专利名称：作为用于PPARδ调控标记物的ANGPTL4/FIAF的制作方法
背景技术：
过氧化物酶体增殖剂激活的受体(PPAR)是核激素受体超家族的成员。PPAR是配体激活的转录因子，它们调节基因表达和控制多条代谢途径。已经记载了三种亚型，它们是PPARα、PPARδ(也称作PPARβ)和PPARγ。PPARδ是普遍表达的。PPARα主要在肝脏、肾脏和心脏中表达。PPARγ有至少两种主要的异构体。PPARγ1在大多数组织中表达，而更长的异构体PPARγ2则在脂肪组织中几乎独占性地表达。PPAR调控多种生理响应，包括调节葡萄糖和脂类的稳态和代谢、能量平衡、细胞分化、炎症和心血管事件。
所有冠状动脉病患者的大约一半具有较低的血浆高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)浓度。大约在25年前首次认识到HDL的防止动脉粥样化的作用，并刺激了对影响HDL水平的遗传因素和环境因素的研究。HDL的保护功能来自它在称为反向胆固醇运输的过程中的作用。HDL介导周边组织的细胞(包括在动脉壁的动脉粥样硬化病灶中的那些)中的胆固醇的去除。HDL再将其胆固醇运送到肝脏和固醇代谢器官中，以转化成胆汁并消除。来自Framingham研究的数据表明，HDL-C的水平预测冠状动脉病的风险，其独立于LDL-C(低密度脂蛋白胆固醇)水平(Gordon等，Am.J.Med.1977，62，707-714)。在20岁和更大的其HDL-C低于35mg/dl的美国人中，估计的校正年龄的流行是16％(男性)和5.7％(女性)。通过用多种制剂中的烟酸治疗，目前能实质上增加HDL-C。但是，实质上的副作用限制了该方案的治疗潜力。
在美国的1400万诊断为II型糖尿病的患者中，多达90％是超重或肥胖的，且高比例的II型糖尿病患者具有异常的脂蛋白浓度。在糖尿病患者中，总胆固醇超过240mg/dl的发生率是37％(男性)和44％(女性)。LDL-C超过160mg/dl的比率分别是31％和44％，HDL-C低于35mg/dl的比率分别是28％和11％。糖尿病是一种患者控制血液中的葡萄糖水平的能力降低的疾病，因为胰岛素的作用引起了部分的病害。II型糖尿病(T2D)也称作非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)，在发达国家中占全部糖尿病患者的80-90％。在T2D中，胰腺的胰岛持续生成胰岛素。但是，胰岛素能发生作用的靶器官(主要是肌肉、肝脏和脂肪组织)表现出很强的对胰岛素刺激的抗性。机体继续通过产生非生理学上的高水平的胰岛素来补偿，由于生成胰腺胰岛素能力的衰竭和缺陷，其最终在疾病的后期发生降低。所以，T2D是一种心血管代谢综合征，并伴有多种并发症，包括胰岛素抗性、血脂异常、高血压、内皮功能障碍和炎性动脉粥样硬化。
血脂异常(dyslipidemia)和糖尿病的首选治疗通常涉及低脂肪和低葡萄糖饮食、锻炼和减肥。但是，顺应性是中等的，并且随着疾病的发展，还必须治疗各种代谢缺陷，例如用调脂剂例如士他汀(statins)和贝特(fibrate)治疗血脂异常，用降血糖药(例如磺酰脲或二甲双胍)治疗胰岛素抗性。最近已经公开了一类有前途的新药，它能使患者对它们自身的胰岛素重新变得敏感(胰岛素敏化剂)，由此将血液中的葡萄糖和甘油三酯的水平恢复到正常，并且在许多情况下能消除或减少对外源性胰岛素的需求。吡格列酮(ActosTM)和罗格列酮(AvandiaTM)属于噻唑烷二酮(TZD)类PPARγ-激动剂，并且是该类中的第一种在许多国家被批准用于NIDDM的药物。但是，这些化合物具有副作用，包括罕见但是严重的肝脏毒性(如用曲格列酮时所见到的)。它们还会增加患者的体重。因此，迫切需要新的、更有效的、更安全的和更少副作用的药物。近期的研究证实了，PPARδ的激动会导致具有增强的治疗潜力的化合物，即这样的化合物能够改善脂类代谢分布(profile)，与目前的治疗相比具有优越的升高HDL-C的效果，且在使胰岛素水平正常化方面具有其它的正面作用(Oliver et al；ProcNat Acad Sci USA 2001；985306-11)。近期的观察还表明，除了其在降低甘油三酯中的熟知的作用外，还存在独立的PPARα介导的胰岛素敏感化的作用(Guerre-Millo et al；J Biol Chem 2000；27516638-16642)。这样，选择性的PPARδ激动剂或具有附加的PPARα活性的PPARδ激动剂会显示出优越的治疗功效，且没有副作用，例如用PPARγ激动剂时看到的体重增加。
发明内容
本发明涉及用于PPARδ调控的标记、诊断与PPARδ活性失调相关的疾病的方法、监测患有与PPARδ活性失调相关疾病的患者的治疗的方法以及鉴别能调控PPARδ活性的化合物的方法。
编码促血管生成素样蛋白4(ANGL-4、ANGPTL4)(也称作禁食诱导的脂肪因子(FIAF)、PPARγ促血管生成素相关蛋白(PGAR)和肝纤维蛋白原/促血管生成素-相关蛋白(HFARP))的基因被鉴别为指导PPARδ的靶基因，且该基因可以用作PPARδ的生物标记。
ANGPTL4已经被描述为PPARα和PPARδ的靶基因。ANGPTL4的mRNA的表达受到肝脏中的PPARα的刺激，而PPARγ刺激高度血管化的组织(例如脂肪和胎盘)中的ANGPTL4的选择性表达。这与ANGPTL4在对禁食的代谢响应中的暗示一致(Kersten等，J.Biol.Chem.2000，275，28488-28493；Yoon等，Mol.Cell.Biol.2000，20，5343-5349)。
但是，本发明证实，在某些组织和细胞中的PPARδ对ANGPTL4基因的贡献比PPARα或PPARγ更大。特别是在肌细胞中，ANGPTL4基因主要由PPARδ激活。因此，本发明能够将PPARδ引起的应答与PPARα引起的应答区别开。
本发明提供了作为标记的ANGPTL4在检测或监测PPARδ调控中的应用。在一个优选的实施方案中，ANGPTL4是作为标记用于检测或监测肌肉中的PPARδ调控。
如这里所使用的术语“调控”是指激活或抑制PPARδ的转录活性。从而，ANGPTL4可以作为调控PPARδ活性的标记。
如这里所使用的术语“标记”是指核酸或多肽。
本发明还涉及作为标记的ANGPTL4在诊断涉及PPARδ活性失调的疾病(例如血脂异常、肥胖或胰岛素抗性)中的应用。从而，ANGPTL4可以作为检测PPARδ活性调控的标记。
本发明还提供了一种检测或监测宿主中的PPARδ活性的方法，其包括定量ANGPTL4 mRNA的表达水平。小鼠ANGPTL4的代表性cDNA如SEQ.ID NO1所示。
在前述方法的一个实施方案中，ANGPTL4的mRNA的表达水平是相对于对照测定的。
宿主是能进行RNA转录(包括体外转录)的动物、组织、细胞或任何其它生物系统。优选地，动物是非人类的动物。对照可以是在不同宿主中的ANGPTL4的mRNA表达水平。
而且，本发明提供了一种检测测试化合物能否调控宿主中的PPARδ活性的方法，其包括a)将宿主暴露于测试化合物，和b)定量ANGPTL4的mRNA的表达水平。
在前述方法的一个实施方案中，ANGPTL4的mRNA的表达水平是相对于对照测定的。
宿主可以是能进行RNA转录(包括体外转录)的动物、组织、细胞或任何其它生物系统。优选地，动物是非人类的动物。对照是在未治疗的宿主中的ANGPTL4的mRNA的表达水平，该宿主可以是治疗前的所述宿主或不同宿主，和/或为了正常化到治疗前水平而进行合适时间治疗后的所述宿主。在前述方法的一个优选实施方案中，调控PPARδ活性的化合物是拮抗剂或激动剂。
本发明还提供了一种监测患有与PPARδ活性失调相关疾病(例如血脂异常、肥胖或胰岛素抗性)的患者的治疗的方法，其包括下述步骤a)纯化来自从用PPARδ活性调控剂治疗的患者分离出的肌细胞的mRNA；和b)检测ANGPTL4的mRNA的表达。
在前述方法的一个实施方案中，ANGPTL4的mRNA的表达水平是相对于对照测定的。
宿主可以是能进行RNA转录(包括体外转录)的动物、组织、细胞或任何其它生物系统。优选地，动物是非人类的动物。对照是在未治疗的宿主中的ANGPTL4的mRNA的表达水平，该宿主可以是治疗前的所述宿主或不同宿主，和/或为了正常化到治疗前水平而进行合适时间治疗后的所述宿主。
本发明还涉及了通过前述方法鉴别出的化合物、通过前述方法鉴别出的化合物在制备用于治疗涉及PPARδ活性失调的疾病(例如血脂异常、肥胖或胰岛素抗性)的药物中的应用。
可以使用数种方法来检测ANGPTL4的mRNA的表达水平。例如RNA印迹和通过光密度测定法定量条带的方法是本领域熟知的，都可以使用，尽管它们可能不太精确。其它方法包括使用基因芯片、微阵列分析、点印迹或不同的定量PCR方法学。优选地，使用Taqman或实时定量PCR。ANGPTL4的转录序列的任何部分都可以用作探针。在一个优选实施方案中，ANGPTL4的mRNA的表达水平是通过使用表2所列的正向引物和反向引物(SEQ.ID NO4和5)的实时定量PCR来检测的。优选地，定量肌细胞中的ANGPTL4的mRNA的表达水平。
本发明还提供了一种检测或监测宿主中的PPARδ活性的方法，其包括定量ANGPTL4蛋白的表达水平。SEQ.ID NO3显示了小鼠ANGPTL 4的蛋白序列。
在前述方法的一个实施方案中，ANGPTL4的蛋白表达水平是相对于对照测定的。
宿主可以是能进行蛋白翻译(包括体外翻译)的动物、组织、细胞或任何其它生物系统。优选地，动物是非人类的动物。对照是在不同宿主中的ANGPTL4的蛋白表达水平。
本发明还提供了一种检测测试化合物能否调控宿主中的PPARδ活性的方法，其包括a)将宿主暴露于测试化合物，和b)定量ANGPTL4的蛋白表达水平。
在前述方法的一个实施方案中，ANGPTL4的蛋白表达水平是相对于对照测定的。
