通过免疫测定技术测量抗体的免疫学和免疫测定方法的综述，见，例如，Stites和Terr(编者)Basic and Clinical Immunology(第七版)如前；Maggio(编者)Enzyme Immunoassay，如前；和Harlow和LaneAntibodies，A Laboratory Manual，如前。
类似于上面关于特定蛋白的测量所描述的，也可以使用各种不同的免疫测定形式、分离技术和标记。
VI.纯化的SDCMP蛋白在SEQ ID NO1、2；9和10中提供了灵长类(例如人)SDCMP3核苷酸和氨基酸序列。在SEQ ID NO3和4中提供了啮齿类，例如小鼠SDCMP3序列。在SEQ ID NO5、6、7和8中提供了灵长类(例如人)SDCMP4核苷酸和氨基酸序列。肽序列允许制备肽以产生识别这些片段的抗体，并允许制备编码这些序列的寡核苷酸。
可以利用标准纯化方法，并且可以使用特定抗体实施纯化。
VII.物理变体本发明还包括与SEQ ID NO2、4、6、8或10的氨基酸序列具有基本上氨基酸序列相似性的蛋白质或肽。还包括显示出置换(例如，20个或更少，优选10个或更少，更优选5个或更少置换)的变体。当置换是保守置换时，变体将与相应的天然序列蛋白共有免疫原或抗原相似性或者交叉反应性。天然变体包括个体的、等位基因的、多态性、株系的和物种的变体。
通过优化残基匹配，如果需要，通过导入所需的缺口确定氨基酸序列相似性，或者序列同一性。当将保守置换考虑为匹配时，该氨基酸序列相似性，或者序列同一性发生改变。保守置换通常包括下面组内的置换甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。同源氨基酸序列包括每种各自蛋白质序列中的天然等位基因和种间变异。典型的同源蛋白或肽将与相关DC蛋白的氨基酸序列具有50-100％相似性(如果可以导入缺口)到75-100％相似性(如果包括保守置换)。同一性测量将至少约50％、通常至少60％，更通常至少65％，通常至少70％，更通常至少75％，优选至少80％，更优选至少80％，在尤其优选的实施方案中，至少85％或以上。也见Needleham，等人(1970)J.Mol.Biol.48443-453；Sankoff，等人(1983)Time Warps.String Edits，和MacromoleculesTheTheory and Practice of Sequence Comparison第一章，Addison-Wesley，Reading，MA；和来自NCBI(NIH)；和Universityof Wisconsin Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI的软件包。
编码相应哺乳动物DC蛋白的核酸在严格条件下将通常与SEQ IDNO1、3、5、7或9的编码部分杂交。例如，编码各自DC蛋白的核酸在严格条件(例如，提供至少2×背景，优选5×、15×或25×背景的信号，而基本上不提供假阳性杂交信号)下将通常与SEQ ID NO1、3、5、7或9的核酸杂交。通常，所选的严格条件是在限定的离子强度和pH下所要杂交的序列的热熔解点(Tm)低约10℃。Tm是在限定的离子强度和pH下50％的靶序列与完美匹配的探针杂交的温度。通常，严格条件将是其中pH7时洗液中的盐浓度为约0.02M并且温度为至少约50℃的条件。其他因素可以显著影响杂交的严格性，这些因素包括碱基组成和互补链的大小、有机溶剂如甲酰胺的存在，和碱基错配的程度。优选的实施方案将包括在50％甲酰胺和20-50mM NaCl 42℃下结合所公开的序列的核酸。
通过核苷酸置换、核苷酸缺失、核苷酸插入，和核苷酸序列的倒置可以容易地修饰所分离的DC基因DNA。这些修饰导致新的DNA序列，这些DNA序列编码这些DC抗原、它们的衍生物，或者具有高度相似的生理学、免疫原或抗原活性的蛋白质。
可以用修饰序列产生突变抗原或增强表达。增强的表达可涉及基因扩增、增强的转录、增强的翻译，和其他机理。这些突变DC蛋白衍生物包括各自蛋白或其片段的预定的或位点特异的突变。“突变的DC蛋白”包括否则属于上面提出的DC蛋白的同源性定义的多肽，但是其氨基酸序列与自然中发现的DC蛋白的序列不同(通过缺失、置换或插入导致)。具体地，“位点特异的突变DC蛋白”通常包括与具有例如，SEQ ID NO2或10的序列的蛋白质具有显著相似性的蛋白质。通常，该变体将与那些序列共有许多理化和生物学活性，例如，抗原性或免疫原性，并且在优选实施方案中，该变体含有所公开序列的多数或全部。类似概念应用于这些各种DC蛋白，尤其在各种温血动物，例如，灵长类和哺乳动物中发现的DC蛋白。
尽管位点特异突变位点是预定的，但是突变体不必是位点特异的。通过产生氨基酸插入或缺失可以实施DC蛋白质诱变。可以产生置换、缺失、插入或任意组合以得到最终构建体。插入包括氨基-或羧基-末端融合。可以在靶密码子实施随机诱变并对所表达的突变体筛选所希望的活性。在DNA的预定位点产生置换突变的方法是本领域中熟知的，例如，通过M13引物诱变或聚合酶链式反应(PCR)技术。也见Sambrook，等人(1989)和Ausubel，等人(1987和增刊)。DNA中的突变通常不应将编码序列置于读框的外面并且优选不产生将杂交而产生二级mRNA结构，如环或发夹的互补区域。
本发明还提供了重组蛋白，例如，使用这些蛋白的片段产生的异源融合蛋白。异源融合蛋白是蛋白质或片段的融合，自然中，这些蛋白质或片段通常不会以相同方式融合。从而，免疫球蛋白与各自DC多肽的融合产物是连续蛋白质分子，其具有以典型的肽键融合的序列，通常作为单一翻译产物并且表现出每种来源肽的性质。类似概念可用于异源核酸序列。
此外，通过将来自其他蛋白质的相似功能结构域组合可以产生新的构建体。例如，不同的新融合多肽或片段之间的结构域或其他片段可以被“交换”，该交换通常使用相关蛋白，例如，使用凝集素或脱唾液酸糖蛋白家族。优选地，将使用完整的结构域，例如，完整的Ig部分。见，例如，Cunningham，等人(1989)Science 2431330-1336；和O′Dowd，等人(1988)J.Biol.Chem.26315985-15992。从而，蛋白质结合特异性与其他功能结构域的功能连接将产生新的嵌合多肽，其表现出特异性的新的组合。而且，丙氨酸扫描诱变可优选应用于结构上位于二级结构之外的残基，这将避免多数关键残基，这些关键残基的诱变通常破坏三级结构。
这些DC抗原的“衍生物”包括氨基酸序列突变体、糖基化变体，和与其他化学部分的共价或聚集缀合物。通过本领域中熟知的方法，将功能性与在这些DC蛋白氨基酸侧链或N-或C-末端发现的基团连接可以制备共价衍生物。这些衍生物可以包括，但不限于，羧基末端或者含有羧基侧链的残基的脂肪族酯或酰胺、含有羟基的残基的O-酰基衍生物，和氨基末端氨基酸或者含有氨基的残基(例如，赖氨酸或精氨酸)的N-酰基衍生物。酰基选自包括C3到C18正常烷基的烷基-部分，从而形成烷酰基芳酰基种类。当免疫原性部分是半抗原时，对载体蛋白的共价附着是重要的。
具体地，可以包括糖基化改变，该糖基化改变为例如，在多肽的合成和加工期间，或者在进一步加工步骤中通过修饰该多肽的糖基化模式产生的。实现糖基化的尤其优选的方法是将该多肽暴露于来自通常提供这些加工的细胞的糖基化酶，例如，哺乳动物糖基化酶。也考虑去糖基化酶。还包括具有其他微小修饰的相同一级氨基酸序列的形式，这些修饰包括磷酸化氨基酸残基，例如，磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸，或其他部分，包括核糖基或交联试剂。还包括含有置换的蛋白，该置换将保留充分的免疫原性以产生识别例如，SEQ IDNO2或10的蛋白质的抗体。通常，这些蛋白质将含有对所公开序列的少于20个残基置换，更典型的少于10个置换，优选少于5个，更优选少于3个。备选地，在结构结构域开始和结束的蛋白质将通常保留抗原性和交叉免疫原性。
衍生物的一个主要组是DC蛋白或其片段与其他蛋白质或多肽的共价缀合物。这些衍生物可以在重组培养中合成，如N-或C-末端融合，或者通过使用本领域中公知的试剂合成，这些试剂可以通过反应性侧基用于蛋白质交联。与交联剂交联的优选的蛋白质衍生位点在游离氨基、碳水化合物部分，和半胱氨酸残基。
