专利名称：一种E.aero菌株中编码1,3－丙二醇氧化还原酶的基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程、酶工程、微生物学、生物化学等领域，具体涉及一种高产1，3-丙二醇(简称1，3-PD)的产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes，简写为E.aero)菌株(2001年1月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC 0532，北京市海淀区中关村北一条13号)，还涉及该菌株中编码1，3-丙二醇氧化还原酶的基因(dhaT)。
背景技术：
1，3-PD微生物发酵法生产可分为一步法和二步法。一步法是指以玉米糖为底物经工程菌直接转化为1，3-PD；二步法是指以玉米糖为底物先经酵母菌转化为甘油，而后再以甘油为底物经厌氧微生物发酵转化为1，3-PD。1，3-PD微生物发酵法生产的研究始于20世纪90年代初期，此期间主要研究二步法中甘油转化为1，3-PD菌株选育，迄今为止，已经发现能产生1，3-PD的微生物菌株有Klebsiella、Citrobacter、Clostridium Lactobacillus、Enterobacter、Ilyobacter和Pelobacter，Klebsiella pneumoniae(简称K.pneu)和Clostridium butyricum(简称C.but)是研究最多的菌株(Barbirato，F.，1995；Slaugh，1995)，这些微生物将甘油转化为1，3-PD时需2步酶催化反应。第一步，甘油脱水酶将甘油转化为3-羟基丙醛(3-HPA)和1分子水(1)；第二步，3-羟基丙醛在1，3-PD氧化还原酶的作用下形成1，3-PD(2)。
(1)(2)在此反应过程中形成的1，3-PD不再被代谢，而是在培养液中高度聚集。甘油歧化形成1，3-PD是在厌氧条件下，且甘油作为唯一碳源并缺少其它的外源还原当量受体的情况下完成的。在这些条件下，甘油歧化的同时还存在并列路径，它们是甘油脱氢酶(与NAD+或NADP+偶联)将甘油氧化成二羟丙酮(DHA)(3)，而后二羟丙酮在二羟丙酮激酶催化下转化为磷酸二羟丙酮(DHAP)(4)；继而DHAP进入糖酵解途径。与1，3-PD生成路径相比，此途径可(3)(4)提供碳源和能量并产生NADH。90年代中期以后，主要侧重于研究1，3-PD产生机理、用基因工程方法构建一步法生产1，3-PD高产工程菌，目前处于构建阶段。
近年来，随着分子生物学理论的不断发展，基因工程技术的不断成熟，微生物发酵法生产1，3-PD基因工程技术的研究已经开始。Tong.H(1991)和Daniel.R(1995)等研究发现，K.pneu能在含甘油的培养基上生长并产生1，3-PD，是由于其基因上带有dha调节子。不带有dha调节子系统的E.coli，由于没有外源电子受体，不能在甘油上厌氧生长也不能产生1，3-PD。他们在E.coli AG1中构建了K.pneu ATCC25955基因文库，使得E.coli AG1能在甘油和二羟丙酮上厌氧生长，并筛选出高产1，3-PD的菌株，从分离出的pTC1重组质粒(全长42.5kb)上发现该质粒拥有dha调节子所指导的四种酶基因甘油脱水酶(dhaB)、1，3-丙二醇氧化还原酶(dhaT)、甘油脱氢酶(dhaD)和二羟丙酮激酶(dhaK)。这四种酶都是受甘油的存在与否诱导的。Frank A.Skraly(1998)等研究发现，在K.pneu的天然DNA中，控制1，3-PD产生的基因主要有dhaT和dhaBdhaB基因——编码甘油脱水酶；dhaT基因——编码1，3-PD氧化还原酶，dhaT和dhaB实际上由两个不同的启动子的控制下及在不同的方向转录(图1)。
K.pneu DNA片段核苷酸序列分析(图1)表明，在这个片段中含有dhaB(3a，4a，4)和dhaT(2)基因的ORFs，但dhaT和dhaB基因的转录方向是相反的。