宿主可以是能进行蛋白翻译(包括体外翻译)的动物、组织、细胞或任何其它生物系统。优选地，动物是非人类的动物。对照是在未治疗的宿主中的ANGPTL4的蛋白表达水平，该宿主可以是治疗前的所述宿主或不同宿主，和/或为了正常化到治疗前水平而进行合适时间治疗后的所述宿主。可以用载体处理该宿主。载体可以是溶解或重悬浮有该化合物的溶剂。在前述方法的一个优选实施方案中，调控PPARδ活性的化合物是拮抗剂或激动剂。
而且，本发明还提供了一种监测患有与PPARδ活性失调相关疾病(例如血脂异常、肥胖或胰岛素抗性)的患者的治疗的方法，其包括下述步骤a)纯化来自从用PPARδ活性调控剂治疗的患者分离出的全血和/或肌细胞的蛋白；和b)检测ANGPTL4的蛋白表达。
在前述方法的一个实施方案中，ANGPTL4的蛋白表达水平是相对于对照测定的。
宿主可以是能进行蛋白翻译(包括体外翻译)的动物、组织、细胞或任何其它生物系统。优选地，动物是非人类的动物。对照是在未治疗的宿主中的ANGPTL4的蛋白表达水平，该宿主可以是治疗前的所述宿主或不同宿主，和/或为了正常化到治疗前水平而进行合适时间治疗后的所述宿主。
本发明还涉及通过前述方法鉴别出的化合物、通过前述方法鉴别出的化合物在制备用于治疗涉及PPARδ活性失调的疾病的药物中的应用。
可以使用数种方法来检测ANGPTL4蛋白的表达水平。这些方法包括但不限于双向凝胶分离、质谱分析法、抗体结合技术(ELISA、蛋白印迹)和免疫沉淀。优选地，定量肌细胞或血液中的ANGPTL4的蛋白表达水平。
本发明还提供了包含PPAR的结合位点的FIAF/ANGPTL4的调控区。人、小鼠、大鼠和狗的调控区位于相应的ANGPTL4基因的内含子3(SEQ.ID NO8-11)。优选地，该调控区包含4个结合位点。结合位点或PPAR效应元件(PPRE’s)包含核心DR1区，其优选地有13个核苷酸(见图3)。人ANGPTL4具有4个PPRE’sPPRE1(SEQ.ID NO25)、PPRE2(SEQ.IDNO29)、PPRE3(SEQ.ID NO33)和PPRE4(SEQ.ID NO37)。小鼠ANGPTL4具有4个PPRE’sPPRE1(SEQ.ID NO22)、PPRE2(SEQ.IDNO26)、PPRE3(SEQ.ID NO30)和PPRE4(SEQ.ID NO34)。大鼠ANGPTL4具有4个PPRE’sPPRE1(SEQ.ID NO23)、PPRE2(SEQ.IDNO27)、PPRE3(SEQ.ID NO31)和PPRE4(SEQ.ID NO35)。狗ANGPTL4具有4个PPRE’sPPRE1(SEQ.ID NO24)、PPRE2(SEQ.IDNO28)、PPRE3(SEQ.ID NO32)和PPRE4(SEQ.ID NO36)。通过本领域熟知的方法，例如Margulies E.H.和Blanchette M.(NISC ComparativeSequencing Program，Haussler，D.和Green，E.D.，Identification andCharacterization of Multi-Species Conserved Sequences.Genome Res(2003)，132507-2518)所述的方法，可以分别鉴别出其它种的调控区和PPRE’s。
本发明还提供了控制序列，其包含由SEQ.ID NO22、26、30、34(小鼠)，或SEQ.ID NO23、27、31、35(大鼠)，或SEQ.ID NO24、28、32、36(狗)，或SEQ.ID NO25、29、33、37(人)组成的组的一个或多个序列或其片段。而且，本发明还提供了包含SEQ.ID NO38或其片段的核酸。优选地，PPRE的片段包含13核心DR1区(13个核苷酸，其包括2个直接重复(DR)的相似六核苷酸片段和一个间插核苷酸)。本发明还涉及序列SEQ.ID NO22-38作为调节序列的应用。
而且，本发明提供了包含至少1个PPRE的载体和包含所述载体的宿主细胞。优选地，该载体包含SEQ.ID NO16或17的核酸。
可以基因工程地(即，转导、转化或转染)改造宿主细胞，使其整合有本发明的多核苷酸的表达系统或其部分。通过许多标准实验室手册所述的方法，例如Davis等，Basic methods in molecular biology Elsevier，NewYork(1986)；Davis JM(编辑)Basic cell culturea practical approach，第2版.Oxford University Press(2002)；R.Ian FreshneyCulture of Animal CellsA Manual of Basic Technique，第4版.John Wiley & Sons(Sd)1999；和Sambrook等，Molecular cloninga laboratory manual，第2版，Cold SpringHarbour Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y(1989)所述的方法，例如磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、transvectin、显微注射、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导或感染，可以将载体导入到宿主细胞中。
宿主细胞可以是哺乳动物细胞，例如BHK21、HEK 293、CHO、COS、HeLa、神经元的、神经内分泌的、成神经细胞瘤的或神经胶质的细胞系，如SH-SY5Y、PC12、HN-10；细菌细胞例如链球菌属、葡萄球菌属、大肠杆菌、链霉菌属和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)细胞；真菌细胞例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和曲霉菌(Aspergillus)细胞；昆虫细胞例如果蝇(Drosophila)S2和夜蛾(Spodoptera)Sf9细胞和植物细胞。
可以使用非常多样的表达系统。这样的系统包括，尤其是，染色体的、游离型的和源自病毒的系统，即源自细菌质粒、噬菌体、转座子、酵母游离基因、酵母染色体元件、病毒(例如杆状病毒，乳多空病毒，例如SV40，痘苗病毒，腺病毒，禽痘病毒，假狂犬病病毒，反转录病毒)的载体，和源自它们的组合的载体，例如源自质粒和噬菌体遗传元件(例如粘粒和噬菌粒)的那些。表达系统可以含有调控区，它们调节并引起表达。通常，可以使用适合于在宿主中维持、增殖或表达多核苷酸以生成多肽的任何系统或载体。通过任意的多种熟知的和常规的技术，例如Sambrook等，MoleculLar cloninga laboratory manual，第2版，Cold Spring HarbourLaboratory Press，Cold Spring Harbour，N.Y.(1989)或Borowski等，Traceaminesidentification of a family of mammalian G protein-coupled receptors.Proc Natl Acad Sci USA(2001)98(16)8966-71中所述的那些，可以将合适的核苷酸序列插入到表达系统中。
本发明还提供了一种筛选PPAR活性调控剂的方法，其包括下述步骤a)提供宿主，其含有一个或多个可操作地连接到可检测核酸的PPRE’s，b)将所述的宿主与候选物接触，和c)定量所述的可检测核酸的mRNA或蛋白的表达水平。
在前述方法的一个实施方案中，可检测核酸的mRNA或蛋白的表达水平是相对于对照测定的。
宿主可以是能进行RNA或蛋白转录(包括体外转录和体外翻译)的非人类的动物、组织、细胞或任何其它生物系统。对照是在未治疗的宿主中的可检测核酸的mRNA或蛋白的表达水平，该宿主可以是治疗前的所述宿主或不同宿主，和/或为了正常化到治疗前水平而进行合适时间治疗后的所述宿主。在前述方法的一个优选实施方案中，调控PPARδ活性的化合物是拮抗剂或激动剂。
可以使用数种方法来检测mRNA或蛋白的表达水平。用于检测mRNA的表达水平的方法包括但不限于这样的方法，包括使用基因芯片、微阵列分析、点印迹或不同的定量PCR方法学。优选地，使用Taqman或实时定量PCR。用于检测蛋白的表达水平的方法包括但不限于双向凝胶分离、质谱分析法、抗体结合技术(ELISA、蛋白印迹)和免疫沉淀。
现在，已经总体上说明了本发明，通过参考具体实施例和下面的附图可以更好地理解本发明，除非另有说明，这些实施例在这里只是用于解释、而不是限制目的。
图1通过Affymetrix微阵列测得的C2C12小鼠肌细胞中的表1 PPAR配体(A 300μM、B 100nM、C 500nM)诱导的ANGPTL4基因表达的成倍变化的图示。ANGPTL4促血管生成素样蛋白(PPARδ活性的标记)，A2-[4-(4-氯苯甲酰基)-苯氧基]-2-甲基丙酸(非诺贝酸(fenofibricacid))[PPARα激动剂]，B{2-甲基-4-[4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑--5-基甲基硫烷基]-苯氧基}-醋酸[PPARδ-α共激动剂]，C[rac]-(4-{环戊基-[4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑-5-基]-甲基硫烷基}-萘-1-基氧基)-醋酸[PPARδ激动剂]。