还提供了这些DC蛋白和其他同源或异源蛋白之间的融合多肽。异源多肽可以是不同表面标记之间的融合，导致例如，杂种蛋白。同样，可以构建异源融合体，其将显示出衍生蛋白质的性质和活性的联合。典型的实例是报道多肽，例如，萤光素酶与蛋白质的片段或结构域，例如，受体结合片段的融合，从而，可以容易地确定所融合的蛋白的存在或位置。见，例如，Dull，等人，美国专利号4,859,609。其他基因融合配偶体包括细菌β-半乳糖苷酶、trpE、蛋白质A、β-内酰胺酶、α淀粉酶、乙醇脱氢酶，和酵母α交配因子。见，例如，Godowski，等人(1988)Science 241812-816。
这些多肽也可以具有已经被化学修饰的氨基酸残基，这些化学修饰包括磷酸化、磺化、生物素化或者加入或除去其他部分，尤其分子形状与磷酸基团相似的那些部分。在一些实施方案中，该修饰将是有用的标记试剂，或者作为纯化靶标，例如，亲和配体。
本发明还考虑使用这些DC蛋白的衍生物，这些衍生物不同于氨基酸序列变异或糖基化得到的衍生物。这些衍生物可以包括与化学部分的共价结合或聚集结合。这些衍生物通常分成三类(1)盐，(2)侧链和末端残基共价修饰，和(3)吸附复合体，例如，与细胞膜的吸附复合体。这些共价或聚集衍生物可用作免疫原、免疫测定中的试剂、或者用于纯化方法中，如用于亲和纯化配体或其他结合配体。例如，通过本领域中熟知的方法可以将DC蛋白质抗原通过共价结合固定到固体支持体，如溴化氰活化的Sepharose，或者使用或不用戊二醛交联将DC蛋白质抗原吸附到聚烯烃表面上，以用于抗-DC蛋白质抗体的测定法或纯化。本发明的DC蛋白还可以被可检测基团标记，例如，通过氯胺T方法放射性碘标记，共价结合稀土螯合物，或者缀合到另一荧光部分以用于诊断测定中。通过固定化抗体可以实现这些SDCMP蛋白的纯化。
分离的DC蛋白质基因将允许转化缺少相应DC蛋白表达的细胞，这些细胞，例如，物种型细胞，或者缺少相应蛋白质并且表现出阴性背景活性的细胞。所转化基因的表达将允许分离抗原性纯的细胞系，具有明确的或者单一物种变体。该方法允许更灵敏地检测和区分这些DC蛋白的生理学效应。可以分离和使用亚细胞片段，例如，胞质体或膜片段。
VIII.结合剂DC蛋白复合体在免疫测定中确定一种DC蛋白，其特异结合针对明确的免疫原，例如，由SEQ ID NO2或10的氨基酸序列组成的免疫原产生的抗体或者与该抗体具有特异免疫反应性。该免疫测定使用针对SEQ ID NO2或10的蛋白产生的多克隆抗血清。所选择的该血清具有针对相关家族的其他成员的低交叉反应性，并且在免疫测定中使用前通过免疫吸附除去任何这种免疫反应性。
为了产生用于免疫测定中的抗血清，例如，如此处描述的分离SEQID NO2或10的蛋白。例如，可以在哺乳动物细胞系中产生重组蛋白。使用标准佐剂，如弗氏佐剂，和标准小鼠免疫方案(见Harlow和Lane，如前)，用适宜的蛋白免疫小鼠的自交品系，如BALB/c。备选地，从此处公开的序列得到并缀合到载体蛋白的合成肽可以用作免疫原。收集多克隆血清并测定针对免疫测定(例如，免疫原固定在固体支持体上的固相免疫测定)中免疫原蛋白的效价。选择效价为104或更大的多克隆抗血清并试验它们针对其他相关蛋白的交叉反应性，该试验使用竞争性结合免疫测定，如Harlow和Lane，如前，570-573页中所描述的竞争性结合免疫测定。优选地，两种不同相关蛋白联合给定DC蛋白被用于该测定中。例如，对于凝集素蛋白，使用至少两种其他家族成员以吸附完共有的表位。SDCMP3家族成员与该家族的两种其他成员联合使用。这些其他家族成员可以作为重组蛋白产生并且可以用此处描述的标准分子生物学和蛋白质化学技术分离。
竞争结合形式中的免疫测定可用于交叉反应性测定。例如，可以将SEQ ID NO2或10的蛋白质固定到固体支持体。加入该测定中的蛋白质与抗血清竞争结合固定化抗原。将上面的蛋白质与抗血清竞争结合固定化蛋白质的能力与SEQ ID NO2的蛋白质相比。使用标准计算方法计算上面蛋白的百分数交叉反应性。选择并合并与上面所列的蛋白质的每一种的具有小于10％交叉反应性的那些抗血清。然后通过与上面所列蛋白质的免疫吸附从合并的血清除去交叉反应抗体。
然后将免疫吸收并合并的血清用于如上述的竞争性结合免疫测定中以将另一蛋白与免疫原蛋白(例如，SEQ ID NO2或10的SDCMP3蛋白)比较。为了进行该比较，测定宽范围浓度下这两种蛋白的每一种并确定将抗血清与固定化蛋白的结合抑制50％所需的每种蛋白的量。如果所需的第二种蛋白质的量少于所需的SEQ ID NO2或10的蛋白质的量的2倍，那么认为第二种蛋白特异结合针对该免疫原产生的抗体。
可以理解DC蛋白可能是含有两种或多种基因的同源蛋白家族。对于具体基因产物，如人Ig家族成员蛋白，本发明不仅包括此处公开的氨基酸序列，还包括其他蛋白，该其他蛋白是等位基因的、多态性的、非等位基因的，或物种的变体。还可以理解术语“人DC蛋白”包括非天然突变，这些非天然突变通过使用常规重组技术如单一位点突变的有意突变或者通过切除编码这些蛋白质的DNA的短片段或者该基因的剪接变体，或者通过置换或加入少数新氨基酸导入。这些较小的改变必须基本上保持最初分子的免疫同一性和/或其生物学活性。这些改变包括与所指定的天然发生的各自SDCMP蛋白(例如，SEQ ID NO6或8的人SDCMP4蛋白)特异免疫反应的蛋白。认为较小的具体蛋白质修饰将包括具有相似化学性质的氨基酸的保守置换，如上面对作为一个整体的每个蛋白质家族所描述的。通过将蛋白质与SEQ ID NO2或10的蛋白质最优比对，并通过使用此处描述的常规免疫测定以确定免疫同一性，可以确定本发明的蛋白质组合物。
IX.用途本发明提供了试剂，这些试剂将用于本文别处(例如，关于发育异常的一般描述中，或者下面关于诊断试剂盒的描述中)描述的诊断应用中。
DC基因，例如，DNA或RNA可用作法医测定中的组分。例如，可以用，例如，32P或者生物素标记所提供的核苷酸序列并将其用于检测标准限制性片段长度多态性印迹，提供可测量的特征以帮助区分个体。这些探针可用于熟知的法医技术，如基因指纹法中。此外，从DC序列制备的核苷酸探针可用于原位测定中以检测染色体异常。
针对DC蛋白或核酸的抗体和其他结合试剂可用于纯化相应的DC蛋白分子。如在下面实施例中描述的，DC蛋白的抗体纯化是可能的和可行的。使用此处描述的熟知的技术，抗体和其他结合试剂也可用于诊断方式以确定DC组分是否存在于组织样品或细胞群体。能够将结合试剂附着到DC蛋白提供了诊断与表达错误调节相关的失调的方法。抗体和其他DC蛋白结合试剂还可用作组织学标记，或者纯化试剂。如下面实施例中所描述，这些蛋白的每一种的表达都限于特定组织类型。通过将探针，如抗体或核酸针对各自DC蛋白，可能使用该探针原位或体外区分组织和细胞类型。
此外，纯化的抗原可用于耗尽选择性结合该抗原的抗体的抗血清制剂。从而，例如，小鼠SDCMP3可用于耗尽针对可以与小鼠SDCMP3交叉反应的组分的人SDCMP4产生的抗血清。备选地，SDCMP3可用于纯化抗血清的那些组分，这些组分亲和地结合各自抗原。
SDCMP4与肝ASGPR具有许多共同特征，ASGPR是II型跨膜C-型凝集素的最熟知的实例。肝ASGPR显示出对半乳糖残基的结合特异性，并且其细胞内结构域具有用于配体内化的酪氨酸基序。这些特征使得肝ASGPR结合表达半乳糖残基的脱唾液酸化的血浆糖蛋白，并随后提供了这些蛋白从血浆的清除。
不能从SDCMP4的CRD序列完全推论出SDCMP4的配体特异性。然而，SDCMP4在DC上的表达表明潜在抗原组分(诸如在微生物上发现的)可以代表SDCMP4的天然配体。在该背景中，在DC和巨噬细胞上发现的另一C-型凝集素-甘露糖受体在识别例如酵母细胞壁的甘露糖部分后结合和内化酵母颗粒。
SDCMP4中基于酪氨酸的内化基序的存在预示着该分子在DC的受体介导的内吞中起作用。可以认为SDCMP4作为DC中的“抗原受体”内化配体，该配体将随后被送到细胞内加工途径，导致抗原呈递和启动或促进免疫应答。
这种SDCMP4介导的内化功能使得该受体是指导抗原进入DC的潜在靶标，例如，用以增强向T细胞的呈递，和随后活化特异免疫。从而，SDCMP4可以代表一种受体，其将抗原递送到接种方案，从而，将抗原靶定到适宜细胞以启动疫苗应答。这种策略的治疗重要性与癌症的免疫治疗尤其相关，其中肿瘤相关抗原(TAA)可以与特异识别SDCMP4的试剂偶联以选择性递送到DC。
本发明还提供了可以表现出重要的治疗价值的试剂。DC蛋白(天然发生的或重组的)、其片段和其抗体，以及被鉴定具有对DC蛋白结合亲和性的化合物可用于治疗与异常生理或发育相关的病症，包括异常增殖，例如，癌性病症，或退化性病症。通过适宜的治疗性治疗，使用此处提供的组合物可以调节异常增殖、再生、退化和萎缩。例如，与DC(例如，作为抗原呈递细胞)的异常表达或异常信号化相关的疾病或失调是该蛋白的激动剂或拮抗剂的靶标。这些蛋白可能在造血细胞，例如，淋巴细胞的调节或发育中起作用，这些造血细胞影响免疫应答，例如，抗原呈递和所导致的效应功能。
