专利名称：快速构建目标基因高表达的哺乳动物细胞株的体系和方法
技术领域：
本发明涉及应用突变与重组技术筛选可扩增性的高转录活性位点，并在位点处插入标记的方法。本发明还涉及应用位点特异性重组机制快速构建并获得目标基因高表达的哺乳动物细胞系的方法，即应用重组酶识别和切割一对重组信号序列(整合标记载体与靶向表达载体各具有一个)，完成位点特异性重组，实现目标基因的稳定高表达。本发明还涉及本发明方法中的整合标记载体和靶向表达载体以及包括整合标记载体、靶向表达载体、重组酶载体以及出发哺乳动物细胞株的体系。
背景技术：
随着基因工程技术的飞速发展，已有许多重组蛋白作为药物用于临床，在众多重组蛋白质表达系统中，原核和酵母表达系统虽然成本低，但往往不能正确装配、折叠与糖基化，难以表达具有生物学功能的哺乳动物蛋白。而这恰恰是哺乳动物细胞表达系统的优势，重组蛋白在这些系统的表达无一例外的涉及遗传物质的重新组合和分配。
遗传物质可以通过几种不同的独立机制发生重组，包括同源重组、位点特异性重组、以及非同源重组、异常重组。同源重组涉及那些序列极其类似的DNA片断之间的重组，同源序列沿其链形成配对，然后链与链之间发生交叉与交换，交叉可以发生在同源片段中的任何位点。重组效率与同源序列的长度，序列的相同程度，以及构建体中同源与非同源DNA的比例成正比。一般来说至少需要2～10千碱基对，或更大。
位点特异性重组涉及遗传物质在预定位点的交换，在该反应中，重组酶蛋白结合到重组信号序列上，形成一个链的断裂，进而发生DNA链的交换。位点特异性重组由三部分组成，重组酶蛋白、重组信号序列与辅助因子，有些系统仅由前两个组分组成，而不需要辅助因子，例如，FRT/flp系统、Loxp/Cre系统。重组信号序列一般很短，大约为几十个碱基，所以对这种DNA构建体进行操作比同源重组的大片断而言更容易。
非同源重组和异常重组，发生在没有显著序列同源性的遗传物质之间，其交叉点不发生在位点特异性重组序列处，外源DNA在非同源位点处整合到染色体，造成染色体的易位或缺失，通过末端连接、双链断裂修复、桥断裂以及转染序列的连环化完成重组。
为获得稳定转染的哺乳动物细胞系，实现目标基因高水平持续性的表达，非同源重组的方式被大量采用，稳定转染的哺乳动物细胞系的产生通常包括以下步骤；将克隆有目标基因以及药物抗性基因的DNA载体导入宿主细胞，随后在药物的存在下选择培养已成功整合外源DNA的细胞，在大多数的应用中，目标基因与在药物作用下可使相邻基因拷贝数增加的选择性标记相联，编码二氢叶酸还原酶(DHFR)的基因是最常见的标记基因。在DHFR的竞争性抑制剂氨甲碟呤的存在下培养细胞会因DHFR基因的扩增导致DHFR的产量增加。DHFR基因扩增的同时，其侧翼区的DNA序列也可被扩增，扩增的范围可长达几十千碱基，由于目标基因与DHFR基因相连，所以目标基因也得到了大量扩增，拷贝数的增加导致蛋白质产量的增加，从而实现日标基因高水平表达。尽管此方法已被证明是成功的，但非同源性重组具有很大的局限性，例如不具有靶向性，受整合的位置效应控制，适合整合并具有很高转录活性的位点在染色体上数量很少，常需要从上万个转染子中筛选稳定高表达细胞系，而且获得的过程最少需要半年的时间，可控性非常差。
非同源重组的问题可通过同源重组或位点特异性重组来克服，因为这两种重组方式均具有很强的靶向性，1998年美国艾德公司使用同源重组快速实现重组蛋白的表达，其专利为将基因整合至哺乳动物细胞特定位点的方法及所用载体(中国专利申请号98804988.0)。虽然同源重组在酵母和其它真菌生物中自然发生重组的频率很高，但在高等真核生物中，此类重组的几率极低，在哺乳动物细胞中，同源重组发生的频率是非同源重组发生频率的百分之一到五千分之一。另外，发生同源重组的频率高低受同源片段长度的影响，一般至少需要2～10千碱基，或更大，实际采用的一般都超过了10千碱基，对这种分子量的DNA构建体的操作十分麻烦。本发明与之不同的是采用非同源重组和位点特异性重组两种机制实现重组蛋白的高效表达。
发明内容
本发明一方面涉及一种整合标记载体，它包括以下元件或序列A.显性选择标记；
B.筛选标记；C.一或多个扩增基因；D.在微生物中增殖的遗传元件；E.重组信号序列；其中，筛选标记和显性选择标记以融合蛋白形式表达，启动子和融合蛋白之间插入重组信号序列，起始密码子ATG位于重组信号序列之前，共同受控于一个弱化的启动子；而扩增基因也采用弱化的病毒启动子。
在优选的实施方案中，调控融合蛋白表达的弱化启动子是弱化的病毒启动子。调控所述扩增基因和融合蛋白表达的启动子可以相同，也可以不同。
本发明另一方面涉及一种靶向表达载体，它包括以下元件或序列A.显性选择标记；B.在微生物中增殖的遗传元件；C.重组信号序列；D.目标基因表达盒；E.真核生物病毒的复制起点，其中，该载体中的显性选择标记不同于本发明的整合标记载体中的显性选择标记，该显性选择标记基因没有启动子和起始密码子；重组信号序列插入显性选择标记之前，该重组信号序列与本发明的整合标记载体中的重组信号序列相同。
在优选的实施方案中，所述载体中的目标基因表达盒包括SP163增强子、CMV立早基因启动子、内质网膜信号肽、目标基因序列和牛生长激素腺苷酸加尾信号。
本发明再一方面涉及基因组中含有可扩增高转录活性位点的细胞株的构建方法，包括以下步骤A.将本发明的整合标记载体在非关键的位置处线性化，以不影响所有元件的正常功能为准，然后使用该线性化载体通过非同源重组机制转化出发哺乳动物细胞株；B.利用针对显性选择标记的选择压力筛选步骤A获得的转化细胞，获得整合标记载体在基因组较高转录活性位点处整合的克隆；C.测定步骤B获得的克隆的筛选标记基因表达量，获得筛选基因高表达的克隆，即整合标记载体插入基因组中高转录活性位点处的克隆；