图2通过qPCR测得的C2C12小鼠肌细胞中的表3 PPAR配体(A300μM、B 100nM、C 500nM、D 500nM)诱导的ANGPTL4基因表达的成倍变化的图示。ANGPTL4促血管生成素样蛋白4(PPARδ活性的标记)，A2-[4-(4-氯苯甲酰基)-苯氧基]-2-甲基丙酸(非诺贝酸)[PPARα激动剂]，B{2-甲基-4-[4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑-5-基甲基硫烷基]-苯氧基}-醋酸[PPARδ-α共激动剂]，C[rac]-(4-{环戊基-[4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑-5-基]-甲基硫烷基}-萘-1-基氧基)-醋酸[PPARδ激动剂]，D(2-甲基-4-{甲基[4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑-5-基甲基]-氨基}-苯氧基)-醋酸[PPARδ-α共激动剂]。
图3A该点图说明了人和小鼠ANGPTL4基因的基因座的核苷酸序列之间的核酸保守性。E1～7代表ANGTPL4基因外显子1至7。内含子3用实线标示，保守的ANGTPL4调控区用双向箭头标示。
图3B来自人(h)、小鼠(m)、大鼠(r)和狗(d)的ANGPTL4基因的4种过氧化物酶体增殖剂效应元件(PPRE)的排列，显示了核心DR1元件(脂肪)和与共有DR1元件相比保守的侧翼序列。通过与精确定位的保守调节区的种间对比鉴别出，PPAR效应元件位于ANGPTL4基因的内含子3中。所有元件都几乎等距离地分布在约500个核苷酸区域，该区域在所有的种间是高度保守的。指定的坐标是指下述的基因组草图和染色体登记号人NCBI基因组库35.1；2004年6月18日/Genbank Seq IDNT_077812；小鼠NCBI基因组库33.1；2004年6月18日/GenbankSeq IDNT_039649；大鼠NCBI；基因组库2.1；2004年7月22日/Genbank Seq IDNW_04773；狗NCBI基因组库1.1；2004年8月30日/Genbank Seq IDNW_139889。
图4将小鼠和人(SEQ IDs16、17)的ANGTPL4调控区在载体中可操作地连接到编码荧光虫荧光素酶报道基因(荧光素酶/luc)的核酸序列上。将得到的报道基因载体与PPARδ表达质粒一起转染进宿主细胞中。用100nM PPARδ激动剂{2-甲基-4-[4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑5-基甲基硫烷基]-苯氧基}-醋酸处理转染后的宿主，检测荧光素酶活性。A在用PPARδ表达载体和人或小鼠ANGPTL4调控区荧光素酶报道基因载体转染的细胞中，成倍诱导荧光素酶的表达。与单独表达报道基因的细胞相比，荧光素酶的表达是成倍数激活的。这些数据表明，小鼠和人的ANGPTL4调控区都受PPARδ的调控。B一项类似的实验，其中小鼠报道基因构建体中的PPRE被通过定位诱变特异性地删除。在共转染了PPARδ和荧光素酶报道基因的细胞中，荧光素酶的表达被激动剂成倍数地激活。PPRE的删除导致PPARδ介导的转录激活的丧失。
图5ANGTPL4调控区还介导PPARγ和PPARα调节。将小鼠和人ANGTPL4调控区荧光素酶报道基因载体与PPARα或PPARγ表达载体一起转染进宿主细胞中。用200μM PPARα激动剂2-[4-(4-氯苯甲酰基)-苯氧基]-2-甲基丙酸[非诺贝酸]或100nM PPARγ配体5-[[4-[2(甲基-2-吡啶基氨基)乙氧基]苯基]-甲基]-2，4-噻唑烷二酮[罗格列酮]处理转染的细胞。与单独表达报道基因的细胞相比，荧光素酶的表达是成倍数激活的。
具体实施例方式
除非另有说明，根据生产商的说明书使用在实施例中提及的商业购得的试剂。
实施例1微阵列实验细胞培养C2C12细胞(ATCCCRL1772)
在补充有10％热灭活的胎牛血清(FCS)的DMEM(5mM葡萄糖)中培养细胞。使用前，通过0.2um孔过滤完全培养基。当细胞达到汇合时，在6孔平板上用减少血清的培养基(DMEM高葡萄糖，2％FCS)，进行分化。然后在37℃将细胞培养物在90％湿度、95％-空气-5％-CO2的无菌环境中孵育，使其分化。
将PPAR配体溶解到100％DMSO中，并加入到培养基中调节0.1％(v/v)DMSO终浓度，将细胞与配体一起在正常生长条件下孵育20小时。对于每种情况一式三份。
RNA的提取用Qiagen QIAschredder和RNeasy试剂盒进行RNA提取程序。
将每份样品约1×106个沉积下来的细胞重新悬浮到350μl含有RLT的硫氰酸胍中。将样品上QIAshredder-柱，全速离心2分钟，使溶解产物均质化。为了更好的结合条件向流通液(flow-through)中加入350μl乙醇后，将样品应用到RNeasy螺旋(spin)。在第一次洗涤步骤中，用移液管将350μlRW1缓冲液加入柱中。然后将与70μl RDD缓冲液温和混合的10μl DNase溶液应用到柱上，在室温孵育15分钟，以除去基因组DNA。用350μl RW1缓冲液洗出DNase。两步纯化洗涤步骤后，加入500μl RPE缓冲液。将RNA在水中洗脱，在-70℃储存。
cDNA的合成使用Roche Diagnostics提供的cDNA分析系统试剂盒并遵循生产商的手册合成cDNA。在整个合成过程中，都是在冰上操作。
为了合成第一链，将2μl寡d(T7)T24引物(5’GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGG-(T)24VN 3’，200pmol/μl)和加入再蒸馏水到最终反应体积21μl至多20μg RNA。在一个热循环仪中在70℃孵育10分钟、并使引物与RNA杂交后，加入2μl AMV逆转录酶和4μldNTP的混合物(10mM)。用移液管将补充的8μl RT-缓冲液、4μl DTT(0.1mM)和1ul RNase抑制剂加入混合物中。在42℃孵育60分钟。
将第二链合成试剂直接加入到第一链反应管中。第二链酶混合物(其中的6.5μl用于混合物)含有RNase，它用于在DNA/RNA杂合体的RNA中插入切口。这提供了DNA聚合酶I的3’OH-引物(它也存在于第二链酶混合物中，以及大肠杆菌连接酶中)。加入另外的1.5μl dNTP-混合物、30μl第二链缓冲液和72μl再蒸馏水，并温和地混合。将反应混合物在16℃孵育2小时。20μl加入的T4聚合酶确保在16℃孵育5分钟后cDNA的末端是平的。然后用RNase处理样品，除去RNA模板(37℃，30分钟)和用蛋白酶K处理样品(37℃，30分钟)。
cDNA的纯化使用Quiagen提供的QIAquick PCR纯化试剂盒进行纯化。
将850μl PB缓冲液加入到cDNA反应管中，并混合。将样品应用到QIAquick柱，在13000rpm离心30秒。向柱中加入750μl PE缓冲液，洗涤cDNA。经过在最大速度的另外离心步骤后，彻底干燥柱。为了洗脱DNA，将50-80μl EB缓冲液(10mM Tris-Cl，pH8.5)加入到膜中心，将样品在13000rpm离心1分钟。
通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色检查cDNA质量。
出现了从100至＞10000碱基对的成片条带。用分光光度计在260nm和280nm检测吸光度，确定合成的cDNA的量和纯度。
如下计算浓度c[μg/ml]＝A260×50×D，(50dsDNA特异性因子，D稀释因子)。cDNA的A260/A280-比为1.8-2.1。
体外转录(IVT)使用Ambion的MEGAscript T7试剂盒进行该步骤。
用来自每个样品的5ug cDNA作为模板，与ATP、GTP、CTP、UTP(Ambion)和生物素化的CTP(Bio-11-CTP，ENZO)和UTP(Bio-15-UTP，ENZO)混合。用T7酶混合物在37℃进行逆转录4小时。用Qiagen的RNeasy试剂盒纯化转录产物，将相同的程序用于RNA提取，不用任何DNase处理样品。
IVT产物的断裂在95℃，将15μg来自IVT的RNA在小体积(20～30μl)的200mM Tris-醋酸盐(pH8.1)、500mM KOAc、150mM MgOAc中破碎35分钟。
芯片处理(参见DNA Micro-array Protocols V3-200.1.M Wilhelm-Seiler，U Certa)首先将预处理溶液应用到基因芯片(6.25μl乙酰化的BSA(20μg/μl)、12.5μl鲑鱼精子DNA(10μg/μl)、125μl 2×MES Hyb缓冲液、106.25μl H2O)上。在转速为60rpm的旋转器中，将基因芯片在40℃孵育15分钟。
如下制备用于杂交的样品将15μg破碎的RNA与2.5μl对照原液混合物混合，所述的原液混合物含有BioB、BioC、BioD、Cre(内部参考(internal references))、2.5μl鲑鱼精子DNA(10μg/μl)、6.25μl乙酰化的BSA(20μg/μl)、125μl 2×MES-Hyb缓冲液、91.25μl H2O。在旋转器(转速为60rpm)中，将微阵列在45℃孵育过夜。
取出样品并保存在-20℃。在射流技术中用6 SSPE洗涤微阵列5分钟。然后将230μl MES-洗涤缓冲液应用到芯片，将其在45℃、60rpm孵育30分钟。
染色是通过将芯片与下述溶液孵育15分钟完成的125μl 2×染色缓冲液、91.25μl乙酰化的BSA、2.5μl抗生物素蛋白链菌素(1mg/ml)。
除去染色溶液，在射流站中用6×SSPE洗涤微阵列5分钟，用下述加强溶液(amplification solution)处理125μl 2×染色缓冲液、99μl H2O、1μl生物素化的-抗-链霉抗生物素(500μg/ml)、25μl乙酰化的BSA(20μg/μl)。在旋转器中，在40℃、60rpm孵育30分钟。用6×SSPE洗涤I射流站以后，在40℃、60rpm用藻红蛋白溶液(125μl 2×染色缓冲液、91.25μl H2O、31.25μl乙酰化的BSA、2.5μl藻红蛋白(1mg/ml))孵育微阵列。