认为阻断这些SDCMPs的相互作用就可以阻断信号。从而，例如，使用针对这些蛋白的多克隆或筛选的单克隆抗体可以影响免疫应答，例如，MLR。备选地，可溶的细胞外片段可以阻断与反受体的相互作用，从而也阻断这种反应。因为MLR是免疫应答的启动或维持的诊断，所以这些试剂可用于调节免疫系统的启动和维持。
通过RNA印迹分析知道细胞类型中的其他异常发育病症具有DC蛋白mRNA。见Berkow(编者)The Merck Manual of Diagnosis andTherapy，Merck and Co.，Rahway，NJ；和Thorn，等人Harrison′sPrinciples of Internal Medicine，McGraw-Hill，NY。例如，免疫系统的发育或功能异常可导致严重的医学异常和病症，用此处提供的组合物可以预防或治疗这些异常和病症。
可以纯化重组DC蛋白或抗体并将它们施用于患者。这些试剂可以与其他活性或惰性成分组合用于治疗，这些成分为例如，常规药学上可接受的载体或稀释剂，例如，免疫原性佐剂，以及生理上无害的稳定剂和赋形剂。具体地，这些成分可以用于疫苗背景中，其中抗原与激动剂或拮抗剂的这些治疗形式之一组合。可以将这些组合无菌过滤或者通过在剂量小瓶中冻干得到剂型，或者保存在稳定的水性制剂中。本发明还预期抗体或者其结合片段的用途，该结合片段包括不互补结合的形式。
使用抗体或者其受体或片段的药物筛选可以鉴定对这些DC蛋白具有结合亲和性的化合物，包括分离结合的组分。然后可以用生物学测定以确定该化合物是否具有内在刺激活性并由于其阻断该蛋白的活性而因此是阻断剂或拮抗剂。同样，具有内在刺激活性的化合物可以通过该蛋白激活细胞从而由于其刺激该细胞而是激动剂。本发明还考虑针对这些蛋白的抗体作为拮抗剂的治疗用途。
有效治疗所需的试剂的量将取决于许多不同因素，包括施用方法、靶标部位、患者的生理状态，和所施用的其他药物。从而，将滴定治疗剂量以优化安全性和效能。通常，体外使用的剂量可以对用于这些试剂的原位施用的量提供有用的指导。具体失调的治疗的有效剂量的动物试验将进一步提供对人剂量的预测性指示。在例如，Gilman，等人(编者)(1990)Goodman and Gilman′sThe PharmacologicalBases of Therapeutics(第八版)Pergamon Press；和(1990)Remington′s Pharmaceutical Sciences(第17版)Mack PublishingCo.，Easton，PA中描述了各种考虑。此处和下文讨论了施用，例如，经口、静脉内、腹膜内或肌内施用、透皮扩散，和其他施用的方法。药学上可接受的载体将包括水、盐水、缓冲液和例如在Merck Index，Merck和Co.，Rahway，NJ中描述的其他化合物。通常预期剂量范围的量低于1mM浓度，通常小于约10μM浓度，通常小于约100nM，优选小于约10pM(皮摩尔)，最优选小于约1fM(毫微微摩尔)，与适宜的载体。缓释制剂，或者缓释装置将通常用于持续施用。
DC蛋白、其片段、针对DC蛋白或其片段的抗体、拮抗剂和激动剂可被直接施用于所要治疗的宿主，或者，根据化合物的大小，可以希望将该化合物缀合到载体蛋白如卵清蛋白或者血清白蛋白后施用。可以以许多常规剂量制剂施用治疗制剂。尽管活性成分可以单独施用，但是优选将其作为药物制剂施用。制剂通常含有如上面定义的至少一种活性成分，以及其一种或多种可接受的载体。每种载体应该是药学上和生理学上可接受的，也就是与其他成分相容并且对患者无害。制剂包括适于经口、直肠、鼻、或肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内和皮内)施用的制剂。制剂可以方便地以单位剂型给出并且可以通过药剂学领域中熟知的任何方法制备。见，例如，Goodman，等人(编者)(1990)Goodman和Gilman′sThe Pharmacological Bases ofTherapeutics(第八版)Pergamon Press，和(1990)Remington′sPharmaceutical Sciences(第17版)Mack Publishing Co.，Easton，PA；Avis等人(编者)(1993)Pharmaceutical Dosage FormsParenteral MedicationsDekker，NY；Lieberman等人(编者)(1990)Pharmaceutical Dosage FormsTablets Dekker，NY；和Lieberman等人(编者)(1990)Pharmaceutical Dosage FormsDisperse SystemsDekker，NY。本发明的治疗可以与其他化学治疗或者化学预防剂组合或联合使用。
本发明的DC蛋白的天然发生的和重组形式都可尤其用于试剂盒和测定方法，该试剂盒和测定方法能够筛选对这些蛋白具有结合活性的化合物。最近已经开发了几种自动测定方法以允许在短期内筛选上万种化合物。见，例如，Fodor，等人(1991)Science 251767-773，和化学多样性文库的其他描述，其描述了通过多种化合物试验结合亲和性的方法。通过利用如本发明提供的DC蛋白的大量纯化的，例如，可溶形式，可以极大地方便适宜测定法的开发。
例如，一旦蛋白质的结构已经被确定，那么通常可以发现拮抗剂。使用纯化的表面蛋白开发高度自动化测定方法后，现在可以试验潜在的蛋白质类似物。具体地，使用此处描述的筛选技术将发现新的拮抗剂和激动剂。尤其重要的是发现对多种相关的细胞表面抗原具有联合的结合亲和性的化合物，例如，可以作为DC蛋白的种变体的拮抗剂的化合物。
本发明尤其用于通过使用重组DC蛋白在各种药物筛选技术中筛选化合物。使用重组蛋白筛选特异配体的优点包括(a)来自特定来源的蛋白质的改良的可更新的来源；(b)每个细胞潜在的在测定中给出更好的信号噪声比值的更多的抗原；和(c)物种变体特异性(理论上给出更大的生物学和疾病特异性)。
药物筛选的一种方法利用了真核或原核宿主细胞，该宿主细胞被表达DC蛋白的重组DNA分子稳定转化。可以从表达分离的该蛋白的任何其他宿主分离细胞。这些存活或被固定形式的细胞可以用于标准表面蛋白结合测定中。还见，Parce，等人(1989)Science246243-247；和Owicki，等人(1990)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA874007-4011，它们描述了检测细胞应答的灵敏方法。竞争性测定尤其有用，其中将细胞(DC蛋白源)与已知对该抗原具有结合亲和性的抗体，如125I-抗体，和待测样品接触并孵育，测量该试样对结合组合物的结合亲和性。然后分离结合的和游离的被标记的结合组合物以评估蛋白质结合的程度。所结合的受试化合物的量与结合已知来源的标记抗体的量成相反比例。可以用许多技术将结合的试剂与游离的试剂分开以评估结合程度。该分离步骤可通常包括诸如粘附到滤器然后洗涤，粘附到塑料然后洗涤，或者离心细胞膜。也可以用存活的细胞筛选药物对这些DC蛋白介导的功能，例如，抗原呈递或辅助功能的影响。
另一方法利用来自被转化的真核或原核宿主细胞的膜作为DC蛋白的来源。这些细胞被DNA载体稳定转化，该DNA载体指导适宜的蛋白，例如，工程化的膜结合形式的蛋白的表达。基本上，将从细胞制备膜并将其用于结合测定中，如上面提出的竞争测定。
另一方法是使用来自被转化的真核或原核宿主细胞的溶解的、未纯化的或溶解的、纯化的DC蛋白。这允许“分子”结合测定，其优点是特异性增加，能够自动化，和高药物试验通量。
药物筛选的另一技术包括化合物的高通量筛选，这些化合物对各自DC蛋白具有适宜的结合亲和性，该技术在Geysen，欧洲专利申请84/03564(1984年9月13日公开)中详细描述。首先，在固体基质，如塑料针或者某些其他适宜的表面上合成大量不同的小肽受试化合物，见，Foder，等人，如前。然后将所有针与可溶的、未纯化的或可溶的、纯化的DC蛋白反应，并洗涤。下一步骤包括检测所结合的试剂，例如，抗体。
确定那些位点与特定其他蛋白相互作用的一种方法是物理结构测定，例如，x-射线晶体学或者二维NMR技术。这些将提供关于哪些氨基酸残基形成分子接触区域的指导。关于蛋白质结合确定的详细描述，见，例如，Blundell和Johnson(1976)Protein CrystallographyAcademic Press，NY。