D.利用针对扩增基因的选择压力筛选步骤C获得的克隆，获得扩增基因被扩增的克隆，即基因组中含有可扩增的高转录活性位点的细胞株。
在本发明的该方法，步骤B和D中的选择压力可以是逐步增加的。
本发明又一方面涉及获得目标基因高表达的哺乳动物重组细胞株的方法，包括以下步骤A.利用本发明的基因组中含有可扩增高转录活性位点的细胞株的构建方法获得基因组中含有可扩增的高转录活性位点的细胞株；B.用本发明的靶向表达载体和重组酶表达载体以超螺旋形式共转染步骤A获得的细胞株，所述重组酶表达载体瞬时表达位点特异性重组酶，该重组酶催化靶向表达载体和整合在基因组上的整合标记载体在重组信号序列处发生位点特异性重组；C.利用针对靶向表达载体中选择标记的选择压力筛选步骤B获得的转染克隆，获得目标基因插入扩增基因侧翼的克隆，即目标基因高表达的哺乳动物重组细胞株。
在优选的实施方案中，本发明获得目标基因高表达的哺乳动物重组细胞株的方法还包括以下步骤D利用针对扩增基因的选择压力筛选步骤C获得的克隆，获得目标基因高表达的哺乳动物重组细胞株。
在更加优选的实施方案中，本发明的获得目标基因高表达的哺乳动物重组细胞株的方法还包括以下步骤E对步骤C或者步骤D获得的目标基因高表达的哺乳动物重组细胞株进行传代。所述步骤E可以在选择压力下进行。所述选择压力是针对扩增基因的选择压力。该选择压力可以是逐步增加的。
本发明还涉及一种快速构建高分泌重组蛋白细胞株的体系，该体系包括A.本发明的整合标记载体；B.本发明的靶向表达载体；C.重组酶表达载体，该重组酶表达载体可瞬时表达位点特异性重组酶，所述重组酶可以催化整合在出发哺乳动物细胞株基因组上的整合标记载体与靶向表达载体在重组信号序列处发生位点特异性重组；D.出发哺乳动物细胞株。
所述出发哺乳动物细胞株可以选自CHO-dhfr-、COS、Hela、NIH3T3和NS0骨髓瘤细胞。
图1A整合标记载体pTGS-FRT-DHFR示意图。
SV40启动子弱化的SV40病毒早期启动子ATG起始密码子FRT siteFlp重组酶识别与切割位点LacZ-Zeocin融合蛋白(β-半乳糖苷酶与腐草霉素抗性蛋白)bla氨苄抗性基因dhfr二氢叶酸还原酶基因pUC origin大肠杆菌复制子图1BFRT重组信号序列示意图。
图2pWS3载体示意图。
ori大肠杆菌复制子bla氨苄抗性基因dhfr二氢叶酸还原酶(DHFR)基因pMT-1金属硫蛋白I启动子VK抗体轻链可变区序列CK抗体Kappa链恒定区序列VH抗体重链可变区序列CH1/FcIgG1型抗体恒定区序列图3pCMV-VKH-SARS示意图。
ColEI ori大肠杆菌复制子bla氨苄抗性基因sp163增强子pCMV人巨细胞病毒立早启动子VK抗体轻链可变区序列CK抗体Kappa链恒定区序列VH抗体重链可变区序列CH1/hinge/CH2/CH3IgG1型抗体恒定区序列dhfr二氢叶酸还原酶(DHFR)基因pA牛生长激素腺苷酸加尾信号
SV40pASV40病毒多聚腺苷酸加尾信号图4靶向表达载体pTGS-site示意图。
目标基因表达盒子FRTFlp重组酶识别与切割位点hgr潮霉素磷酸转移酶基因ori大肠杆菌复制子bla氨苄抗性基因图5IgG1型抗体表达盒子(pTGS-SARS1-site属于此种类型)。
pCMV人巨细胞病毒立早启动子VK抗体轻链可变区序列CK抗体Kappa链恒定区序列VH抗体重链可变区序列CH1/hinge/CH2/CH3IgG1型抗体恒定区序列pA牛生长激素腺苷酸加尾信号图6IgG1型抗体表达盒子(pTGS-GL-site属于此种类型)。
pCMV人巨细胞病毒立早启动子sp163增强子VK抗体轻链可变区序列CK抗体Kappa链恒定区序列VH抗体重链可变区序列CH1/hinge/CH2/CH3IgG1型抗体恒定区序列pA牛生长激素腺苷酸加尾信号图7Fab抗体表达盒子(pTGS-MH-140属于此种类型)。
pCMV人巨细胞病毒立早启动子VK抗体轻链可变区序列CK抗体Kappa链恒定区序列VH抗体重链可变区序列CH1IgG1型抗体恒定区序列pA牛生长激素腺苷酸加尾信号图8Western Blot杂交。
APierce公司生产人IgG；BSARS抗体；CCD20抗体图9流式细胞分析(FACS)及间接免疫荧光结果图。
左图阴性对照右图CD20抗体图10普通转染方法与本申请转染方法传代次数与克隆阳性率的比较。
图11稳定分泌抗SARS抗体细胞株抗体累积分泌量图。
图12稳定分泌抗SARS抗体细胞株倍增曲线和存活率。
a未加压细胞株倍增曲线b加压细胞株倍增曲线c未加压细胞株存活率 d加压细胞株存活率图13亚克隆细胞株倍增曲线和存活率。
图14亚克隆细胞株抗体累积分泌量曲线。
表1ELISA分析瞬时转染靶向表达载体抗体分泌量表2CHO-DZ工程细胞株加压前后β-半乳糖苷酶活性表3普通转染方法与本申请转染方法的比较结果具体实施方式
本发明提供了快速筛选并获得哺乳动物细胞基因组可扩增性的转录活性位点，并在此位点处插入标记的方法。本发明还提供了经由位点特异性重组将所需外源DNA整合至哺乳动物细胞基因组内靶位点的新方法。应用该方法可重复实现不同目标基因的高表达。
具体而言，首先用整合标记载体，将标记插入哺乳动物基因组可扩增性的转录活性位点，接着用靶向表达载体和重组酶表达载体双质粒共转染哺乳动物细胞，使目标基因在位点特异性重组系统的作用下整合至基因组的标记处，通过扩增基因的扩增作用，快速增加基因拷贝数，实现基因高表达。