在1，3-PD分批发酵生产中，1，3-PD的最大产量是50～60g/L，在常规的连续培养中，C.but只能获得K.pneu菌株1，3-PD最大产量(大约为48.75g/L)的一半，但由于前者是病原菌而逐渐被淘汰，鉴于C.but菌株的安全性，在国外它是最具有工业使用潜力的菌株。但C.but菌株生产1，3-PD的产量较低，需要筛选具有安全性且1，3-PD高产的菌株。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的具有安全性且1，3-PD高产的菌株，该菌株是从沈阳淡水湖淤泥中分离的产气肠杆菌(E.aero)，经物理、化学方法单独诱变及物理和化学复合诱变，选育出的一株1.3-PD高产突变株，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC 0532。该菌株的1，3-PD产量已经超过了C.but菌株的生产能力，在最适发酵条件下，30L发酵罐中CGMCC 0532菌株1，3-PD产量为48.56g/L，且该菌株为兼气性，是一株很有研究价值和应用潜力的菌株。
本发明的另一目的是提供一种分离的dhaT基因，其来源于上述的产气肠杆菌1.3-PD高产突变株CGMCC 0532菌株。经测定，该dhaT基因如SEQ ID NO1所示，全长为1164bp，是以ATG起始密码子开始，TGA终止密码子结束。该dhaT基因编码387个氨基酸的蛋白质，如SEQ IDNO2所示，所表达的蛋白质分子量为43KDa，所表达蛋白质的酶活为39μM/mg。
具体地，本发明提供以下技术方案
提供一种生产1，3-丙二醇(1，3-PD)的产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes，简写为E.aero)菌株，其保藏号为CGMCC 0532。
提供一种分离的编码1，3-丙二醇氧化还原酶的基因，其具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
提供一种由SEQ ID NO1所示的核苷酸序列编码的1，3-丙二醇氧化还原酶，其具有如SEQID NO2所示的氨基酸序列。
提供一种分离的编码1，3-丙二醇氧化还原酶的基因，其编码具有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
提供一种具有编码1，3-丙二醇氧化还原酶活性的基因，其为编码SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的基因的一个或几个核苷酸发生取代、缺失、置换或插入后所获得的基因。
提供一种重组载体，其包含上述的基因。
提供一种由上述基因或者由上述重组载体转化的宿主细胞。
图1表示K.pneu DNA片段核苷酸序列分析图，在这个片段中含有dhaB(由3a、4a和4所示的3段基因组成)和dhaT(如2所示)基因的ORFs，dhaT和dhaB基因的转录方向是相反的。
图2表示CGMCC 0532菌株基因组DNA电泳图，其中M表示DNA标准λ-Hin d III(Kb)，A表示CGMCC 0532菌株基因组DNA。
图3表示质粒载体pMD18-T的酶切图谱。
图4表示表达载体pMAL-c2X的酶切图谱。
图5表示构建的融合基因表达载体pMC58的酶切图谱。
图6表示SDS-PAGE电泳图，其中A表示诱导细胞，B表示纯化的融合蛋白，C表示纯化的dhaT蛋白，D表示未诱导细胞，M表示蛋白标准(kDa)。
具体实施例方式
实施例1CGMCC 0532菌株基因组DNA提取将本发明所述的CGMCC 0532菌株活化后，接种至8ml LB液体培养基(组分浓度为1％(W/V)蛋白胨，0.5％(W/V)酵母提取物，1％(W/V)NaCl)中，30℃培养过夜。将上述培养过夜的液体种子，按3～5％的接种量接种于200ml LB液体培养基中，30℃培养至对数生长中期。将上述菌液在4℃下离心10000rpm，10～15min，弃上清液。收集的菌体用2ml无菌纯水悬浮，在4℃下、离心5000rpm，10min，弃上清液，重复此操作二次。在收集的菌体中，加入400μl无菌纯水，在震荡器上振荡悬浮，加入100μl溶菌酶(10mg/ml)，使终浓度达到2mg/ml，在37℃超级恒温水浴中，恒温30min。加入30μl 20％的SDS，使终浓度达到1％。加入蛋白酶60μl(20mg/ml)，使终浓度达到2mg/ml。加无菌纯水，使最终体积达到600μl。加入1μlRNaseA(40mg/ml)，37℃恒温水浴3h。采用苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)溶液处理三次。再用20μl无菌纯水或TE溶液(组分浓度为100Mm Tris-HCl，10mM EDTA)溶解，即获得CGMCC 0532菌株的基因组DNA溶液。