X.试剂盒本发明还考虑这些DC蛋白、其片段、肽、和它们的融合产物在用于检测DC蛋白或信息的存在的各种诊断试剂盒和方法中的用途。通常，试剂盒将具有隔室，隔室含有所定义的DC肽或基因片段或者试剂，其识别一种或另一种，例如，抗体。
测定受试化合物与各自DC蛋白的结合亲和性的试剂盒将通常含有受试化合物；被标记的化合物，例如，已知对该蛋白具有结合亲和性的抗体；DC蛋白质(天然发生的或重组的)来源；和将结合的标记化合物与游离的标记化合物分开的工具，如用于固定DC蛋白的固相。一旦筛选了化合物，可以在如本领域中熟知的适宜生物学测定中评价对该蛋白具有适宜的结合亲和性的那些化合物，以确定这些化合物是否作为激动剂或拮抗剂以调节DC功能。重组DC多肽的存在也提供了用于校准这些测定的明确标准。
用于确定例如样品中DC蛋白的浓度的优选试剂盒将通常包含标记的具有对DC蛋白的已知的结合亲和性的化合物，例如，抗体；DC蛋白(天然发生的或重组的)来源和将结合的标记化合物与游离的标记化合物分开的工具，如用于固定DC蛋白的固相。通常将提供含有试剂的隔室，和使用说明书。
对各自DC或其片段特异的抗体，包括抗原结合片段，可用于诊断性应用以检测该蛋白质和/或其片段的水平是否升高。这些诊断测定可以使用裂解物、活细胞、固定细胞、免疫荧光、细胞培养物、体液，并且还可以包括检测血清中的抗原，等。诊断测定可以是同质的(没有游离试剂和抗原-DC蛋白复合体之间的分离步骤)或者异质的(有分离步骤)。存在各种商业化测定，如放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、酶-倍增的免疫测定技术(EMIT)、底物标记的荧光免疫测定(SLFIA)、等等。例如，通过使用第二抗体，可以使用未标记的抗体，该第二抗体被标记并且识别针对DC蛋白或者其特定片段的抗体。在文献中已经广泛讨论类似测定。见，例如，Harlow和Lane(1988)AntibodiesA Laboratory Manual，CSH Press，NY；Chan(编者1987)ImmunoassayA Practical GuideAcademic Press，Orlando，FL；Price和Newman(编者1991)Principles and Practice of ImmunoassayStockton Press，NY；和Ngo(编者1988)Nonisotopic ImmunoassayPlenum Press，NY。具体地，该试剂可用于诊断生物样品中DC群体，以检测样品中DC的过量或不足。该测定可以用于活检的组织学分析，或者评价血液或组织样品中DC的数目。
抗独特型抗体可以具有类似用途以诊断针对DC蛋白的抗体的存在，同样可以诊断各种异常状态。例如，DC蛋白的过量产生可导致各种免疫学反应，其可以诊断异常生理状态，尤其增殖性细胞病症，如癌症或异常分化。
通常在试剂盒中提供用于诊断测定的试剂，以便优化测定的灵敏性。对于主题发明，根据测定的性质，提供了方案、和标记、标记或未标记的抗体或受体，或者标记的DC蛋白。这通常与其他添加剂，如缓冲剂、稳定剂、信号产生所需的物质，如酶的底物，等等一起提供。优选地，该试剂盒将还含有关于正确使用和使用后内含物的处理的使用说明。通常，试剂盒具有每种有用试剂的隔室。希望试剂作为干燥的冻干粉末提供，其中这些试剂可以在水性介质中重构，从而提供实施该测定的试剂的适当浓度。
药物筛选和诊断测定的许多前述组分可以不加修饰地使用或者可以以各种方法修饰。例如，通过共价或非共价连接一个部分可以实现标记，该部分直接或间接提供可检测的信号。在许多这些测定中，可以直接或间接标记该蛋白、受试化合物、DC蛋白或者其抗体。直接标记的可能性包括标记基团放射标记如125I、酶(美国专利号3,645,090)，如过氧化物酶和碱性磷酸酶，和荧光标记(美国专利号3,940,475)，其能够监视荧光强度、波长偏移，或者荧光偏振的改变。间接标记的可能性包括将一种组分生物素化，然后结合偶联到上面标记基团之一的抗生物素蛋白。
有多种方法可以将结合的蛋白与游离蛋白分离，或者备选地，将结合的受试化合物与游离的受试化合物分离。可以将DC蛋白固定在各种基质上，然后洗涤。适宜的基质包括塑料，如ELISA板、滤器，和珠子。将DC蛋白固定到基质的方法包括，但不限于，使用捕获抗体直接粘附到塑料、化学偶联，和生物素-抗生物素蛋白。该方法中的最后一步包括通过几种方法之一沉淀蛋白/抗体复合体，这些方法包括例如，例如有机溶剂如聚乙二醇或盐，如硫酸铵的方法。其他适宜的分离技术包括，但不限于，Rattle，等人(1984)Clin.Chem.301457-1461中描述的荧光素抗体可磁化颗粒方法，和如在美国专利号4,659,678中描述的双抗体磁性颗粒分离。
将蛋白质或它们的片段连接到各种标记的方法已经在文献中广泛报导并且不需要在此处详细讨论。许多技术包括通过利用碳二亚胺或活性酯使用活化的羧基基团以形成肽键，通过将巯基与活化的卤素，如氯乙酰基反应形成硫醚，或者活化的烯烃，如马来酰亚胺用于连接，等等。融合蛋白也可用于这些应用中。
本发明的另一个诊断方法包括使用从各自DC蛋白的序列得到的寡核苷酸或多核苷酸序列。这些序列可用作探针以检测来自怀疑患有异常病症，例如，癌症或免疫问题的患者的样品中信息的水平。RNA和DNA核苷酸序列的制备、这些序列的标记，和这些序列的优选大小已经在文献中大量描述和讨论。通常，寡核苷酸探针将有至少约14个核苷酸，通常至少约18个核苷酸，并且多核苷酸探针可以高达数千碱基。可以使用各种标记，最常用放射性核素，尤其32P。然而，也可以使用其他技术，如使用生物素修饰的核苷酸以导入多核苷酸。然后生物素作为结合抗生物素蛋白或抗体的部位，该抗体可以被各种标记物标记，这些标记物为诸如放射性核素、荧光团、酶，等等。备选地，可以使用能够识别特异双链体的抗体，这些双链体包括DNA双链体、RNA双链体、DNA-RNA杂种双链体，或者DNA-蛋白双链体。该抗体叉可以被标记并实施测定，其中双链体结合到表面，从而在表面上形成双链体时，可以检测结合双链体的抗体的存在。可以以任一常规技术使用针对新反义RNA的探针，该技术为诸如核酸杂交、加减筛选、重组检测、杂种释放翻译(HRT)、和杂种停滞翻译(HART)。还包括扩增技术，如聚合酶链式反应(PCR)。
还预期诊断试剂盒，其也定性或定量检验其他标记的存在。诊断或预后可以取决于用作标记的多种指征的组合。从而，试剂盒可以检验标记的组合。见，例如，Viallet，等人(1989)Progress in GrowthFactor Res.189-97。
XI.结合配偶体分离已经分离了特异相互作用的结合配偶体的一个成员，存在分离反-配偶体的方法。见，Gearing，等人(1989)EMBO J.83667-3676。可以确定标记DC表面蛋白而不干扰与其受体的结合的方法。例如，可以将亲和标记融合到配体的氨基末端或羧基末端。可以筛选表达文库对DC蛋白的特异结合，这可以通过例如细胞分类，或者其他筛选以检测表达这种结合组分的亚群。见，例如，Ho，等人(1993)Proc.Nat′lAcad.Sci.USA9011267-11271。备选地，可以使用淘选方法。见，例如，Seed和Aruffo(1987)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA843365-3369。制备与可得到的DC蛋白质序列适宜的构建体也可以应用双杂交选择系统。见，例如，Fields和Song(1989)Nature 340245-246。
可以使用蛋白质与标记的交联技术分离DC蛋白的结合配偶体。这将允许鉴定与适宜的DC蛋白特异相互作用的蛋白。
参考下面的实施例可以最好地理解本发明的宽范围，这些实施例不打算将本发明限制于特定实施方案。
实施例I.一般方法在例如Maniatis，等人(1982)Molecular Cloning，ALaboratory ManualCold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor Press，NY；Sambrook，等人(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual(第二版)卷1-3，CSH Press，NY；Ausubel，等人BiologyGreene Publishing Associates，Brooklyn，NY；或Ausubel，等人(1987和增刊)Current Protocols in MolecularBiologyWiley/Greene，NY；huis，等人(编者)(1990)PCRProtocolsA Guide to Methods and ApplicationsAcademic Press，NY中描述或参考了许多下面的标准方法。