整合标记载体本申请的整合标记载体包括以下元件或序列。
第一，显性选择标记。该显性选择标记有助于分离和鉴定通过非同源重组机制将整合标记载体插入到基因组的细胞。显性选择标记的例子包括编码下列物质的基因印度异壁链霉菌腐草霉素抗性(Sh ble)、潮霉素磷酸转移酶(hph)、新霉素抗性(neo)、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)、嘌呤霉素(pac)、二氢乳清酸酶谷氨酰胺合成酶(GS)、组氨酸D(hisD)、氨甲酰磷酸合成酶(CAD)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、天冬氨酸转氨甲酰酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)和腺苷脱氨酶(ada)。
第二，筛选标记。筛选标记能使含有载体的细胞分离出来，而不需要给它们施加药物或其它选择压力。筛选标记的例子包括编码细胞表面蛋白质、荧光蛋白和酶的基因。包含载体的细胞可以通过流式细胞仪(FACS)利用细胞表面蛋白荧光标记的抗体或者用被载体编码的酶转化为荧光产物的底物来分离，或者通过酶与底物的特异性反应来选择。
第三，一或多个扩增基因。扩增基因的存在，使细胞具有克服相应药物致死效应的能力，但随着药物浓度的升高，含有较少扩增基因拷贝的细胞无法抵御药物的作用而死亡，只有含有较多扩增基因拷贝的细胞才能存活下来，并形成集落，从而挑选出包括拷贝数增加的整合标记载体的细胞。扩增标记的例子包括，但不限于，二氢叶酸还原酶(DHFR)、腺苷脱氨酶(ada)、二氢乳清酸酶谷氨酰胺合成酶(GS)和氨甲酰磷酸合成酶(CAD)。要实现基因扩增，不同系统对宿主细胞的要求不同，例如常见的系统，二氢叶酸还原酶(DHFR)/氨甲喋呤(MTX)系统需要突变的细胞系作为宿主细胞，二氢乳清酸酶谷氨酰胺合成酶(GS)/甲硫氨酸(MSX)系统不需要突变的细胞系。
第四，在微生物中增殖的遗传元件，例如微生物的复制起始点和抗生素抗性标记。
第五，重组信号序列，包括，但不限于FRT、Loxp、AttB/AttP。
在该整合标记载体中，调控序列包括启动子和增强子等元件。通常调控序列上含有转录因子的结合位点，所述转录因子例如TATA结合蛋白，CAAT结合蛋白，SP-1，AP-1。调控序列的来源可以是细胞基因组或病毒基因组。细胞调控序列的例子包括，但不限于，金属硫蛋白I基因、免疫球蛋白基因、酪蛋白I基因。病毒调控序列的例子包括，但不限于，巨细胞病毒(CMV)立早基因、SV40基因、腺病毒晚期基因、疱疹病毒基因的调控元件。在优选实施方案中，调控序列是病毒启动子。
本申请的有利之处在于将筛选标记和显性选择标记以融合蛋白形式表达，共同受控于一个弱化的启动子，降低转录活性和使翻译受损，这样当宿主细胞处于针对显性选择标记药物的最低致死浓度下，那些整合标记载体插入位点为低转录活性位点的克隆，便不能抵御药物的作用而死亡，只有整合在转录活性较高的位置处的克隆才能生存，再通过筛选标记基因表达量的测定，挑选表达量高的克隆，这些克隆为整合标记载体插入到基因组高转录活性位点的克隆。
本申请的有利之处在于扩增基因采用弱化的病毒启动子，这样在很低浓度的药物作用下就可以达到很高浓度药物作用才能达到的基因拷贝数，既快速又节省药物。例如用氨甲喋呤来选择二氢叶酸还原酶(DHFR)基因的扩增，不使用弱化启动子的情况下，氨甲喋呤的浓度需要达到1-100nM，为起始药物浓度的1000倍左右，才能达到满意的拷贝数。由于药物浓度的使用是逐级增加的，这样药物选择的过程，长达半年，甚至更长的时间。采用本申请的方法，氨甲喋呤的浓度仅需达到0.01-1nM，为起始药物浓度的10倍，最多需要两个月的时间，基因就可扩增达到满意的拷贝数。
虽然本申请采用非同源重组实现整合标记载体的整合，但是有利之处在于筛选并获得高转录活性位点是十分快速的，只需通过药物即可淘汰绝大多数低转录活性位点处的整合，而普通的非同源重组需要从几千个克隆中去除淘汰低转录活性位点的整合。
本申请的另一有利之处在于在启动子和融合蛋白之间插入重组信号序列，而且起始密码子ATG位于重组信号序列之前。
靶向表达载体本申请的靶向表达载体包括以下元件或序列。
第一，显性选择标记。该显性选择标记不同于整合标记载体中的显性选择标记，可以是以下例子中的一种，印度异壁链霉菌腐草霉素抗性(Shble)、潮霉素磷酸转移酶(hph)、新霉素抗性(neo)、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)、嘌呤霉素(pac)、二氢乳清酸酶谷氨酰胺合成酶(GS)、组氨酸D(hisD)、氨甲酰磷酸合成酶(CAD)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、天冬氨酸转氨甲酰酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)和腺苷脱氨酶(ada)。
第二，在微生物中增殖的遗传元件，例如微生物的复制起始点和抗生素抗性标记。
第三，与整合标记载体相同的重组信号序列，包括，但不限于FRT、Loxp、AttB/AttP。
第四，待大量表达的目标基因表达盒。所述目标基因包括，但不限于免疫球蛋白基因，细胞表面受体，胞内受体，激素，细胞因子，生长因子，转录因子，酶等。该表达盒中的调控序列包括启动子和增强子等元件。通常调控序列上含有转录因子的结合位点，所述转录因子例如TATA结合蛋白，CAAT结合蛋白，SP-1，AP-1。调控序列的来源可以是细胞基因组或病毒基因组。细胞调控序列的例子包括，但不限于，金属硫蛋白I基因、免疫球蛋白基因、酪蛋白I基因。病毒调控序列的例子包括，但不限于，巨细胞病毒(CMV)立早基因、SV40基因、腺病毒晚期基因、疱疹病毒基因的调控元件。在优选实施方案中，调控序列是病毒启动子。