溶液12×MES原液70.4g MES游离酸一水合物，193.3g MES钠盐，调节pH至6.6，用三蒸水(tridest H2O)补齐至1000ml；2×MES-Hyb缓冲液8.3ml 12×MES原液，17.7ml 5M NaCl，4ml0.5M EDTA，0.1ml 10％Tween 20，19.9ml三蒸水MES-Wash缓冲液83.3ml 12×MES原液，5.2ml 5M NaCl，1ml 10％ Tween 20，用三蒸水补齐至1000ml；6×SSPE Tween300ml 20×SSPE，1ml 10％ Tween 20，用三蒸水补齐至1000ml；2×染色缓冲液41.7ml 12×MES原液，92.5ml 5M NaCl，2.5ml 10％ Tween 20，113.3ml三蒸水；用Affymetrix扫描仪进行扫描，将得到的结果提供给来自Affymetrix的基因芯片软件。
芯片数据分析使用Race A软件(Bioinformatic Roche)分析数据。对于每种条件进行一式三份，参考对照(未处理的细胞样品)对每种条件进行对比。对于每种基因的分析，已经考虑了下述几项标准在每种条件下的p值，平均调入(call average)、总平均差异、偏差系数(change factor)和方差(dispersion)，以得到一列统计学上最相关的受研究化合物调控的基因。
结果从Affymetrix微阵列实验鉴别出了新的选择性的PPARδ生物标记基因(见图1)ANGPTL4(促血管生成素样蛋白4)(SEQ.ID NO2)。该标记基因能将PPARα与PPARδ活性区别开。
测试配体是PPARα激动剂(A2-[4-(4-氯苯甲酰基)-苯氧基]-2-甲基丙酸(非诺贝酸))、PPARδ激动剂(C[rac]-(4-{环戊基-[4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑-5-基]-甲基硫烷基}-萘-1-基氧基)-醋酸)和PPARδ-α共激动剂(B{2-甲基-4-[4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑-5-基甲基硫烷基]-苯氧基}-醋酸)。
如表1和图1所示，PPARδ激动剂(C)和PPARδ-α共激动剂(B)引起的标记基因ANGPTL4的应答远远大于PPARα特异性的配体(A)引起的应答。
表1通过Affymetrix微阵列测得，PPAR配体(A 300μM、B 100nM、C 500nM)诱导的C2C12小鼠肌细胞中的ANGPTL4基因的表达成倍改变。(A2-[4-(4-氯苯甲酰基)-苯氧基]-2-甲基丙酸(非诺贝酸)是PPARα激动剂，B{2-甲基-4-[4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑-5-基甲基硫烷基]-苯氧基}-醋酸是PPARδ-α共激动剂，C[rac]-(4-{环戊基-[4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑-5-基]-甲基硫烷基}-萘-1-基氧基)-醋酸是PPARδ激动剂]实施例2定量PCR如实施例1所述进行C2C12小鼠肌细胞的培养、RNA提取、cDNA分析和纯化。
PCR引物设计在来自Medline的mRNA/cDNA序列的基础上，用来自PE AppliedBiosystems的软件Primer express 1.0设计引物对。每一个引物的标准是长度为19至21个核苷酸，熔点温度为60℃±1，G/C含量范围为40至60％，避免发夹二级结构或引物二聚体。另外，控制扩增子的长度，因为更短的扩增子比更长的扩增子的扩增效率更高，并且更能耐受反应条件(通常约100碱基对)。将引物溶解到DEPC处理过的水(Ambion)中至100μM浓缩液，储存在-20℃。
表2基因S12(内部参考)和ANGPTL4的正向和反向引物使用Corbett RG3000和ABI 7000进行qPCR根据生产商的手册，用来自Qiagen的Quantitech SYBR Green试剂盒进行RT-PCR。将每一种组分加入到96孔板中25μl主混合物，0.16μl每种引物(100μM原液)、22.7μl H2O和2μl cDNA。
荧光染料SYBR绿I能结合双链DNA的小槽，可以在每个循环测定DNA的量。该程序由三个不同的步骤组成模板的起始变性和Taq DNA聚合酶的热激活(95℃、15分钟)，循环(95℃变性，60℃引物-模板退火，72℃延长，荧光获得)和最终解链(解链曲线55至95℃，在0.5℃梯级中测量)。解链曲线能鉴别出特异性的和非特异性的扩增产物(引物二聚体)。
使用实时PCR进行相对定量相对定量是基于靶基因相对于参考基因的相对表达。“阈荧光”概念定义为荧光超过背景荧光的点，利用它能精确地和可重复地定量基因的表达。达到阈荧光时的循环数目称作ct值。在扩增反应的指数期，ct值和起始分子数目的对数成线性关系。因此，在该阶段定量是可靠的，并且不会受到组分的任何限制作用的影响。在对照组或未处理的样品中，靶基因的ct值与内部参考的ct值相比较的相对值表示为Δct.对照＝ct对照参考-ct对照靶目标，在处理过的未知样品中为Δct.样品＝ct样品参考-ct样品靶目标。
理论上的PCR反应表示为式N＝N0×2n(N扩增的分子的数目，N0起始的分子数目，n扩增循环的数目)，其中底数2代表最佳效率(每个循环倍增一次)。该方程能解释mRNA拷贝数目(而不是ct值)的不同表达用理论效率的指数值，2Δct。
使用定量研究核糖体蛋白S12基因达的内部参考。它是组成型表达的、且在所有样品中处于相同的水平。通过light cycler软件确定荧光阈的设置。将得到的ct值(每个样品一式两份，每个条件两个样品)导入到Microsoft Excel中，如上分析。
结果通过qPCR(定量的聚合酶链式反应)确认从Affymetrix微阵列实验(见图1)鉴别出的新的选择性PPARδ生物标记基因(SEQ.ID.NO2)。
测试的配体是PPARα激动剂(A2-[4-(4-氯苯甲酰基)-苯氧基]-2-甲基丙酸(非诺贝酸))、PPARδ激动剂(C[rac]-(4-{环戊基-{4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑-5-基}-甲基硫烷基}-萘-1-基氧基)-醋酸)和两个PPARδ-α共激动剂(B{2-甲基-4-[4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑-5-基甲基硫烷基]-苯氧基}-醋酸和D(2-甲基-4-{甲基-[4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑-5-基甲基]-氨基}-苯氧基)-醋酸)。
如表3和图2所示，PPARδ激动剂(C)和PPARδ-α共激动剂(B和D)引起的标记基因ANGPTL4的应答远远大于PPARα特异性的配体(A)引起的应答。
表3如qPCR所测得的，在C2C12中PPAR配体(A 300μM、B 100nM、C 500nM、D 500nM)诱导的在C2C12小鼠肌细胞中的ANGPTL4基因表达成倍数改变。(A2-[4-(4-氯苯甲酰基)-苯氧基]-2-甲基丙酸(非诺贝酸)是PPARα激动剂、B{2-甲基-4-[4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑-5-基甲基硫烷基]-苯氧基}-醋酸是PPARδ-α共激动剂，C[racl-(4-{环戊基-[4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑-5-基]-甲基硫烷基}-萘-1-基氧基)-醋酸是PPARδ激动剂、D(2-甲基-4-{甲基-[4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑-5-基甲基]-氨基}-苯氧基)-醋酸是PPARδ-α共激动剂)。
特异性的PPARδ配体(例如GW501516)能在体内和体外引起许多与已知的PPARα配体(贝特)的影响类似的生物学应答。如通过寡核苷酸阵列和定量PCR所证实的，一个主要的生物学差异是不同地调节ANGPTL4的表达。ANGPTL4(一种新发现的循环细胞因子)受肝脏、脂肪细胞和肌肉中的禁食所调节；近来已经证实是直接的PPAR靶基因且与脂解相关。因此，ANGPTL可以为下述目的提供新方案(1)选择性地将PPARδ的作用与PPARα区别开，和(2)开发更细化的用于血脂异常和II型糖尿病的药物。
实施例3对比的基因组分析对比了人(NCBI基因组库35.1；2004年6月18日)、大鼠(NCBI；基因组库2.1；2004年7月22日)、小鼠(NCBI基因组库33.1；2004年6月18日)和狗(NCBI基因组库1.1；2004年8月30日)ANGPTL4基因。首先，进行BLAST对比，提供用于更敏感地深度分析直向同源基因组区域的方便的“锚点”。然后，使用基于同源性的基因预测进一步分析保守的基因组区域。对于ANGPTL4基因，对比人和小鼠的基因组区域后，发现了如点图(图3A)所示的在基因内含子中的不同的保守序列。最保守的序列位于内含子3中。通过BLAST检索能很容易地发现它，它甚至比ANGPTL4基因的编码蛋白的外显子更高度地保守。