蛋白质纯化方法包括诸如硫酸铵沉淀、柱层析、电泳、离心、结晶、和其他方法。见，例如，Ausubel，等人(1987和定期增刊)；Deutscher(1990)″蛋白质纯化指南″Methods in Enzymology卷182，和该系列中的其他卷；Coligan，等人(1996和定期增刊)CurrentProtocols in Protein ScienceWiley/Greene，NY；和生产商(例如Pharmacia，Piscataway，NJ，或Bio-Rad，Richmond，CA)的关于蛋白质纯化产物的文献。重组技术的组合允许融合到适宜的片段，例如，融合到FLAG序列，或者等价序列，其可以通过蛋白酶-可除去的序列融合。见，例如，Hochuli(1989)Chemische Industrie1269-70；Hochuli(1990)″用金属螯合吸收剂纯化重组蛋白″Setlow(编者)Genetic Engineering，Principle and Methods1287-98，Plenum Press，NY；和Crowe，等人(1992)QIAexpressThe HighLevel Expression and Protein Purification SystemQUIAGEN，Inc.，Chatsworth，CA。
在Hertzenberg，等人(编者，1996)Weirs’s Handbook ofExperimental Immunology，卷1-4，Blackwell Science；Coligan等人(1992和定期增刊)Current Protocols in Protein ScienceWiley/Greene，NY和Methods in Enzymology卷70、73、74、84、92、93、108、116、121、132、150、162和163。还见，例如，Paul(等人)(1993)Fundamental Immunology(第三版)Raven Press，N.Y。在，例如Steinman(1991)Annual Review of Immunology 9271-296；和Banchereau和Schmitt(编者，1994)Dendritic Cells inFundamenal and Clinical Immunology Plenum Press，NY中描述了确定免疫功能的方法。
在Melamed等人(1990)Flow Cytometry and SortingWiley-Liss，Inc，New York，NY；Shapiro(1988)Practical FlowCytometryLiss，New York，NY；和Robinson，等人(1993)Handbookof Flow Cytometry MethodsWiley-Liss，New York，NY中描述了FACS分析。
II.树突细胞的产生如下得到人CD34+细胞。见，例如，Caux，等人(1995)1-5页，Banchereau和SchmittDendritic Cells in Fundamental andClinical ImmunologyPlenum Press，NY。在干细胞因子(SCF)、GM-CSF、和TNF-α存在下，在补加热失活的胎牛血清(FBS；FlowLaboratories，Irvine，CA)、10mM HEPES、2mM L-谷氨酰胺，5×10-5M 2-巯基乙醇、青霉素(100μg/ml)的无内毒素RPMI 1640培养基(GIBCO，Grand Island，NY)中培养外周血或脐血细胞，有时选择CD34+。该培养基被称为完全培养基。
将CD34+细胞以2×104个细胞/ml接种于25到75cm2培养瓶(Corning，NY)中扩大。通过在第5和10天将这些培养物分到含有新鲜GM-CSF和TNF-α(细胞浓度1-3×105个细胞/ml)的培养基中以保持最优条件。在一些情况中，在约第6天，用FACS根据CD1a表达对细胞分选。
在一些情况中，培养12天后常规地收集细胞，最后使用5mM EDTA溶液回收贴壁细胞。在其他情况中，将CD1a+细胞以5×106个细胞/ml重悬在完全培养基中活化，并用1μg/ml 12-肉豆蔻酸13-乙酸佛波酯(PMA，Sigma)和100ng/ml离子霉素(Calbiochem，La Jolla，CA)活化适当的时间(例如，1或6h)。将这些细胞再扩大6天，并分离用于cDNA文库制备的RNA。
III.RNA分离和文库构建使用如Chirgwin，等人(1978)Biochem.185294-5299描述的硫氰酸胍/CsCl梯度方法分离总RNA。
备选地，使用OLIGOTEX mRNA分离试剂盒(QIAGEN)分离多聚(A)+RNA。用例如，用于cDNA合成和质粒克隆的SUPERSCRIPT质粒系统(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)产生双链cDNA。将所得双链cDNA单向克隆到，例如，pSport1并通过电穿孔转染到ELECTROMAX DH10BTM细胞(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)。
IV.测序将从随机挑选的克隆或者从用未活化的细胞扣除杂交后的克隆分离的DNA用标准技术实施核苷酸序列分析。可以使用Taq双脱氧终止子循环测序试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，CA)。用适宜的自动化测序仪的DNA测序凝胶分离标记的DNA片段。备选地，如例如在Maniatis，等人(1982)Molecular Cloning，A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborPress；Sambrook，等人(1989)Molecular CloningA LaboratoryManual，(第二版)，卷1-3，CSH Press，NY；Ausubel，等人，Biology，Greene Publishing Associates，Brooklyn，NY；或Ausubel，等人(1987和增刊)Current Protocols in Molecular Biology，Greene/Wiley，New York中描述的对所分离的克隆测序。也可以利用化学测序方法，例如，使用Maxam和Gilbert测序技术。
V.重组DC基因构建体例如，使用FastTrack mRNA试剂盒(Invitrogen，San Diego，CA)从适宜的细胞群分离poly(A)+RNA。将样品在例如含有甲醛的1％琼脂糖凝胶中电泳并转移到GeneScreen膜(NEN Research Products，Boston，MA)。在例如，65℃下，0.5M NaHPO4pH 7.2，7％SDS，1mMEDTA，和1％BSA(级分V)与107cpm/ml32P-dCTP标记的DC基因cDNA的混合物中实施杂交。杂交后，将滤器在50℃下，0.2×SSC，.1％SDS中洗涤3次，例如30分钟，然后暴露于胶片24h。阳性信号通常为背景的2倍，优选5-25倍。
重组基因构建体可用于产生检测信息的探针。可以切除插入片段并将其用于上述检测方法中。种间杂交和洗涤的各种标准方法是本领域中熟知的。见，例如，Sambrook，等人，和Ausubel。
VI.DC基因蛋白在大肠杆菌中的表达用PCR制备含有可读框的构建体，该可读框优选可操作地与正确的启动子、选择、和调节序列结合。将所得表达质粒转化到适宜的，例如，Topp5大肠杆菌菌株(Stratagene，La Jolla，CA)。将氨苄西林抗性(50μg/ml)转化株37℃下生长在Luria培养基(Gibco)中直到550nm处光密度为0.7。用0.4mM异丙基-βD-硫代乳-吡喃糖苷(Sigma，St.Louis，MO)诱导重组蛋白并将细胞在20℃继续孵育18小时。通过离心从1升培养物收获细胞并将细胞重悬在例如冰冷30％蔗糖、50mM TrisHCl pH8.0，1mM乙二胺四乙酸的200ml混合液中。置于冰上10分钟后，加入冰冷却的水至总体积2升。冰上20分钟后，离心除去细胞并通过5μM Millipak 60(Millipore Corp.，Bedford，MA)过滤使上清液澄清。
通过标准纯化方法，例如，各种离子交换层析方法纯化重组蛋白。也可以使用下面描述的利用抗体的免疫亲和方法。可以使用亲和方法，其中表位标记被工程化到表达构建体中。