第五，真核生物病毒的复制起点。病毒复制起点的存在使得靶向表达载体可作为游离体短时间存在于细胞中，在短时间内载体拷贝数剧增，瞬时高表达目标基因，有利之处在于在三天内可获得大量的目标基因蛋白，用于下游分析，以及评价载体经各种改造后，是否对目标基因的表达不产生影响。有用的病毒复制起点的例子包括，但不限于SV40ori和EBV ori。
本申请的有利之处在于在靶向表达载体上显性选择标记前插入重组信号序列，该显性选择标记基因没有启动子和起始密码子，只有当靶向表达载体和整合标记载体之间发生了正确的位点特异性重组，这样整合标记载体上的启动子和起始密码子可以启动显性选择标记的表达，在靶向表达载体的选择标记药物压力下，细胞才能生存。这样就快速完成发生正确位点重组的克隆筛选。
根据本申请的优选实施方案，目标基因表达盒中，启动子是CMV立早基因启动子，增强子是SP163，信号肽是内质网膜信号肽，加尾信号是牛生长激素腺苷酸加尾信号。此种表达盒子，可以实现目标基因的高表达。
重组酶表达载体重组酶表达载体可商购于invitrogen或promega公司，该载体可瞬时高表达位点特异性重组酶，重组酶表达载体包括以下元件。
第一，在微生物中增殖的遗传元件，例如微生物的复制起始点和抗生素抗性标记。
第二，重组酶基因表达盒子，包括病毒启动子，重组酶基因，腺苷酸加尾信号。
重组酶表达载体与靶向表达载体共转染到宿主细胞后，重组酶载体表达重组酶，导致靶向表达载体整合在基因组重组信号序列处，一旦靶向表达载体整合进基因组，则不再需要重组酶，相反，过多的重组酶会造成靶向表达载体从基因组中切割下来。正因为如此，本申请选用的重组酶表达载体缺乏靶向表达载体的显性选择标记，因此，随着细胞的传代，这种质粒会较快的丢失。
含有可扩增的高转录活性位点的细胞株的构建首先将整合标记载体在非关键的位置处线性化，以不影响所有元件的正常功能为标准，采用非同源重组机制，利用本领域已知方法将载体导入细胞(如CHO-dhfr-、COS、Hela、NIH 3T3、NS0骨髓瘤细胞等)，导入方法包括，但不限于，电穿孔、磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖、脂质体转染。在整合标记载体上同时采用了两个弱化的启动子，第一个是筛选标记和显性选择标记融合蛋白的启动子，第二个是扩增基因的弱化病毒启动子。在选择压力存在的情况下，应用第一个启动子的弱化功能可以快速挑选出较高转录活性位点处整合的克隆。由于采用了这种策略，使筛选成功率达到十分之一左右。然后，测定整合标记载体随机插入的克隆的筛选标记基因表达量，筛选标记基因表达量高的克隆即为整合标记载体插入基因组中高转录活性位点处的克隆。
虽然高转录活性位点的获得可以实现外源基因的高表达，但是表达量并未达到满意的程度，解决的有效方法之一是实现高转录活性位点处基因的拷贝数剧增，甚至达到上千的拷贝数。但不是所有的转化细胞系都可以经受染色体特定位点DNA在局部重复循环复制，只有部分转化细胞系能经受那些区域产生数千拷贝的转染基因，另外，不同的转录活性位点其允许基因拷贝数增加的能力差异很大，因此，实现外源基因在此区域的高表达，有必要首先筛选出具有高扩增性的高转录活性位点，减少转化细胞系构建的盲目性。
本申请有利之处在于当快速筛选到高转录活性位点后，由于第二个弱化启动子的使用，随后即可以快速筛选到具有可扩增性的高转录活性位点，筛选成功的比例大约在四十分之一左右。整合标记载体将标记插入到基因组可扩增的高转录活性位点的细胞为含有扩增的高转录活性位点的细胞株。
目标基因高表达的重组哺乳动物细胞株的构建获得了含有可扩增的高转录活性位点的细胞株后，接着用靶向表达载体和重组酶表达载体以超螺旋形式共转染该细胞株，利用位点特异性重组机制，采用本领域已知方法将载体导入细胞，这些方法包括，但不限于，电穿孔、磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖、脂质体转染。
单独使用靶向表达载体和重组酶表达载体，细胞不表现出靶向表达载体上的显性选择标记抗性，这样，在靶向表达载体的选择标记药物压力下，细胞不能生存。只有当靶向表达载体和整合标记载体之间发生了正确的位点特异性重组，细胞才能生存，生长的克隆即为插入到可扩增性转录活性位点的克隆。通过靶向表达载体的插入，目标基因实现了与扩增基因相邻的目的。
在含有一或多种选择试剂的选择培养基中培养细胞。每次增加药物浓度均可得到一些抗性集落，可以挑选出单个集落并鉴定扩增标记和目的基因的拷贝数，分析目的基因的表达，挑选出目的基因表达水平最高的单个克隆用于在更高药物浓度下的进一步的扩增。
本申请的有利之处在于仅需要很少轮次的药物浓度升高筛选，即可实现普通转染细胞系在最高药物浓度才能达到的目标基因的扩增拷贝数。本申请的有利之处还在于已经在靶向表达载体转染细胞前，在可扩增性转录活性位点处插入了重组信号序列。因此，使用本申请的方法和系统，待表达的目标基因的扩增和高表达实现的可能性为100％，而普通的转染法却只有万分之一左右。
以下通过具体实例来具体说明本申请的技术方案。为了说明本申请的优越效果，在实例中选择了表达难度高于一般蛋白的大分子量抗体。