对CGMCC 0532菌株基因组DNA的纯度及完整性检测如下取上述5μl DNA溶液稀释至200μl，用紫外分光光度计测量260nm、280nm的OD值，并用1％的琼脂糖凝胶电泳在260～280V，30mA的电压下快速检测CGMCC 0532菌株DNA的完整性。实验结果，OD260/OD280＝1.9＞1.8，说明提取到高纯度的CGMCC 0532菌株基因组DNA；电泳结果表明提取到的CGMCC 0532菌株基因组DNA是完整的(图2)。在图2中，M表示DNA标准λ-Hind III(Kb)，A表示CGMCC 0532菌株基因组DNA。
实施例2dhaT基因PCR克隆1.PCR法克隆dhaT基因1.1引物的设计与合成根据K.pneu菌株的dhaT基因(如SEQ ID NO3所示)，设计并合成用于dhaT基因扩增的寡核苷酸引物，在上游引物的5′端设计了Hind III酶切位点，下游引物的5′端设计了EcoR I酶切位点。
PCR引物dhaT F 5′-AAG CTTATG AGC TAT CGT ATG TTT GAT TAT CTG-3′(SEQ ID NO4)dhaT R 5′-G AAT TCT CAG AAT GCC TGG CGG AAA AT-3′(SEQ ID NO5)1.2PCR克隆dhaT基因用LA TaqTM、pyrobest Taq、EX TaqTM试剂盒(购自宝生物工程(大连)有限公司，产品编号分别为DRR002A或DRR002B；DR005A或DR005B；DRR001A或DRR001B或DRR001C)，以CGMCC 0532菌株基因组DNA为模板，dhaTF/dhaTR为引物，作PCR。
第一PCR反应体系dNTP(各0.5mM)8μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，10×LA缓冲液5μl，基因组DNA 2μl，引物dhaT R(0.5μM)0.5μl，引物dhaT F(0.5μM)0.5μl，加无菌纯水至50μl。
反应条件起始解链温度为94℃，时间为1min；在随后的每个循环节中，解链在98℃10s，退火在50～55℃30～45s，延伸在72℃1～2min，共计30～35个循环。反应结束后，反应体系保存在4℃。
第二PCR反应体系dNTP(各0.5mM)8μl，LATaq DNA聚合酶0.5μl，10×LA缓冲液5μl，基因组DNA 2μl，引物dhaT R(0.5μM)0.5μl，引物dhaT F(0.5μM)0.5μl，加无菌纯水至50μl。
反应条件起始解链温度为94℃，时间为1min；在随后的每个循环节中，解链在98℃10s，退火在55℃30s，延伸在72℃1min，共计30个循环。反应结束后，反应体系保存在4℃。
1.3PCR扩增出的dhaT基因直接测序以dhaT seqF和dhaT seqR为引物进行测序。
dhaT seqF5′-CCG ATT TCC CGT ATA TGG-3′(SEQ ID NO6)dhaT seq R5′-TGG TGT CTT TAG GGT TTG-3′(SEQ ID NO7)测得的序列如SEQ ID NO1中所示。
2.dhaT基因克隆至pMD18-T载体并测序2.1dhaT基因插入片段的调整a.以上述PCR产物为模板，dhaT F/dhaT R为引物，800μl LA Taq DNA聚合酶反应体系PCR扩增dhaT基因。
b.将PCR产物用乙醇浓缩，25μl无菌纯水溶解沉淀，加入25μl 3M NaAc和2.5倍体积无水冷乙醇，于-80℃冰箱中保存20min，4℃离心13500rpm 15～20min，弃上清液，将沉淀部分用TE溶液或无菌纯水溶解。
c.片段回收DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离后，再用NaI回收。
d.片段纯化采用乙醇、聚乙二醇或异丙醇纯化。
2.2连接将纯化后的DNA片段与酶切(Hind III/EcoR I)精制后的pMD18-T载体(购自宝生物工程(大连)有限公司，产品编号为D504A或D504B或D504C，该产品结构如图3)用DNA连接酶连接。本发明中使用DNA连接试剂盒(购自宝生物工程(大连)有限公司，产品编号为D2050)。
反应体系为pMD18-T 1μl，DNA 3μl，连接缓冲液5μl，加无菌纯水至10μl。
反应条件为16℃，1h。