类似方法被用于制备真核细胞中的表达构建体和细胞。可以如上面描述的产生真核启动子和表达载体。
VII.人DC基因作图根据标准技术实施DNA分离、限制酶消化、琼脂糖凝胶电泳、DNA印迹转移和杂交。见Jenkins，等人(1982)J.Virol.4326-36。可以用Hybond-N尼龙膜(Amersham)制备印迹。用32P-dCTP标记探针，在例如0.1×SSC，0.1％SDS，65℃的最终严谨性条件下进行洗涤。
备选地，可以将BIOS Laboratories(New Haven，CT)小鼠体细胞杂种细胞分布板与PCR方法结合。见，Fan，等人(1996)Immunogenetics4497-103。
如通过用PCR引物实施放射杂种作图所确定的，人SDCMP3基因位于染色体12 p12-13(人NK受体复合体)上。
VIII.个体变异分析根据分布数据，选择大量的容易接近的细胞类型用于从个体采样。使用PCR技术，为该基因分析了大群体个体。用cDNA或其他PCR方法对不同个体，例如远交小鼠品系中的相应基因测序，并比较它们的序列。这指出了种族或其他群体中分散的程度，以及确定哪些残基可能被修饰而对功能无显著影响。
IX.抗体的制备通过在如上面所示的大肠杆菌中表达产生重组DC蛋白，并测定其生物学活性。备选地，可以通过纯化方法得到天然蛋白质来源。抗体试剂可用于免疫纯化中，或者用于追踪分离方法。可以用活性或变性的蛋白免疫适宜的哺乳动物以产生多克隆血清，或者单克隆抗体。
X.对应DC基因的分离将编码这些基因的人cDNA克隆用作探针，或者用于设计PCR引物，用以发现各种灵长类物种，例如，黑猩猩中的对应物。可以从其他动物，例如，驯养的农场或宠物动物物种鉴定其他对应DC基因。
XI.使用试剂分析细胞群体检测样品中存在的树突细胞的水平对于异常疾病状况的诊断是重要的。例如，组织或淋巴系统中树突细胞数目的增加可能指征存在DC增生，或者组织或移植物排斥。低DC群体可以指征对例如，细菌或病毒感染的异常反应，其可能需要适宜的治疗而使DC应答正常化。
使用对细胞表面DC蛋白特异的标记的结合试剂的FACS分析(见，例如，Melamed，等人(1990)Flow Cytometrv and SortingWiley-Liss，Inc，New York，NY；Shapiro(1988)Practical FlowCytometryLiss，New York，NY；和Robinson，等人(1993)Handbookof Flow Cytometry MethodsWiley-Liss，New York，NY)被用于确定细胞混合物，例如，PBMCs、粘附细胞，等中存在的DC的数目。结合试剂还用于新鲜或固定的组织样品的组织学分析以分析DC浸润。还可以在破坏性测定，或者在细胞保持存活的某些测定中评价各种细胞群体。备选地，可以使用组织或细胞固定方法。
用，例如Murphy，等人(1993)J.Immunol.Methods162211-223中描述的半定量PCR可以定量DC转录物的水平。设计引物和其他方法使得基因组DNA不被检测。
XII.制备免疫选择性结合制剂例如，如上面描述的制备多克隆抗血清。其他脱唾液酸糖蛋白受体被用于耗尽特异结合这些受体的组分，留下将结合所希望的SDCMP3或SDCMP4的组分。这些耗尽的血清可以连接到例如，固体基质，并用于从不纯的来源免疫选择抗原。可以将免疫选择的抗原进一步纯化，该纯化可使用标准蛋白质纯化方法，例如，硫酸铵沉淀、离子交换，或其他层析方法、HPLC等。可以用特异血清跟踪纯化，例如，确定哪些级分是所希望的蛋白质部分。
XIII.表达分布检测DC(从GM-CSF和TNFα中培养12天的CD34+祖细胞制备，用PMA和离子霉素活化1-6h)、TF1(早期骨髓样细胞系)和U937(骨髓单核细胞系，用PMA和离子霉素活化)中灵长类SDCMP3的分布。还检测了单核细胞和单核细胞衍生的树突细胞和来自扁桃体的CD11 c+树突细胞中的表达。在未活化的Jurkat、CHA、MRD5、JY细胞系、来自扁桃体的浆细胞CD11 c-树突细胞(活化的或未活化的)、B淋巴细胞、T淋巴细胞或粒细胞(活化的或未活化的)中没有检测到信号。这些数据清楚地将人SDCMP3鉴定为干预骨髓树突细胞的靶标，或者作为感染性疾病和癌症的潜在诊断。
DC亚组的评价将CD34+祖细胞与GM-CSF和TNFα培养6天，FACS-分类成CD1a+和CD14+群体。将分类的亚组在GM-CSF和TNFα中再培养6天，并用PMA和离子霉素活化1h或6h。检测CD14衍生的DC，但不是CD1a衍生的DC中的表达，并且该表达被PI活化下调。在用PMA和离子霉素活化的单核细胞中检测到更小的信号，在未活化的和用PMA、离子霉素活化的PBL中检测到非常弱的信号。在用PMA、离子霉素活化的各种细胞T细胞、粒细胞或B细胞中没有检测到信号。
评估了巨噬细胞的表达，并在用PMA、离子霉素活化的单核细胞；和PBL(未活化的或用PMA、离子霉素活化的)中检测到信号。
通过RT-PCR在下面的细胞类型中没有检测到SDCMP3表达朗格汉斯细胞、外周血和扁桃体CD11 c+或CD11 c-阴性DC(用或不用PMA和离子霉素，或IL-3和抗-CD40活化)、B细胞(用或不用PMA和离子霉素，或抗-CD40 mAB活化)、T细胞(用或不用PMA和离子霉素，或抗-CD3和抗-CD28mABs活化)。
通过cDNA序列数据库中的序列表达，在来自DC、活化的单核细胞，和睾丸肿瘤的文库中检测到序列。
SDCMP3的鼠同系物(1469D4)包括其CRD中的甘露糖识别基序(EPN)。此外，该小鼠凝集素具有糖-结合蛋白的特征性共有WND序列。因此，可以预期1469D4将能够结合甘露糖。由于微生物的细胞壁富含甘露糖，可能抗原呈递细胞(DC)能够利用凝集素捕获并随后通过胞外酶活性降解微生物抗原。
通过与以密切相关的形式存在的其他C-型凝集素类比，可以预测可以从人细胞鉴定SDCMP3的甘露糖-结合形式。树突细胞上的甘露糖结合活性将代表上调靶标，用以在感染性疾病的治疗中得到潜在益处。SDCMP3的另一可能的功能可以作为DC和表达配体的其他细胞类型，例如，T细胞之间的粘附分子，从而调节免疫应答。
SDCMP3的序列同源性和染色体定位强烈表明其是IRS基因的新的C-型凝集素家族的一员。SDCMP3的序列将用于通过生物信息学和PCR技术鉴定该家族的其他成员。通过与其他IRS分子类比，预测SDCMP3结合在细胞表面的信号受体复合体中。基于其在DC和单核细胞中的受限表达，SDCMP3将代表调节DC活化的治疗性干预的选择性靶标。根据所阐明的与抑制(ITIM)或活化(ITAM)IRS-信号途径的关系，SDCMP3的动员可以抑制或者加强免疫应答。
此外，SDCMP3的受限表达表明可能将药物选择性递送到树突细胞和单核细胞/巨噬细胞系列的细胞。
通过DNA印迹从来自各种来源的cDNA文库评估小鼠SDCMP3的分布。将来自初步扩增的cDNA文库的DNA(5μg)用适宜的限制性内切酶消化以释放插入片段，在1％琼脂糖凝胶上电泳并转移到尼龙膜(Schleicher and Schuell，Keene，NH)上。
用于小鼠mRNA分离的样品包括静息小鼠成纤维细胞L细胞系(C200)；BrafER(Braf融合到雌激素受体)转染的细胞、对照(C201)；T细胞，TH1极化的(来自脾脏的Mel14 bright、CD4+细胞，用IFN-γ和抗IL-4极化7天；T200)；T细胞，TH2极化的(来自脾脏的Mel14 bright、CD4+细胞，用IL-4和抗-IFN-γ极化7天；T201)；T细胞，高度TH1极化的(见Openshaw，等人(1995)J.Exp.Med.1821357-1367；用抗-CD3活化2、6、16h，合并；T202)；T细胞，高度TH2极化的(见Openshaw，等人(1995)J.Exp.Med.1821357-1367；用抗-CD3活化2、6、16h，合并；T203)；CD44-CD25+前T细胞，从胸腺分选(T204)；TH1 T细胞克隆D1.1，用抗原最后刺激后静息3周(T205)；TH1 T细胞克隆D1.1，10μg/ml ConA刺激15h(T206)；TH2 T细胞克隆CDC35，用抗原最后刺激后静息3周(T207)；TH2 T细胞克隆CDC35，10μg/ml ConA刺激15h(T208)；来自脾脏的Mell4+幼稚T细胞，静息的(T209)；Mel14+T细胞，用INF-γ/IL-12/抗-IL-4极化到Th1 