应用实例1整合标记载体pTGS-FRT-DHFR和靶向标记载体pTGS-SARS1-site或pTGS-CD20-site的构建实例构建使用的材料和方法本实例所使用的生物材料包括COS7；293T；Escherichia coliXL1-Blue(购自invitrogen)；pFRT/lacZeo2、pOG44、pcDNA5/FRT、pcDNA3.1/hgr+(购自invitrogen)；pWS3、pWSD3、pTGS-VKH(北京天广实生物技术有限公司)、pGEM-T easy(购自promega)。限制性内切酶购自Acc65I、ApaLI、BglII、BssHII、EcoNI、MfeI、NaeI、PciI、PmlI、PmeI、SnaBI(购自New England Biolabs)；ApaI、BamHI、BglII、EcoO65I、EcoRI、EcoRV、HindIII、NcoI、NdeI、PstI、PvuII、SacII、XbaI、XhoI(购自Takara公司)。T4DNA连接酶、klenow片段、T4DNA聚合酶、碱性磷酸酶；蛋白预染分子量标准(购自NewEngland Biolabs)；Premix Taq(购自Takara公司)；Lipofextamine 2000、Platinum Pfx聚合酶(购自invitrogen)；DNA分子量标准DL2000、DLl5000(购自Takara公司)；Gene ruler 1Kb DNA梯度分子量标准；DNA片段纯化回收试剂盒购自Qiagen；质粒抽提试剂盒购自promega与博大泰克。
本实例电转感受态的制备，引物设计、片段回收与纯化、DNA的酶切与连接、片段的补平与去磷酸化均可参考分子克隆第二版(冷泉港实验室)。
整合标记载体pTGS-FRT-DHFR(图1)，其中含有第一，一个显性选择标记基因印度异壁链霉菌腐草霉素抗性基因(Shble)，该基因蛋白赋予细胞抵御Zeocin抗生素的能力。
第二，一个筛选标记β-半乳糖苷酶基因。
第三，一个扩增基因二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，扩增基因采用弱化的SV40病毒启动子，该启动子删除其中一个72bp增强子序列(-321～-250)，将另一个72bp增强子序列的5～7位碱基由TGG突变为GTT(-245～-243)，该扩增基因表达盒子来源于本公司已有的载体pWS3。该扩增基因及其启动子可以位于载体上任何位置，只要不影响其他元件的功能即可。
第四，在微生物中增殖的遗传元件，复制起始点ColE1和表达氨苄青霉素抗性的bla基因。
第五，重组信号序列FRT。
在该载体中，按转译方向，依次是病毒SV40弱化启动子(缺失98个碱基增强子序列(-321～-224))，起始密码子ATG，重组信号序列FRT，筛选标记β-半乳糖苷酶基因，显性选择标记印度异壁链霉菌腐草霉素抗性基因。筛选标记和显性选择标记形成融合蛋白，融合蛋白的第一个起始密码子即为重组信号序列前的起始密码子ATG。FRT重组信号序列为34bp，包括三个13bp反向重复序列，一个8bp的核心序列，链的切割和连接发生在8bp序列的两侧(图1B)。
靶向表达载体pTGS-SARS1-site(图4、图5)与pTGS-CD20-site(图4、图6)，其中第一，含有与整合标记载体完全相同的重组信号序列FRT。
第二，含有在微生物中增殖的遗传元件，复制起始点ColE1和表达氨苄青霉素抗性的bla基因。
第三，含有一个显性选择标记潮霉素磷酸转移酶(hph)基因，该基因前为重组信号序列FRT，整个盒子无启动子和起始密码子，但有加尾信号。它的表达依赖于靶向表达载体与整合在基因组的整合标记载体之间的正确重组。两个相同的FRT重组信号序列在重组酶(FLP)的作用下发生位点特异性重组，两条链交换的结果使筛选标记β-半乳糖苷酶基因前的启动子和起始密码子直接放置在潮霉素磷酸转移酶(hph)基因前，形成完整的表达读框，赋予细胞抵御潮霉素的能力。
第四，目标基因表达盒子分别为抗体基因轻链的表达盒子和IgG1型抗体的重链表达盒子。抗体基因轻链的表达盒子，按转译方向依次是SP163增强子，CMV立早基因启动子，内质网膜信号肽，轻链可变区，轻链恒定区，牛生长激素腺苷酸加尾信号。IgG1型抗体的重链表达盒子按转译方向依次是SP163增强子，CMV立早基因启动子，内质网膜信号肽，重链可变区，重链恒定区，牛生长激素腺苷酸加尾信号。
第五，包含真核生物病毒完整的复制起点SV40ori。由于含有SV40复制起点，该载体在293T，COS7以及中华仓鼠卵巢细胞CHO中均可实现瞬时高表达。表1ELISA分析靶向表达载体的瞬时转染结果，瞬时转染采用普通的脂质体转染方法。
靶向表达载体pTGS-SARS1-site，插入来源于人靶向库中筛选的抗体基因，表达抗体是人源SARS抗体。该载体不仅在COS7细胞中有很高的瞬时表达量，在CHO-dhfr-细胞中同样能达到μg/mL的瞬时表达量。表中数据为三次瞬时转染的ELISA结果。
靶向表达载体pTGS-GL-site，表达人-鼠嵌合IgG1抗体-抗CD20抗体，该抗体序列为NCBI公开抗体序列ZH7，该载体在293T细胞中有很高的瞬时表达量，表中数据为三次瞬时转染的ELISA结果。
靶向表达载体pTGS-MH-140-site，抗体基因来源于杂交瘤p140，表达人-鼠嵌合Fab抗体。该载体在293T细胞中有较高的瞬时表达量，表中数据为三次瞬时转染的ELISA结果。