为了进一步说明这些保守的内含序列的可能相关性，制作了已知转录因子结合位点(TFBS)的图谱。包括了所有来自TransFac8.1[BIOBASE(生物数据库)，Halchtersche Strafβe 33，D-38304 Wolfenbüttel，Germany]的TFBS，可以获得关于它的基于基质的说明。当使用的制作图谱的算法校准TFBS匹配的统计学显著性时，对于100碱基对的任意基因组序列，仍然得到了约5个TFBS预测。但是，在假设调节机制和共有序列TFBS在更高等的脊椎动物中趋向于保守的基础上，人们可以将TFBS预测与对应的直向同源基因组区域的排列、和从这些排列衍生出的保守图谱(profile)相组合。这可以排除那些看起来不能充分好地保守的TFBS预测。
结果在ANGPTL4基因的内含子3的保守序列中，鉴定了对TransFac8.1中TFBS的约50个配对，包括几个对过氧化物酶体增殖剂激活受体效应元件基序(PPRE’s/DR1)的配对。所有4个与PPRE有关的配对与保守图中的4个最高峰相一致。没有其它预测的TFBS与任何保守峰重叠。而且，不存在于最保守区域之外的预测的其它PPRE。在核苷酸水平，所有推定的PPRE在4个物种中都是较好的保守的，并且很好地对共有序列PPRE/DR1元件配对(图3B)。这样，计算的分析就鉴别出了ANGPTL4的内含子3中的4个分离的PPRE，其中3个位于正向(编码)链，1个位于反向链。
实施例4小鼠和人ANGPTL4调控区的PCR扩增设计PCR引物对用于扩增包含4个推定PPRE的来自小鼠和人基因组DNA的ANGPTL4基因内含子3的片段。使用与实施例2所述类似的参数，用来自PE Applied Biosystems(总部850 Lincoln Centre Drive，FosterCity，CA 94404，USA)的软件Primer Express 2.0设计引物。用来自Stratagene的pfuPCR混合物进行PCR扩增。每个反应使用50ng模板DNA、10pmol每一种正向和反向引物，推荐量的dNTP、10×缓冲液和PCR酶，最终反应体积为50μl。
表4用于PCR克隆ANGPTL4调控区的正向和反向引物序列用来自Biometra(Whatman Biometra，Biometra GmbH i.L.，Rudolf-Wissell-Straβe 30，37079 Goettingen，Germany)的T3热循环仪进行PCR扩增。扩增程序由下述步骤组成模板的起始变性(95℃、2分钟)，在95℃、60秒变性；50-65℃梯度，30秒退火；72℃、4分钟延伸，重复35次。PCR后，通过琼脂糖凝胶电泳分离等分试样，通过溴化乙锭染色使扩增带的定量和大小可视化。
构建ANGPTL4调控区-荧光素酶报道基因载体将PCR产物亚克隆到TA载体中，并测定其DNA序列。通过限制性酶切含有插入物的TA质粒，回收插入预期序列的PCR产物，并亚克隆进含有最小-37TK启动子的荧光素酶报道基因载体(pGL3basic-pTK-37 Lucinsertion of minimal promoter region from the herpes simplex thymidinekinase gene(pTK37)(SEQ.ID NO39)between BglII and EcoRI restrictionsites of the pGL3-Basic vector(Promega，Aceession numberU47295))。这产生两个质粒，mANGPTL4调控区-Luc和hANGPTL4调控区-Luc，其中荧光素酶的表达分别受小鼠和人ANGPTL4调控区的指导。在大肠杆菌中大量制备这些质粒，用于后续研究。
诱变为了证实ANGPTL4调控区的PPARδ转录控制依赖于4种鉴别出的PPRE，通过对mANGPTL4调控区-Luc质粒进行定位诱变，使它们逐个地和组合地失去功能。设计引物删除每个PPRE的13核心DR1编码核苷酸。使用来自Stratagene的Quikchange多位点定向诱变试剂盒进行诱变。通过DNA测序，鉴别出合适的诱变过的被删除了一个或多个PPRE的载体。在大肠杆菌中大量制备这些质粒，用于后续研究。
表5用于mFIAF/ANGPTL4调控区中的PPRE诱变的引物序列荧光素酶实验在37℃、在95％O25％CO2气氛下，在含有10％FBS的DMEM培养基中培养小仓鼠肾细胞(BHK21 ATCC CCL 10)。将细胞以2×105细胞/孔的密度接种到6孔板中，然后用表达全长人PPARδ、PPARγ或PPARα受体的载体与合适的ANGPTL4调控区-Luc报道基因质粒一起分批转染。根据推荐方法，用Fugene 6试剂(Roche Molecular Biochemicals)完成转染。转染后6小时，通过胰蛋白酶处理收获细胞，以104细胞/孔的密度接种到96孔板中。让细胞粘附24小时后，除去培养基，替换以100μl不含酚红但含有测试底物或对照配体的DMEM培养基(最终DMSO浓度为0.2％)。将细胞与底物孵育24小时后，排出50μl上清液，然后加入50μlSteady-Glo荧光素酶分析试剂(Promega)来裂解细胞并启动荧光素酶反应。在Packard TopCount中测量荧光素酶的荧光。在有测试底物存在的情况下的转录激活表示为在没有测试底物存在的情况下孵育的细胞的倍数激活。
结果图4A表明，PPARδ通过FIAF/ANGPTL4调控区介导异源荧光素酶报道基因的转录控制。与只用报道基因转染的细胞相比，用PPARδ受体载体和荧光素酶报道基因一起转染的细胞未显示出增强的转录激活。但是，用PPARδ激动剂处理后，小鼠和人FIAF/ANGPTL4调控区-Luc报道基因的荧光素酶活性分别增加了39倍和25倍。在图4B中进行了类似的实验，但是在使用的mFIAF/ANGPTL4调控区-Luc报道基因中删除了一个或多个PPRE。单独删除PPRE 1、2和4降低PPARδ介导的转录。删除或超过一个PPRE导致进一步丧失转录激活，在删除全部4个PPRE所有调节丧失。这样，PPARδ通过包含在小鼠和人FIAF/ANGPTL4调控区中的4个PPRE有力地和特异性地调节转录。
由于已经显示PPARα和PPARγ激动剂能分别诱导肝脏和脂肪组织中的FIAF/ANGPTL4表达，还测试了它们对ANGPTL4调控区的调节。图5表明，PPARα和PPARγ能转录地调节小鼠和人ANGPTL4调控区。与PPARδ不同，用PPARα和PPARγ转染细胞导致增强的激活，甚至在没有激动剂的情况下也是如此，用选择性的激动剂处理会进一步增强。
序列表<110>霍夫曼-拉罗奇有限公司<120>作为用于PPARδ调控的标记物的ANGPTL4/FIAF<130>22517<160>39<170>
<210>1<211>1883<212>DNA<213>小鼠<220>
<221>血管生成素样蛋白4(ANGPTL4)<222>(1)..(1870)<223>对于UniGene ID Mm.196189基因而言的代表cDNA(互补cds)(BC021343，25.03.2004)<400>1ccacgcgtcc ggctacgggc tccagatctt cttctgcacc agagcaagtc taagtctgag 60ccggctcccc cagaactcca gctgctgggt cttgaactcc tgcgttccgg agtcctagcg120ttgctgcacc caaggccacc cccagaatca tgcgctgcgc tccgacagca ggcgctgccc180tggtgctatg cgcggctact gcggggcttt tgagcgcgca agggcgccct gcacagccag240agccaccgcg ctttgcatcc tgggacgaga tgaacttgct ggctcacggg ctgctacagc300tcggccatgg gctgcgcgaa cacgtggagc gcacccgtgg gcagctgggc gcgctggagc360gccgcatggc tgcctgtggt aacgcttgtc aggggcccaa gggaaaagat gcacccttca420aagactccga ggatagagtc cctgaaggcc agactcctga gactctgcag agtttgcaga480ctcagctcaa ggctcaaaac agcaagatcc agcaattgtt ccagaaggtg gcccagcagc540agagatacct atcaaagcag aatctgagaa tacagaatct tcagagccag atagacctct600tggcccccac gcacctagac aatggagtag acaagacttc gaggggaaag aggcttccca660agatgaccca gctcattggc ttgactccca acgccaccca cttacacagg ccgccccggg720actgccagga actcttccaa gaaggggaga ggcacagtgg acttttccag atccagcctc780tggggtctcc accatttttg gtcaactgtg agatgacttc agatggaggc tggacagtga840ttcagagacg cctgaacggc tctgtggact tcaaccagtc ctgggaagcc tacaaggatg900gcttcggaga tccccaaggc gagttctggc tgggcctgga aaagatgcac agcatcacag960ggaaccgagg aagccaattg gctgtgcagc tccaggactg ggatggcaat gccaaattgc 1020tccaatttcc catccatttg gggggtgagg acacagccta cagcctgcag ctcactgagc 1080ccacggccaa tgagctgggt gccaccaatg tttcccccaa tggcctttcc ctgcccttct 1140