6、12、24h，合并(T210)；Mel14+T细胞，用IL-4/抗-INF-γ极化到Th2 6、13、24h，合并(T211)；未刺激的成熟B细胞白血病细胞系A20(B200)；未刺激的B细胞系CH12(B201)；来自脾脏的未刺激的大B细胞(B202)；来自总脾脏的B细胞，LPS活化的(B203)；来自脾脏的三碘苯甲酰氨基酸葡萄糖富集的树突细胞，静息(D200)；来自骨髓的树突细胞，静息的(D201)；用LPS活化4小时的单核细胞细胞系RAW 264.7(M200)；用GM和M-CSF衍生的骨髓巨噬细胞(M201)；巨噬细胞细胞系J774，静息的(M202)；0.5、1、3、6、12h处的巨噬细胞细胞系J774+LPS+、抗IL-10，合并的(M203)；05、1、3、5、12h处的巨噬细胞细胞系J774+LPS+IL-10，合并的(M204)；气溶胶刺激的小鼠肺组织，Th2引物、气溶胶OVA刺激7、14、23h，合并(见Garlisi，等人(1995)Clinical Immunology andImmunopathology7575-83；X206)；Nippostrongulus-感染的肺组织(见Coffman，等人(1989)Science 245308-310；X200)；总成人肺，正常的(O200)；总肺，rag1(见Schwarz，等人(1993)Immunodeficiency4249-252；O205)；IL-10K.O.脾脏(见Kuhn等人(1991)Cell 75263-274；X201)；总成人脾脏，正常的(O201)；总脾脏，rag-1(O207)；IL-10K.O.Peyers淋巴集结(O202)；总Peyers淋巴集结，正常的(O210)；IL-10 K.O.肠系膜淋巴结(X203)；总肠系膜淋巴结，正常的(O211)；IL-10K.O.结肠(X203)；总结肠，正常的(O212)；NOD小鼠胰腺(见Makino，等人(1980)Jikken Dobutsu291-13；X205)；总胸腺，rag-1(O208)；总肾脏，rag-1(O209)；总心脏，rag-1(O202)；总脑，rag-1(O203)；总睾丸，rag-1(O204)；总肝脏，rag-1(O206)；大鼠正常关节组织(O300)；和大鼠关节炎关节组织(X300)。
在来自骨髓的树突细胞，静息的(D201)；和用GM和M-CSF衍生的骨髓巨噬细胞(M201)中检测到强阳性信号。在总胸腺，rag-1(O208)；和总脾脏，rag-1(O207)中检测到弱信号。在IL-10 K.O.肠系膜淋巴结(X203)；总成人肺，正常的(O200)；和总肺，rag1(见Schwarz，等人(1993)Immunodeficiency4249-252；O205)中检测到几乎不能检测到的信号。其他细胞没有可检测的信号。强信号表明该标记可用于区分或表征树突细胞和/或巨噬细胞群体或亚群。
通过PCR确定SDCMP4分布在GM-CSF和TNFα处理的树突细胞、用PMA和离子霉素活化的单核细胞；用PMA和离子霉素活化的粒细胞；和PBL中检测到阳性信号；在TF1、Jurkat、MRC5、JY、U937、CHA细胞系、活化的T细胞或活化的B细胞中没有发现可检测的信号；在未活化的或者用PMA和离子霉素活化的DC(来自在GM-CSF和TNFα中培养12天的CD34+祖细胞)中检测到SDCMP4。还在单核细胞、粒细胞和PBL(未活化的或者用PMA和离子霉素活化的)中检测到信号。
序列数据库显示了原代树突细胞(经常)；骨髓细胞(一个)；嗜酸性粒细胞(一个)；胎盘扣除的(一个)；和T细胞淋巴瘤(两个)中的SDCMP4序列。
SDCMP3和SDCMP4基因显示出与人单核细胞ASGPR的鼠对应物(M-ASGPR)的显著同源性。同源性在碳水化合物-识别结构域中是重要的，该结构域赋予鼠单核细胞ASGPR对半乳糖和N-乙酰化半乳糖胺(GalNAc)的特异性。Sato，等人(1992)J.Biochem.111331-336。此外，鼠单核细胞ASGPR在其胞质溶胶结构域中有YENL内化信号。CRD序列的系统树表明小鼠和人SDCMP3与SDCMP2的关系比与SDCMP3的关系更近。这些CRDs似乎相互间的关系比与肝ASGPR的CRD的关系更近。
鼠M-ASGPR作为半乳糖基化糖蛋白内吞的受体(Ozaki，等人(1992)J.Biol.Chem.2679229-9235)，允许通过肿瘤杀伤性巨噬细胞对恶性细胞的识别(Kawakami，等人(1994)Jpn.J.Cancer Res.85744-749)。在该背景中，发现M-ASGPR在携带OV2944-HM-1转移性卵巢肿瘤细胞的小鼠的肺转移瘤中表达(Imai，等人(1995)Immunol.86591-598)。有趣的是，人M-ASGPR表现出对Tn抗原的显著特异性(Suzuki，等人(1996)J.Immunol.156128-135)，该抗原具有一簇丝氨酸或苏氨酸连接的末端GalNac，并且与人癌相关(Springer(1989)Mol.Immunol.261-5；andrntoft，等人(1990)Int.J.Cancer 45666-672)。
基于序列同源性，可以预测SDCMPs也作为半乳糖基化糖蛋白的内吞受体。此外，通过甘露糖受体的配体内化，另一C-型跨膜内吞凝集素导致DC通过MHC II类途径的高效抗原呈递。Cella，等人(1997)Current Opinion Immunol.910-16。通过类比，SDCMPs可以在将内化的配体导入抗原呈递途径中起类似作用。
从而，SDCMP4可能是在基于免疫的佐剂治疗中的潜在高效靶标以将抗原装入DC从而增强向T细胞的呈递。这可以用抗原的半乳糖基化形式，或者用偶联抗原的抗-SDCMP4 mABs体外刺激DC来实现。通过抗原特异的T细胞活化可以体外测定呈递效率。由于这种方法的内在治疗前景，这可以集中在肿瘤相关抗原(TAA)的呈递。尤其重要的是与恶性黑素瘤相关的TAA。
此外，人M-ASGPR对Tn抗原的特异性使得该癌TAA是选择靶定SDCMP4的候选者。
如最近所表明的，外来抗原可被加工并以MHC I类途径呈递。见Porgador和Gilboa(1995)J.Exp.Med.182255-260；和Paglia，等人(1996)J.Exp.Med.183317-322。专门的受体可能在DC中执行这种功能。
DC中的这些受体可被靶定以帮助产生TAA-特异的细胞毒性T细胞(CTL)，其具有重要的治疗潜力，因为CTL似乎与肿瘤排斥的诱导有关。
XV.结合对应物的分离通过利用DC蛋白的结合特异性，就像利用抗体一样，可以将DC蛋白用作特异结合试剂。将结合试剂如上面描述的，例如用荧光或其他物质标记，或者固定到用于淘选方法的基质。
该DC蛋白用于筛选表现出结合的细胞系。使用标准染色技术检测或分选细胞内或表面表达的配体，或者通过淘选筛选表面表达转化细胞。通过各种染色或免疫荧光方法筛选细胞内表达。也见McMahan，等人(1991)EMBO J.102821-2832。
例如，在第0天，用每个小室1ml 10ng/ml溶于PBS的纤连蛋白室温下预包被2-室permanox载玻片30分钟。用PBS洗涤一次。然后将1.5ml生长培养基中的COS细胞以2-3×105个细胞/小室铺板。37℃过夜孵育。
在第一天，对于每个样品，制备溶于无血清DME的66mg/ml DEAE-葡聚糖、66mM氯喹，和4mg DNA溶液0.5ml。对于每一组，制备阳性对照，例如1和1/200稀释的人受体-FLAG cDNA，和阴性模拟物。用无血清的DME洗涤细胞。加入DNA溶液并在37℃孵育5小时。除去培养基并加入DME中的10％DMSO 0.5ml并保持2.5分钟。除去并用DME洗涤1次。加入1.5ml生长培养基并过夜孵育。
在第二天，更换培养基。在第3或4天，固定细胞并染色。用Hank’s缓冲盐溶液(HBSS)洗涤细胞两次并在4％多聚甲醛(PFA)/葡萄糖中固定5分钟。用HBSS洗涤3次。所有液体都除去后，可以将载玻片保存在-80℃。对于每个小室，如下实施0.5ml孵育。用32ml/ml 1MNaN3加入HBSS/皂甙(0.1％)20分钟。用HBSS/皂甙1×洗涤细胞。向细胞加入蛋白质或蛋白质/抗体复合体并孵育30分钟。用HBSS/皂甙洗涤细胞两次。如果适宜，加入第一抗体30分钟。加入第二抗体，例如，以1/200稀释的Vector抗-小鼠抗体，并孵育30分钟。制备ELISA溶液，例如，Vector Elite ABC辣根过氧化物酶溶液，并预孵育30分钟。每2.5ml HBSS/皂甙使用例如，一滴溶液A(抗生物素蛋白)和一滴溶液B(生物素)。用HBSS/皂甙洗涤细胞两次。加入ABC HRP溶液并孵育30分钟。用HBSS洗涤细胞两次，再次洗涤2分钟，其封闭细胞。然后加入Vector二氨基苯甲酸(DAB)5到10分钟。每5毫升玻璃蒸馏水使用2滴缓冲液加4滴DAB加2滴H2O2。小心除去小室并在水中洗涤载玻片。空气干燥几分钟，然后加入1滴Crystal Mount和盖玻片。85-90℃烘烤5分钟。