ELISA分析方法将羊抗人Fab或IgG抗体用包被液稀释，100μL/孔包被ELISA亲和96孔板，4℃过夜，以200μL/孔的10％小牛血清37℃封闭30min～1小时，PBST洗板三次，将标准品和待测样品以100μL/孔加至96孔板，室温2小时，或4℃过夜。PBST洗板三次，加入辣根过氧化物酶标羊抗人抗体Fc、Fab或IgG100μL/孔，室温放置40min，PBST洗板四次，以OPD显色系统显色，测OD492nm吸光度。选定线性范围内的数据，以标准品吸光度(OD492)对标准品浓度的对数(lnC)作曲线，以浓度为横坐标，OD492为纵坐标，做折线图，得标准曲线OD492＝alnC+b，根据标准曲线计算样品浓度。
表1ELISA分析靶向表达载体的瞬时转染结果
应用实例二可扩增性转录活性位点的筛选PstI核酸内切酶单酶切整合标记载体pTGS-FRT-DHFR，Qiagen胶回收试剂盒回收，回收后浓度为100ng/mL，采用BioRad电击仪，200ng线性化载体电转二氢叶酸还原酶基因缺陷型的中华仓鼠卵巢细胞CHO-dhfr-，电击细胞密度为3×105cell/mL，DMEM电转缓冲液，最终质粒浓度为1μg/mL，将质粒与细胞的混合液转入电击杯，Square wave模式160伏特，15毫秒电击一次，立即转移细胞至培养基中培养，12小时后换液；48小时后分瓶，使细胞融片率小于20％，此时的培养基换成选择培养基(含100μg/mL Zeocin抗生素)，100μg/mL Zeocin抗生素浓度是宿主细胞最低药物致死浓度。大约30天出现克隆。分别挑400个单克隆到96孔板，测试单克隆的β-半乳糖苷酶活性(使用invitrogen公司的β-半乳糖苷酶活性检测试剂盒(货品目录K1455-01)和药典上常用的Bradford法定量蛋白质)。400个克隆均表达β-半乳糖苷酶，有四分之一的克隆酶活达到100米勒单位。对这100个克隆进行亚克隆，连续20代测试亚克隆的β-半乳糖苷酶活性，结果10％的亚克隆具有稳定高表达β-半乳糖苷酶的特性。选择100个单克隆用4×10-7M氨甲蝶呤，无次黄嘌呤和胸苷的选择培养基培养细胞，这个过程是细胞加压过程，一旦细胞转入选择培养基，细胞很快出现大量死亡，只有二氢叶酸还原酶基因插入在可扩增位点的细胞才能抵御药物的作用。18天后新克隆相继出现，胰酶消化克隆，测试这些克隆的β-半乳糖苷酶活性，结果有12％的克隆表现出酶活增加，表明这些克隆被标记的高转录活性位点具有可扩增性。表2是12株在可扩增性的转录活性位点处整合了整合标记载体的细胞系，这些细胞株命名为CHO-DZ工程细胞株。
表2CHO-DZ工程细胞株加压前后β-半乳糖苷酶活性
应用实例3高分泌SARS人源抗体稳定转染细胞系的构建脂质体转染CHO-DZ工程细胞，1×105个细胞，100ng靶向表达载体pTGS-SARS1-site与1μg FLP重组酶表达载体pOG44共转染，pOG44可商购于invitrogen，pOG44瞬时表达位点特异性重组酶，该酶作用于CHO-DZ工程细胞株和靶向表达载体上的FRT位点，通过两个位点链的切割与交换，将靶向表达载体定点整合至染色体上。转染48小时后稀传，使细胞融片率小于20％，此时的培养基换成新的选择培养基(含250μg/mL潮霉素，无Zeocin抗生素)，250μg/mL潮霉素浓度是CHO-DZ工程细胞株最低药物致死浓度。
同时，采用普通的稳定转染细胞系构建的方法，评价构建细胞系的效率，350ng pCMV-VKH-SARS(抗体基因与pTGS-SARS1-site相同，基因表达盒子也完全相同)转染CHO-dhfr-细胞，转染条件与本申请位点特异性重组方法相同。转染后随机挑取100个克隆分析抗体分泌量、阳性率和克隆稳定性。
靶向表达载体上有单一的FRT位点，单独转染不会赋予细胞潮霉素抗性。靶向表达载体与FLP重组酶表达载体共转染CHO-DZ工程细胞，发生FRT/FLP位点特异性重组，细胞表达潮霉素抗性，以此作为筛选标记，转染后25天左右可见明显的潮霉素抗性克隆生长，ELISA测定抗体分泌量，胰酶消化传代，连续测定17代，阳性率均为100％。用此方法获得的克隆阳性率为100％，各克隆间的蛋白表达量基本都处在相同的范围内，对这些克隆进行整体加压可大量提高重组蛋白的分泌量。
一旦靶向表达载体整合到基因组中，则不再需要重组酶，重组酶的持续会造成整合效率的降低，本发明中重组酶表达质粒在哺乳动物细胞中只表达重组酶，不表达抗性筛选标记，因此会逐渐被降解。
对pTGS-SAR1-site定点整合后获得的细胞株进行加压，第一周采用4×10-7M氨甲蝶呤加压，第二周继续加压，甲氨蝶呤浓度增加至1×10-6M，第三周用二甲基亚砜(DMSO)冻存细胞，第五周复苏细胞，复苏两天后测试细胞倍增性能和蛋白分泌量。未加压的样品传代2个月，与加压后复苏的细胞，以1.5×105cell/mL共2mL接种6孔板，每24小时收上清，ELISA分析蛋白分泌量，台盼篮染色计算细胞的总数和死亡率。图11是稳定分泌抗SARS抗体细胞株抗体累积分泌量曲线，图12是稳定分泌抗SARS抗体细胞株倍增曲线和存活率。图11与12数据为三次实验的平均值。测试结果表明细胞24小时可倍增，加压细胞在第5天达到快速分泌期，其产量达160μg/mL以上。对复苏一周的细胞进行亚克隆，选择高表达的亚克隆，以1.5×105cell/mL共2mL接种6孔板，每24小时收上清，ELISA分析蛋白分泌量，台盼篮染色计算细胞的总数和死亡率，测试细胞倍增性能和蛋白分泌量，图13显示亚克隆细胞株倍增曲线和存活率，图14是亚克隆细胞株抗体累积分泌量曲线。抗体分泌最旺盛的一天是第六天，1.68×106个细胞总数，抗体分泌量为203.1111ug/mL，因此，产量为203.1111ug/mL×2mL/1.68＝241.8ug/24h/1×106个细胞。7天抗体分泌总量为564.5556ug/mL，即1.129mg/7天/6孔板培养，其表达量已达到商用标准。