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<221>血管生成素样蛋白4(ANGPTL4)<222>(1)..(1858)<223>对于UniGene ID Mm.196189基因而言的代表cDNA(NM_020581，25.03.2004)<400>2gcaccagagc aagtctaagt ctgagccggc tcccccagaa ctccagctgc tgggtcttga 60actcctgcgt tccggagtcc tagcgttgct gcacccaagg ccacccccag aatcatgcgc120tgcgctccga cagcaggcgc tgccctggtg ctatgcgcgg ctactgcggg gcttttgagc180gctcaagggc gccctgcaca gccagagcca ccgcgctttg catcctggga cgagatgaac240ttgctggctc acgggctgct acagctcggc catgggctgc gcgaacacgt ggagcgcacc300cgtgggcagc tgggcgcgct ggagcgccgc atggctgcct gtggtaacgc ttgtcagggg360cccaagggaa aagatgcacc cttcaaagac tccgaggata gagtccctga aggccagact420cctgagactc tgcagagttt gcagactcag ctcaaggctc aaaacagcaa gatccagcaa480ttgttccaga aggtggccca gcagcagaga tacctatcaa agcagaatct gagaatacag540aatcttcaga gccagataga cctcttggcc cccacgcacc tggacaatgg agtagacaag600acttcgaggg gaaagaagct ttccaagatg acccagctca ttggcttgac ttccaacgcc660acccacttac acaggccggc ccgggactgc caggaactct tccaagaagg ggagaggcac720
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<221>血管生成素样蛋白4(ANGPTL4)<222>(1)..(410)<223>对于UniGene ID Mm.196189基因而言的蛋白序列(NP_065606，25.03.2004)<400>3Met Arg Cys Ala Pro Thr Ala Gly Ala Ala Leu Val Leu Cys Ala Ala1 5 10 15Thr Ala Gly Leu Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Ala Gln Pro Glu Pro20 25 30Pro Arg Phe Ala Ser Trp Asp Glu Met Asn Leu Leu Ala His Gly Leu
35 40 45Leu Gln Leu Gly His Gly Leu Arg Glu His Val Glu Arg Thr Arg Gly50 55 60Gln Leu Gly Ala Leu Glu Arg Arg Met Ala Ala Cys Gly Asn Ala Cys65 70 75 80Gln Gly Pro Lys Gly Lys Asp Ala Pro Phe Lys Asp Ser Glu Asp Arg85 90 95Val Pro Glu Gly Gln Thr Pro Glu Thr Leu Gln Ser Leu Gln Thr Gln100 105 110Leu Lys Ala Gln Asn Ser Lys Ile Gln Gln Leu Phe Gln Lys Val Ala115 120 125Gln Gln Gln Arg Tyr Leu Ser Lys Gln Asn Leu Arg Ile Gln Asn Leu130 135 140Gln Ser Gln Ile Asp Leu Leu Ala Pro Thr His Leu Asp Asn Gly Val145 150 155 160Asp Lys Thr Ser Arg Gly Lys Lys Leu Ser Lys Met Thr Gln Leu Ile165 170 175Gly Leu Thr Ser Asn Ala Thr His Leu His Arg Pro Ala Arg Asp Cys180 185 190Gln Glu Leu Phe Gln Glu Gly Glu Arg His Ser Gly Leu Phe Gln Ile195 200 205Gln Pro Leu Gly Ser Pro Pro Phe Leu Val Asn Cys Glu Met Thr Ser210 215 220Asp Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln Arg Arg Leu Asn Gly Ser Val Asp225 230 235 240Phe Asn Gln Ser Trp Glu Ala Tyr Lys Asp Gly Phe Gly Asp Pro Gln245 250 255Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Met His Ser Ile Thr Gly Asp260 265 270Arg Gly Ser Gln Leu Ala Val Gln Leu Gln Asp Trp Asp Gly Asn Ala275 280 285Lys Leu Leu Gln Phe Pro Ile His Leu Gly Gly Glu Asp Thr Ala Tyr
290 295 300Ser Leu Gln Leu Thr Glu Pro Thr Ala Asn Glu Leu Gly Ala Thr Asn305 310 315 320Val Ser Pro Asn Gly Leu Ser Leu Pro Phe Ser Thr Trp Asp Gln Asp325 330 335His Asp Leu Arg Gly Asp Leu Asn Cys Ala Lys Ser Leu Ser Gly Gly340 345 350Trp Trp Phe Gly Thr Cys Ser His Ser Asn Leu Asn Gly Gln Tyr Phe355 360 365His Ser Ile Pro Arg Gln Arg Gln Glu Arg Lys Lys Gly Ile Phe Trp370 375 380Lys Thr Trp Lys Gly Arg Tyr Tyr Pro Leu Gln Ala Thr Thr Leu Leu385 390 395 400Ile Gln Pro Met Glu Ala Thr Ala Ala Ser405 410<210>4<211>21<212>DNA<213>小鼠<220>
<221>ANGPTL4正向引物<222>(1)..(21)<400>4tgctccaatt tcccatccaa t<210>5<211>21<212>DNA<213>小鼠<220>
<221>ANGPTL4反向引物<222>(1)..(21)<400>5cagtgagctg caggctgtag g<210>6<211>21<212>DNA<213>小鼠
<220>
<221>S12正向引物<222>(1)..(21)<400>6tgaaccagat gcaccgctta g<210>7<211>20<212>DNA<213>小鼠<220>
<221>S12反向引物<222>(1)..(20)<400>7ttcttctttt gcacgtggcc<210>8<211>624<212>DNA<213>人<220>
<221>含4个PPRE的人ANGPTL4内含子3<222>(1)..(624)<223>人染色体19的片段(GenBankNT_077812)，从8337915-8338538<400>8cacggtttct ctgtggtcct catccttccc tgcatctgtg gctgtccaca gccaactggg 60tgaaagtttg gatccccctc tcacacccta gggtcagtgg caggcttcca gcactgtaga120cctgagggtt ctctcctccc caagctcccg ctccttccca cctccgtgct gcccgccccc180aaccccgcca ggctagcatc tcagcgtggt cagggtcctg tccaccctcc caaagccacc240atcccaggat gaggggcttc tggagggtga cgggggaagg cacaagtcct ggctgggaaa300tgcggtggaa gggggcaggg gttctgtggg ttcgggactc ccagactctt ggctcaggcc360cgccaagtag gagaaagttc agagctggga aggcgaacag ctggcattca tggaagccac420actggtggtt tggccgcgtg cccatcctta ctggatggga ggaaagtagg ggaaagggga480gatgcctgag gggccggaaa gcgtcttcct ggtcactctg ggcccgcccc cacccccacc540gtgcagactc atttcgacct ttcccctact tttccggctg ggctgggggc ggttcctccc600agtctggagc gtctgagcct ccag 624<210>9<211>594<212>DNA<213>小鼠