备选地，使用结合试剂特异的其他单核细胞蛋白以亲和纯化或者筛选表达受体的细胞。见，例如，Sambrook，等人或Ausubel，等人。
另一策略是通过淘选筛选膜结合的受体。如上述构建受体cDNA。该配体可被固定并用于固定表达细胞。使用识别例如，单核细胞蛋白融合构建体的FLAG序列，或者使用针对第一抗体产生的抗体可以实现固定。循环使用选择和扩增可以富集适宜的克隆并最终分离表达配体的克隆。
通过单核细胞蛋白可以筛选噬菌体表达文库。适宜的标记技术，例如，抗-FLAG抗体，将允许特异标记适宜的克隆。
如对本领域中技术人员显而易见的，可以对本发明做出许多修饰和改变而不背离其精神和范围。此处描述的特定实施方案仅通过实施例提供，并且本发明仅被所述权利要求书，以及这些权利要求的等价方案的完整范围所限制。
序列表<110>Schering Corporation<120>分离的哺乳动物膜蛋白基因和相关试剂<130>SF0802 QK WI<150>US 10/270,470<151>2002-10-11<160>10<170>PatentIn版本3.1<210>1<211>850<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(108)..(593)<223>
<400>1gtccctgagc tctagcttct ttaaatgaag ctgagtctct gggcaacatc tttagggaga 60gaggtacaaa aggttcctgg accttctcaa cacagggagc ctgcata atg atg caa 116Met Met Gln1gag cag caa cct caa agt aca gag aaa aga ggc tgg ttg tcc ctg aga 164Glu Gln Gln Pro Gln Ser Thr Glu Lys Arg Gly Trp Leu Ser Leu Arg5 10 15ctc tgg tct gtg gct ggg att tcc att gca ctc ctc agt gct tgc ttc 212Leu Trp Ser Val Ala Gly Ile Ser Ile Ala Leu Leu Ser Ala Cys Phe20 25 30 35att gtg agc tgt gta gta act tac cat ttt aca tat ggt gaa act ggc 260Ile Val Ser Cys Val Val Thr Tyr His Phe Thr Tyr Gly Glu Thr Gly40 45 50aaa agg ctg tct gaa cta cac tca tat cat tca agt ctt acc tgc ttc 308Lys Arg Leu Ser Glu Leu His Ser Tyr His Ser Ser Leu Thr Cys Phe55 60 65agt gaa ggg aca aag gtg cca gcc tgg gga tgt tgc cca gct tct tgg 356Ser Glu Gly Thr Lys Val Pro Ala Trp Gly Cys Cys Pro Ala Ser Trp70 75 80aag tca ttt ggt tcc agt tgc tac ttc att tcc agt gaa gag aag gtt 404Lys Ser Phe Gly Ser Ser Cys Tyr Phe Ile Ser Ser Glu Glu Lys Val85 90 95tgg tct aag agt gag cag aac tgt gtt gag atg gga gca cat ttg gtt 452Trp Ser Lys Ser Glu Gln Asn Cys Val Glu Met Gly Ala His Leu Val100 105 110 115
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115 120 125Gln Leu Asn Glu Ser Leu Ser Tyr Phe Leu Gly Leu Ser Asp Pro Gln130 135 140Gly Asn Gly Lys Trp Gln Trp Ile Asp Asp Thr Pro Phe Ser Gln Asn145 150 155 160Val Arg Phe Trp His Pro His Glu Pro Asn Leu Pro Glu Glu Arg Cys165 170 175Val Ser Ile Val Tyr Trp Asn Pro Ser Lys Trp Gly Trp Asn Asp Val180 185 190Phe Cys Asp Ser Lys His Asn Ser Ile Cys Glu Met Lys Lys Ile Tyr195 200 205Leu<210>5<211>1018<212>DNA<213>人<220>
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<221>CDS<222>(160)..(762)<223>
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权利要求
1.分离的结合化合物，该化合物特异结合含有SEQ ID NO2、4、6、8或10的多肽。
2.权利要求1的结合化合物，其中该结合化合物是抗体或其抗体结合片段。
3.权利要求2的结合化合物，其中抗体结合片段是a)Fv片段；b)Fab片段；或c)Fab2片段。
4.权利要求2的结合化合物，其中抗体是a)多克隆抗体；b)单克隆抗体；或c)人源化抗体。
5.使用权利要求1的结合化合物的方法，该方法包括将结合化合物与含有抗原的样品接触以形成结合组合物抗原复合体。
6.权利要求4的方法，其中该a)样品是生物样品，包括体液；b)样品是人；c)抗原在细胞上；d)抗原被进一步纯化；或e)方法提供了所述抗原的空间定位或分布。
7.含有权利要求1的结合组合物的检测试剂盒，和a)关于所述试剂盒中试剂的使用或处理的使用说明材料；或b)隔室，其提供了所述试剂盒的结合组合物或其他试剂的隔离。
8.基本上纯或分离的多肽，其特异结合权利要求1的结合化合物。
9.权利要求8的多肽，其中该多肽含有SEQ ID NO2、4、6、8或10。
10.使用权利要求8的多肽的方法，该方法包括将所述多肽与抗体在适于形成抗体多肽复合体的条件下接触。
11.含有权利要求8的所述多肽的检测试剂盒，和a)关于所述试剂盒中试剂的使用或处理的使用说明材料；或b)隔室，其提供了所述试剂盒的多肽或其他试剂的隔离。
12.编码权利要求8的多肽的分离的或纯化的核酸。
13.权利要求12的核酸，其含有SEQ ID NO1、3、5、7或9。
14.分离的或纯化的核酸，其在严格条件下与权利要求12的核酸杂交。
15.含有权利要求12的核酸的表达载体。
16.含有权利要求15的表达载体的宿主细胞。
17.权利要求16的宿主细胞，其中宿主是a)哺乳动物细胞；b)细菌细胞；c)昆虫细胞；或d)酵母细胞。
18.产生多肽的方法，该方法包括将权利要求16的宿主细胞在适宜条件下培养以表达该多肽并纯化该多肽。
19.调节树突细胞生理或功能的方法，该方法包括将细胞与SEQ IDNO2、4、6、8或10的激动剂或拮抗剂接触的步骤。
20.权利要求19的方法，其中拮抗剂是抗体。
21.权利要求19的方法，其中该接触是与抗原，包括细胞表面抗原、MHC I类或MHC II类抗原相联合。
全文摘要
描述了编码来自灵长类的各种淋巴细胞蛋白的核酸、与其相关试剂，包括特异抗体，和纯化的蛋白。还提供了使用所述试剂的方法和相关的诊断试剂盒。
文档编号A61K39/395GK1886155SQ200380105581
公开日2006年12月27日 申请日期2003年10月9日 优先权日2002年10月11日
发明者L·查鲁斯, A·B·荃, E·E·M·把特斯, D·M·戈曼, S·萨尔兰德, S·J·E·勒伯格, J·H·小菲利普斯 申请人:先灵公司