采用普通的稳定细胞系构建的方法，随着细胞的传代，阳性率不断下降，表达量也不断下降。表3是普通转染方法与本申请转染方法的比较结果，图9是普通转染方法与本申请转染方法传代次数与克隆阳性率的比较。
表3普通转染方法与本申请转染方法的比较结果
应用实例4高分泌CD20嵌合抗体稳定转染细胞系的构建转染方法与应用实例3完全相同，该方法同样适用于其它抗体高产细胞株的构建。该实例靶向表达载体采用pTGS-GL-site。待潮霉素抗性克隆生长后，胰酶消化并收集克隆传代，加压前的抗体分泌量为25ug/24小时/1×106个细胞。目前正在对该高分泌抗CD20抗体细胞株进行加压扩增。
对应用实例3和4表达的抗体采用SDS-PAGE电泳分离，标准品选用Pierce公司生产的人IgG，样品为SARS IgG1型抗体和CD20IgG1型抗体，电泳分离后转印至硝酸纤维素膜，4℃、100V、转移50min。取出膜，5％脱脂奶TBST室温封闭1h，洗膜三次，加辣根过氧化物酶标羊抗人抗体IgG(H+L)室温反应1h，洗涤三次，ECL系统(Pierce)显色，X感光胶片曝光30～60s，显影、定影。Western Blot结果显示表达的蛋白分子量与人IgG相等，图7是Western Blot结果图。
对应用实例4的CD20IgG1型抗体进行间接免疫荧光及流式细胞分析仪(FACS)分析，取对数生长期的Daudi细胞，2％FBS-PBS洗3次，每管分装2×105个细胞，取相应样品50uL与Daudi细胞4℃孵育20min，2％FBS-PBS洗3次，加入FITC-羊抗人IgG Fc 50uL，4℃避光反应20min。2％FBS-PBS洗4次，倒置荧光显微镜观察细胞膜表面荧光，1％多聚甲醛固定，流式细胞分析仪(FACS)分析细胞表面平均荧光强度及阳性率。图8是流式细胞分析(FACS)及间接免疫荧光结果图，显示表达的抗CD20抗体具有很强的结合活性。
本领域技术人员在了解本申请说明书中的教导以后，完全可以理解，本申请的范围并不局限于本申请实施例中的具体实例，本申请的范围由权利要求书限定。
权利要求
1.一种整合标记载体，包括以下元件或序列A.显性选择标记；B.筛选标记；C.一或多个扩增基因；D.在微生物中增殖的遗传元件；E.重组信号序列；其中，筛选标记和显性选择标记以融合蛋白形式表达，启动子和融合蛋白之间插入重组信号序列，起始密码子ATG位于重组信号序列之前，共同受控于一个弱化的启动子；而扩增基因也采用弱化的病毒启动子。
2.权利要求1的载体，其中调控融合蛋白表达的启动子是弱化的病毒启动子。
3.权利要求1的载体，其中调控融合蛋白和扩增基因表达的启动子是相同的弱化病毒启动子。
4.权利要求1的载体，其中显性选择标记选自编码下列物质的基因印度异壁链霉菌腐草霉素抗性、潮霉素磷酸转移酶、新霉素抗性、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶、嘌呤霉素、二氢乳清酸酶谷氨酰胺合成酶、组氨酸D、氨甲酰磷酸合成酶、二氢叶酸还原酶、天冬氨酸转氨甲酰酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶和腺苷脱氨酶。
5.权利要求1的载体，其中筛选标记为编码细胞表面蛋白质、荧光蛋白和酶的基因。
6.权利要求1的载体，其中扩增基因选自二氢叶酸还原酶、腺苷脱氨酶、二氢乳清酸酶谷氨酰胺合成酶和氨甲酰磷酸合成酶。
7.权利要求1的载体，其中在微生物中增殖的遗传元件包括微生物的复制起始点和抗生素抗性标记。
8.权利要求1的载体，其中重组信号序列选自FRT、Loxp和AttB/AttP。
9.权利要求1的载体，其中含有A.显性选择标记基因印度异壁链霉菌腐草霉素抗性基因；B.筛选标记β-半乳糖苷酶基因；C.扩增基因二氢叶酸还原酶基因，该基因受弱化的SV40病毒启动子调控，该启动子中删除了-321～-250位的72bp增强子序列，将-245～-243位的72bp增强子序列的5～7位碱基由TGG突变为GTT；D.复制起始点ColE1和表达氨苄青霉素抗性的bla基因；E.重组信号序列FRT；其中，在载体中，按转译方向，依次是病毒SV40弱化启动子，起始密码子ATG，重组信号序列FRT，筛选标记β-半乳糖苷酶基因，显性选择标记印度异壁链霉菌腐草霉素抗性基因；其中该SV40弱化启动子中缺失了-321～-224位的98bp增强子序列。
10.权利要求1的载体，其为pTGS-FRT-DHFR。
11.一种靶向表达载体，包括以下元件或序列A.显性选择标记；B.在微生物中增殖的遗传元件；C.重组信号序列；D.目标基因表达盒；E.真核生物病毒的复制起点，其中，该载体中的显性选择标记不同于权利要求1的整合标记载体中的显性选择标记，该显性选择标记基因没有启动子和起始密码子；重组信号序列插入显性选择标记之前，该重组信号序列与权利要求1的整合标记载体中的重组信号序列相同。
12.权利要求11的载体，其中显性选择标记选自编码以下蛋白质的基因印度异壁链霉菌腐草霉素抗性、潮霉素磷酸转移酶、新霉素抗性、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶、嘌呤霉素、二氢乳清酸酶谷氨酰胺合成酶、组氨酸D、氨甲酰磷酸合成酶、二氢叶酸还原酶、天冬氨酸转氨甲酰酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶和腺苷脱氨酶。