2.3转化将连接液全部热转化(或电击转化)至大肠杆菌JM109(购自宝生物工程(大连)有限公司，产品编号为D3050)中。
2.4检验用pMD18-T载体上引物RV-M(如SEQ ID NO8所示)和PCR引物dhaT R，采用PCR方法进行检验。
PCR检验第一反应体系为dNTP 4μl，LA缓冲液2.5μl，引物RV-M 0.5μl，引物dhaTR0.5μl，LATaq 0.5μl，菌液10μl，加无菌纯水至25μl。反应条件起始解链温度为94℃，时间为1min；在随后的每个循环节中，解链在98℃10s，退火在55℃30s，延伸在72℃1min，共计30个循环。反应结束后，反应体系保存在4℃。
PCR检验第二反应体系为dNTP 8μl，2X GC缓冲液25μl，引物RV-M 0.5μl，引物dhaTR0.5μl，LA Taq 0.5μl，菌液10μl，加无菌纯水至50μl。反应条件与PCR检验第一反应体系的条件相同。
2.5植菌PCR检验有目的带的菌落挑取少量，植入3ml LB培养基中，37℃160～200rpm振荡培养过夜。
2.6质粒提取具体操作方法采用《分子克隆实验指南》，第二版，萨姆布鲁克等，1998。介绍的碱裂解法进行。
2.7测序以pMD18-T载体的测序引物RV-M(如SEQ ID NO8所示)和M13-47(如SEQ ID NO9所示)进行测序。经测得，pMD18-T载体测序和dhaT基因PCR产物直接测序的结果完全相同。
实施例3dhaT基因表达以pMAL-c2X质粒(购于New England Biolabs公司，产品编号为E8000S，结构见图4)构建了融合基因表达载体pMC58(结构见图5)。测序结果表明，pMC58表达载体上的dhaT基因为全长dhaT基因。
在1升LB培养基中，按1％的接种量接入含有pMC58的大肠杆菌JM109的培养物，加入IPTG使终浓度达到0.4～0.8mM，malE基因和dhaT基因构成的融合基因表达的融合蛋白；经SDS-PAGE电泳表明融合蛋白分子量为85KDa，表达电泳结果(见图6，B带)。图6中A诱导细胞，B纯化的融合蛋白，C纯化的dhaT蛋白，D未诱导细胞，Mh(kDa)200，160，97，4，66，45，ML(kDa)97，4，66，45，31，21.5，14.5。
实施例4dhaT基因表达的蛋白质的分离与纯化以购自New England Biolabs的pMAL-c2X融和蛋白纯化系统纯化dhaT蛋白，malE基因和dhaT基因构成的融合基因表达的融合蛋白分子量为85KDa；纯化的融合蛋白经FactorXa酶切，经离子交换层析分离得到了dhaT基因表达的蛋白质，经SDS-PAGE电泳表明蛋白质分子量为43KDa(见图6，C带)。
实施例5dhaT基因表达的蛋白质的酶活测定25℃时，分光光度计法测定365nm，1，3-PD氧化还原酶将三羟基丙醛转化为1，3-PD起始NADH的消耗量。酶活定义为，每分钟NADH消耗微摩尔数。
实验结果表明dhaT基因表达的蛋白质的酶活为39μM/mg。
序列表<110>迟乃玉<120>一种E.aero菌株中编码1，3-丙二醇氧化还原酶的基因<130>1，3-丙二醇氧化还原酶<160>9<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1164<212>DNA<213>Enterobacter aerogenes<400>1atgagctatc gtatgtgcga ttatctggtg ccaaatgtga acttgcctgg cccgaatgct 60atgcccgttg tcggcgaacg ctgcaaactg ttgggcggta aaaaagcgct gctggtgact 120gataaaggtc tgcgaattat taaggacggc gcggttgata aaacgctcga acatctgcgt 180gaagccttta ttgacgtggt ggtgtttgac ggattcgagc caaacattaa agacaccaac 240gtgcgcgacg gcctggacgt ttgtcgtaaa gagcagtgcg atatcatcgt taccgtcggc 300ggtggtagcc cgcatgactg cggtaaaggc atcggtatcg cggcgacgca cgaaggcgat 360ctctatagct atgccatgat tgaaaccctg accaatccgc tgccgccgat