<220>
<221>含4个PPRE的人ANGPTL4内含子3<222>(1)..(594)<223>染色体17的片段(GenBankNT_039649，11.01.2005)，从32271133-32271726<400>9gccttgacaa gtcctctaaa ttcaggaaga accaccccca gcccagccag ggaaagtagg 60agaaaggtca ctgggggagg ggcatgcagg cactttctgc cagccagctc cgtctgcact120gccaggagtg ggggcagacc cagaaagatg ggaagtatac tttccaatcc ctcgggcagc180tagctccctt tcccctactt tcctctcatc caatcgggac aggcacactg ccaaaccacc240catgtggttc ccattagggc cagctgtttg tctctccagc tctgaacttt cctctacttg300gctaggctga gtctgggagt tccaaagcca caaaaccacc ccctcagctc ttctcttcca360ccacatcacc catccagaac ctatgcctgc cgaccctgga aaagctcatc catgaccctc420gccatgccta ggtacttgcc taagtaaaag ccaggggagg aattaagtct aaggaggatt480gggctgaaag ccagcaagca gccttagggt gtgaagggga tatccaaact ttcacctagt540tggctgtgga gagccacaga tgtcaagaag ggtgaacgaa taggcatgaa ctca 594<210>10<211>585<212>DNA<213>犬科<220>
<221>包含4个PPRE的狗ANGPTL4内含子3<222>(1)..(585)<223>染色体20的片段(GenBankNW_139889，11.01.2005)，从55810817-55811401<400>10cggtcctcct accccatcac accccagcct ggcatcagtg gctgcgtgca accaactggg 60tgaaagttcg gattcccccc tttcacaccc tggggctggt tgctggctgt cagcccttta120gtcttgaggg ctcctcctcc cttcccctcc ctccaactcc ctcccctcct ccccattccc180aggccagtaa gggtccagta caccctccca aacctcctcc ctgggatcag accggcaggc240gcgggtctgg gtcggggatg tgggggtgcg gggggggtgc gtgggtttgg ggactcccag300acccggggct cagccctgcc aagtaggaga agggtcagag ctggagagac aaacagctgg360tgttaatgga agccacattg gtggtttggc ccggtgccgt ggggattgga agggaggaaa420gtaggggaaa ggggagctgc tccaggggcc ggaagaggtc tccagtcact ctgggtccgc480ccccctcccc ccagcgtgga cttcccctcc cccgggcgac ctttccaata ctttccccgg540ctgggctggc actggatgcg ggctttcatc agcagtttgg acgcg585<210>11
<211>591<212>DNA<213>Rattus norvegicus<220>
<221>包含4个PPRE的大鼠ANGPTL4内含子3<222>(1)..(591)<223>大鼠染色体7的片段(GenBankNW_047733，11.01.2005)，从16265610-16266200<400>11gccttgacaa gtcctctaaa ttcaggaaga accgccccca gcccagccag ggaaagtagg 60agaaaggtca ctgggggagg agcatgcagg gactttctgc cagccagctc agtccacact120gccaggagtg ggggcagacc cagaaagatg ggaagtctac tttccaatcc cttgggcagc180tccctttccc ctactttcct ctcatccaat cgggacaggc acactgccaa gccacccatg240tggttttcat tagggccagc tgtttgtctc cccagctctg aactttcctc tacttggcta300ggctgagtct gggagtccca aacccacaaa accaccccct cagctcttct cttccaccac360atcacctatc cagaagctat gcctgccaac cctgagaaag ctcatccgtg accctcgaca420tgcctaggta cttgcctagg ttaaagccag gggacggatt aagtctaaag acaattgggc480tgacagccag caaccagcct tagggtgtga agggggatat ccaacctttc acctagttgg540ctgtgggtag ccacagatgt caagcagggt gagagaatag gcatgaactc a 591<210>12<211>23<212>DNA<213>人<220>
<221>hANGPTL4clonF2<222>(1)..(23)<223>人ANGPTL4内含子3正向引物<400>12ctcgcggttc tctaagttca cgg 23<210>13<211>24<212>DNA<213>人<220>
<221>hANGPTL4clonR2<222>(1)..(23)<223>人ANGPTL4内含子3反向引物<400>13aggaggcagg gttgaggaaa gaaa 24<210>14
<211>24<212>DNA<213>小鼠<220>
<221>mANGPTL4clonF2<222>(1)..(24)<223>小鼠ANGPTL4内含子3正向引物<400>14cgttcaccct tcttgacatc tgtg 24<210>15<211>23<212>DNA<213>小鼠<220>
<221>mANGPTL4clonR2<222>(1)..(23)<223>小鼠ANGPTL4内含子3反向引物<400>15cttggccttg acaagtcctc taa 23<210>16<211>711<212>DNA<213>人<220>
<221>克隆的hANGPTL4控制区<222>(1)..(711)<400>16ctcgcggttc tctaagttca cggccccaca cggtttctct gtggtcctca tccttccctg 60catctgtggc tgtccacagc caactgggtg aaagtttgga tccccctctc acaccctagg120gtcagtggca ggcttccagc actgtagacc tgagggttct ctcctcccca agctcccgct180ccttcccacc tccgtgctgc ccgcccccaa ccccgccagg ctagcatctc agcgtggtca240gggtcctgtc caccctccca aagccaccat cccaggatga ggggcttctg gagggtgacg300ggggaaggca caagtcctgg ctgggaaatg cggtggaagg gggcagggtt ctgtgggttc360gggactccca gactcttggc tcaggcccgc caagtaggag aaagttcaga gctgggaagg420cgaacagctg gcattcatgg aagccacact ggtggtttgg ccgcgtgccc atccttactg480gatgggagga aagtagggga aaggggagat gcctgagggg ccggaaagcg tcttcctggt540cactctgggc ccgcccccac ccccaccgtg cagactcatt tcgacctttc ccctactttt600ccggctgggc tgggggcggt tcctcccagt ctggagcgtc tgagcctcca gacgtgctca660acgccatcct cccctcctcc ctccctcttt ctttcctcaa ccctgcctcc t 711
<210>17<211>582<212>DNA<213>小鼠<220>