13.权利要求11的载体，其中在微生物中增殖的遗传元件为微生物的复制起始点和抗生素抗性标记。
14.权利要求11的载体，其中重组信号序列选自FRT、Loxp和AttB/AttP。
15.权利要求11的载体，其中目标基因表达盒中包括SP163增强子，CMV立早基因启动子，内质网膜信号肽，目标基因序列和牛生长激素腺苷酸加尾信号。
16.权利要求15的载体，其中目标基因编码选自以下的蛋白免疫球蛋白、细胞表面受体、胞内受体、激素、细胞因子、生长因子、转录因子、酶。
17.权利要求11的载体，其中真核生物病毒复制起点为SV40 ori或EBV ori。
18.权利要求11的载体，其中含有A.显性选择标记潮霉素磷酸转移酶基因；B.复制起点ColE1和表达氨苄青霉素抗性的bla基因；C.重组信号序列FRT；D.SP163增强子，CMV立早基因启动子，内质网膜信号肽，抗体轻链可变区、轻链恒定区和牛生长激素腺苷酸加尾信号；E.真核生物病毒复制起点SV40 ori。
19.权利要求11的载体，其中含有A.显性选择标记潮霉素磷酸转移酶基因；B.复制起点ColE1和表达氨苄青霉素抗性的bla基因；C.重组信号序列FRT；D.SP163增强子，CMV立早基因启动子，内质网膜信号肽，抗体重链可变区、重链恒定区和牛生长激素腺苷酸加尾信号；E.真核生物病毒复制起点SV40 ori。
20.权利要求11的载体，其为pTGS-SARS1-site、pTGS-GL-site或pTGS-MH-140-site。
21.基因组中含有可扩增高转录活性位点的细胞株的构建方法，包括以下步骤A.将权利要求1-10之一的整合标记载体在非关键的位置处线性化，以不影响所有元件的正常功能为准，然后使用该线性化载体通过非同源重组机制转化出发哺乳动物细胞株；B.利用针对显性选择标记的选择压力筛选步骤A获得的转化细胞，获得整合标记载体在基因组较高转录活性位点处整合的克隆；C.测定步骤B获得的克隆的筛选标记基因表达量，获得筛选基因高表达的克隆，即整合标记载体插入基因组中高转录活性位点处的克隆；D.利用针对扩增基因的选择压力筛选步骤C获得的克隆，获得扩增基因被扩增的克隆，即基因组中含有可扩增的高转录活性位点的细胞株。
22.权利要求21的方法，其中步骤B和D中的选择压力是逐步增加的。
23.权利要求21的方法，其中步骤A中的转化方式是电穿孔、磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖或脂质体转染。
24.权利要求21-23之一的方法，其中整合标记载体是权利要求10的载体，出发哺乳动物细胞株是CHO-dhfr-。
25.获得目标基因高表达的哺乳动物重组细胞株的方法，包括以下步骤A.利用权利要求21-24之一的方法获得基因组中含有可扩增的高转录活性位点的细胞株；B.用权利要求11-20之一的靶向表达载体和重组酶表达载体以超螺旋形式共转染步骤A获得的细胞株，所述重组酶表达载体瞬时表达位点特异性重组酶，该重组酶催化靶向表达载体和整合在基因组上的整合标记载体在重组信号序列处发生位点特异性重组；C.利用针对靶向表达载体中选择标记的选择压力筛选步骤B获得的转染克隆，获得目标基因插入扩增基因侧翼的克隆，即目标基因高表达的哺乳动物重组细胞株。
26.权利要求25的方法，还包括以下步骤D利用针对扩增基因的选择压力筛选步骤C获得的克隆，获得目标基因高表达的哺乳动物重组细胞株。
27.权利要求26的方法，还包括以下步骤E对步骤C或者步骤D获得的目标基因高表达的哺乳动物重组细胞株进行传代。
28.权利要求27的方法，其中步骤E在选择压力下进行。
29.权利要求28的方法，其中选择压力是针对扩增基因的选择压力。
30.权利要求25的方法，其中步骤B中共转染的方式是电穿孔、磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖或脂质体转染。
31.权利要求25-30之一的方法，其中选择压力是逐步增加的。
32.权利要求31的方法，其中整合标记载体是权利要求10的载体，靶向表达载体是权利要求20的载体，重组酶载体是pOG44，出发哺乳动物细胞株是CHO-dhfr-。
33.一种快速构建高分泌重组蛋白细胞株的体系，该体系包括A.权利要求1-10之一的整合标记载体；B.权利要求11-20之一的靶向表达载体；C.重组酶表达载体，该重组酶表达载体可瞬时表达位点特异性重组酶，所述重组酶可以催化整合在出发哺乳动物细胞株基因组上的整合标记载体与靶向表达载体在重组信号序列处发生位点特异性重组；D.出发哺乳动物细胞株。
34.权利要求33的体系，其中出发哺乳动物细胞株选自CHO-dhfr-、COS、Hela、NIH 3T3和NS0骨髓瘤细胞。
35.权利要求33的体系，其中所述整合标记载体是权利要求10的载体，靶向标记载体是权利要求20的载体，重组酶表达载体是pOG44，出发哺乳动物细胞株是CHO-dhfr-。
全文摘要
本发明涉及应用突变与重组技术筛选可扩增性的高转录活性位点，并在位点处插入标记的方法。本发明还涉及应用位点特异性重组机制快速构建并获得目标基因高表达的哺乳动物细胞系的方法，即应用重组酶识别和切割一对重组信号序列(整合标记载体与靶向表达载体各具有一个)，完成位点特异性重组，实现目标基因的稳定高表达。
文档编号C12N15/65GK1693467SQ20051006433
公开日2005年11月9日 申请日期2005年4月14日 优先权日2005年4月14日
发明者黄英, 王琰, 沈倍奋, 黎燕 申请人:北京天广实生物技术有限公司