cgtcgcggtg 420aataccaccg ccagtaccgc cagcgaagtc acccgtcact gcttgctgac caataccaaa 480accaaagtga agtttgtgat tgtcagttgg cgaaacctgc cgtcggtttc cattagtgac 540cctctgctga tgctcggcaa acctgcgcca ctgactgcgg caacaggaat ggacgccctg 600acccacgccg ttgaggccta tatttcaaaa gatgccaacc cggttaccga cgccgccgct 660atccaggcaa ttcgtctgat cgcccgcaac ttacgccagg ccgtagcact gggcagcaac 720ctgaaagctc gcgagaatat ggcctatgcc tctttgctgg cgggtatggc cttcaacaac 780
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Ile Ala Ala Thr His Glu Gly Asp Leu Tyr Ser Tyr Ala Met Ile Glu115 120 125Thr Leu Thr Asn Pro Leu Pro Pro Ile Val Ala Val Asn Thr Thr Ala130 135 140Ser Thr Ala Ser Glu Val Thr Arg His Cys Leu Leu Thr Asn Thr Lys145 150 155 160Thr Lys Val Lys Phe Val Ile Val Ser Trp Arg Asn Leu Pro Ser Val165 170 175Ser Ile Ser Asp Pro Leu Leu Met Leu Gly Lys Pro Ala Pro Leu Thr180 185 190Ala Ala Thr Gly Met Asp Ala Leu Thr His Ala Val Glu Ala Tyr Ile195 200 205Ser Lys Asp Ala Asn Pro Val Thr Asp Ala Ala Ala Ile Gln Ala Ile210 215 220Arg Leu Ile Ala Arg Asn Leu Arg Gln Ala Val Ala Leu Gly Ser Asn225 230 235 240Leu Lys Ala Arg Glu Asn Met Ala Tyr Ala Ser Leu Leu Ala Gly Met245 250 255Ala Phe Asn Asn Ala Asn Leu Gly Tyr Val His Ala Met Ala His Gln260 265 270Leu Gly Gly Leu Tyr Asp Met Met His Gly Val Ala Asn Val Val Leu275 280 285Leu Pro His Val Ala Arg Tyr Asn Leu Ile Ala Asn Pro Glu Lys Phe290 295 300Ala Asp Ile Ala Glu Phe Met Gly Glu Asn Thr Asp Gly Leu Ser Thr305 310 315 320Met Asp Ala Ala Glu Leu Ala Ile Arg Ala Ile Ala Arg Leu Ser Ala325 330 335Asp Ile Gly Arg Pro Gln His Leu Arg Glu Leu Gly Val Lys Glu Ala340 345 350
Asp Phe Gln Tyr Met Ala Glu Met Ala Leu Lys Asp Gly Asn Ala Phe355 360 365Ser Asn Pro Arg Lys Gly Asn Glu Lys Glu Ile Ala Glu Ile Phe Arg370 375 380Gln Ala Phe385<210>3<211>1164<212>DNA<213>Klebsiella pneumoniae<400>3atgagctatc gtatgtttga ttatctggtg ccaaacgtta acttttttgg ccccaacgcc 60atttccgtag tcggcgaacg ctgccagctg ctgggcggga aaaaagccct gctggtcacc 120gacaaaggcc tgcgggcaat taaagatggc gcggttgata aaaccctgca ttatctgcgg 180gaggccggga tcgaggtggc gatctttgac ggcgtcgagc cgaacccgaa agacaccaac 240gtgcgcgacg gcctcgccgt gtttcgccgc gaacagtgcg acatcatcgt caccgtgggc 300ggcggcagcc cgcacgattg cggcaaaggc atcggcatcg ccgccaccca tgagggcgat 360ctgtaccagt atgccggaat cgagaccctg accaacccgc tgccgcctat cgtcgcggtc 420aataccaccg ccggcaccgc cagcgaggtc acccgccact gcgtcctgac caacaccgaa 480accaaagtga agtttgtgat cgtcagctgg cgcaacctgc cgtcggtctc tatcaacgat 540ccactgctga tgatcggtaa accggccgcc ctgaccgcgg cgaccgggat ggatgccctg 600acccacgccg tagaggccta tatctccaaa gacgctaacc cggtgacgga cgccgccgcc 660atgcaggcga tccgcctcat cgcccgcaac ctgcgccagg ccgtggccct cggcagcaat 720ctgcaggcgc gggaaaacat ggcctatgct tctctgctgg ccgggatggc tttcaataac 780gccaacctcg gctacgtgca cgccatggcg caccagctgg gcggcctgta cgacatgccg 840
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<213>人工序列<400>7tggtgtcttt agggtttg 18<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>8agcggataac aatttcacac agg23<210>9<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>9cagcactgac ccttttggga ccgc 2权利要求
1.一种生产1，3-丙二醇(1，3-PD)的产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes，简写为E.aero)菌株，其保藏号为CGMCC 0532。
2.一种分离的编码1，3-丙二醇氧化还原酶的基因，其具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
3.一种由权利要求2所述的基因编码的1，3-丙二醇氧化还原酶，其具有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
4.一种分离的编码1，3-丙二醇氧化还原酶的基因，其编码具有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
5.一种具有编码1，3-丙二醇氧化还原酶活性的基因，其为权利要求4所述基因的一个或几个核苷酸发生取代、缺失、置换或插入后所获得的基因。
6.一种重组载体，其包含权利要求4或5所述的基因。
7.一种由权利要求4或5所述基因或者由权利要求5所述重组载体转化的宿主细胞。
全文摘要
本发明是提供一种分离的编码1，3－丙二醇氧化还原酶的基因(dhaT)，其来源于一种保藏号为CGMCC 0532的产气肠杆菌1.3－PD高产突变株。该dhaT基因全长为1164bp，是以ATG起始密码子开始，TGA终止密码子结束。该dhaT基因编码387个氨基酸的蛋白质，所表达的蛋白质分子量为43KDa，所表达蛋白质的酶活为39μM/mg。
文档编号C12N15/63GK1746292SQ20051006304
公开日2006年3月15日 申请日期2005年4月5日 优先权日2005年4月5日
发明者迟乃玉, 张庆芳 申请人:迟乃玉