<221>克隆的mANGPTL4控制区<222>(1)..(582)<400>17cgttcaccct tcttgacatc tgtggctctc cacagccaac taggtgaaag tttggatatc 60cccttcacac cctaaggctg cttgctggct ttcagcccaa tcctccttag acttaattcc120tcccctggct tttacttagg caagtaccta ggcatggcga gggtcatgga tgagcttttc180cagggtcggc aggcataggt tctggatggg tgatgtggtg gaagagaaga gctgaggggg240tggttttgtg gctttggaac tcccagactc agcctagcca agtagaggaa agttcagagc300tggagagaca aacagctggc cctaatggga accacatggg tggtttggca gtgtgcctgt360cccgattgga tgagaggaaa gtaggggaaa gggagctagc tgcccgaggg attggaaagt420atacttccca tctttctggg tctgccccca ctcctggcag tgcagacgga gctggctggc480agaaagtgcc tgcatgcccc tcccccagtg acctttctcc tactttccct ggctgggctg540ggggtggttc ttcctgaatt tagaggactt gtcaaggcca ag 582<210>18<211>28<212>DNA<213>小鼠<220>
<221>mANGPTL4 PPRE1诱变引物<222>(1)..(28)<223>用于删除小鼠ANGPTL4的PPRE1的13核心DR1-编码核苷酸的引物<400>18ctccacagcc aactgatatc cccttcac 28<210>19<211>28<212>DNA<213>小鼠<220>
<221>mANGPTL4 PPRE2诱变引物<222>(1)..(28)<223>用于删除小鼠ANGPTL4的PPRE2的13核心DR1-编码核苷酸的引物<400>19cagcctagcc aagtgagctg gagagaca 28
<210>20<211>28<212>DNA<213>小鼠<220>
<221>mANGPTL4 PPRE3诱变引物<222>(1)..(28)<223>用于删除小鼠ANGPTL4的PPRE3的13核心DR1-编码核苷酸的引物<400>20gatgagagga aagtctagct gcccgagg 28<210>21<211>28<212>DNA<213>小鼠<220>
<221>mANGPTL4 PPRE4诱变引物<222>(1)..(28)<223>用于删除小鼠ANGPTL4的PPRE4的13核心DR1-编码核苷酸的引物<400>21tgcccctccc ccagactttc cctggctg 28<210>22<211>22<212>DNA<213>小鼠<220>
<221>mANGPTL4-PPRE 1<222>(1)..(22)<400>22gccaactagg tgaaagtttg ga 22<210>23<211>22<212>DNA<213>Rattus norvegicus<220>
<221>rANGPTL4-PPRE 1<222>(1)..(22)<400>23gccaactagg tgaaaggttg ga 22<210>24<211>22<212>DNA
<213>犬科<220>
<221>dANGPTL4-PPRE 1<222>(1)..(22)<400>24accaactggg tgaaagttcg ga 22<210>25<211>22<212>DNA<213>人<220>
<221>hANGPTL4-PPRE 1<222>(1)..(22)<400>25gccaactggg tgaaagtttg ga 22<210>26<211>22<212>DNA<213>小鼠<220>
<221>mANGPTL4-PPRE 2<222>(1)..(22)<400>26gccaagtaga ggaaagttca ga 22<210>27<211>22<212>DNA<213>Rattus norvegicus<220>
<221>rANGPTL4-PPRE 2<222>(1)..(22)<400>27gccaagtaga ggaaagttca ga 22<210>28<211>22<212>DNA<213>犬科<220>
<221>dANGPTL4-PPRE 2<222>(1)..(22)<400>28
gccaagtagg agaagggtca ga 22<210>29<211>22<212>DNA<213>人<220>
<221>hANGPTL4-PPRE 2<222>(1)..(22)<400>29gccaagtagg agaaagttca ga 22<210>30<211>22<212>DNA<213>小鼠<220>
<221>mANGPTL4-PPRE 3<222>(1)..(22)<400>30ggaaagtagg ggaaagggag ct 22<210>31<211>22<212>DNA<213>Rattus norvegicus<220>
<221>rANGPTL4-PPRE 3<222>(1)..(22)<400>31ggaaagtagg ggaaagggag ct 22<210>32<211>22<212>DNA<213>犬科<220>
<221>dANGPTL4-PPRE 3<222>(1)..(22)<400>32ggaaagtagg ggaaagggga gc 22<210>33<211>22<212>DNA<213>人
<220>
<221>hANGPTL4-PPRE 3<222>(1)..(22)<400>33ggaaagtagg ggaaagggga ga 22<210>34<211>22<212>DNA<213>小鼠<220>
<221>mANGPTL4-PPRE 4<222>(1)..(22)<400>34ggaaagtagg agaaaggtca ct 22<210>35<211>22<212>DNA<213>Rattus norvegicus<220>
<221>rANGPTL4-PPRE 4<222>(1)..(22)<400>35ggaaagtagg agaaaggtca ct 22<210>36<211>22<212>DNA<213>犬科<220>
<221>dANGPTL4-PPRE 4<222>(1)..(22)<400>36ggaaagtatt ggaaaggtcg cc 22<210>37<211>22<212>DNA<213>人<220>
<221>hANGPTL4-PPRE 4<222>(1)..(22)<400>37gaaaagtagg ggaaaggtcg aa 22
<210>38<211>17<212>DNA<213>人工<220>
<223>人工序列的描述小鼠、大鼠、狗和人的PPRE序列的共有序列<220>
<221>共有序列PPRE<222>(1)..(17)<220>
<221>misc_feature<222>(8)..(8)<223>n是a，c，g，或t<400>38aactaggnca aaggtca 17<210>39<211>96<212>DNA<213>单纯疱疹病毒7<220>
<221>来自单纯疱疹胸苷激酶基因(pTK37)的最小启动子区域<222>(1)..(96)<400>39gaattcggtc cacttcgcat attaaggtga cgcgtgtggc ctcgaacacc gagcgaccct60gcagcgaccc gcttaacagc gtcaacagcg tgccgc 9权利要求
1.ANGPTL4，其作为用于检测PPARδ活性的生物标记。
2.ANGPTL4，其作为用于检测肌细胞或肝脏或脂肪细胞中的PPARδ活性的生物标记。
3.ANGPTL4，其作为用于诊断涉及PPARδ活性失调的疾病的标记。
4.一种检测或监测宿主中的PPARδ活性的方法，其包含定量ANGPTL4的mRNA表达水平。
5.根据权利要求4的方法，其包含相对于对照，检测ANGPTL4的mRNA表达水平的步骤。
6.一种检测测试化合物能否调控宿主中的PPARδ活性的方法，其包括a)将宿主暴露于测试化合物，和b)定量ANGPTL4的mRNA的表达水平。
7.根据权利要求6的方法，其包含相对于对照，检测ANGPTL4的mRNA表达水平。
8.一种监测患有与PPARδ活性失调相关疾病的患者的治疗的方法，其包括下述步骤a)纯化来自肌细胞的RNA，所述肌细胞分离自用PPARδ活性调控剂治疗的患者；和b)检测ANGPTL4的mRNA的表达。
9.根据权利要求8的方法，其包含相对于对照，检测ANGPTL4的mRNA表达水平。
10.通过权利要求4至9中的任一项所述的方法鉴别的化合物。
11.通过权利要求4至9中的任一项所述的方法鉴别的化合物在制备用于治疗涉及PPARδ活性失调的疾病的药物中的应用。
12.一种检测或监测宿主中的PPARδ活性的方法，其包括定量ANGPTL4的蛋白表达水平。
13.根据权利要求12的方法，其包含相对于对照，检测ANGPTL4的蛋白表达水平的步骤。
14.一种检测测试化合物能否调控宿主中的PPARδ活性的方法，其包括a)将宿主暴露于测试化合物，和b)定量ANGPTL4的蛋白表达水平。
15.根据权利要求14的方法，其包含相对于对照，检测ANGPTL4的蛋白表达水平。
16.一种监测患有与PPARδ活性失调相关疾病的患者的治疗的方法，其包括下述步骤a)纯化来自全血和/或肌细胞的蛋白，所述全血和/或肌细胞分离自用PPARδ活性调控剂治疗的患者；和b)检测ANGPTL4的蛋白表达。
17.根据权利要求16的方法，其包含相对于对照，检测ANGPTL4的蛋白表达水平。
18.通过权利要求12至17中的任一项所述的方法鉴别的化合物。
19.通过权利要求12至17中的任一项所述的方法鉴别的化合物在制备用于治疗涉及PPARδ活性失调的疾病的药物中的应用。
20.作为生物标记的ANGPTL4在检测PPARδ活性中的应用。
21.作为生物标记的ANGPTL4在检测肌肉的PPARδ活性中的应用。
22.作为标记的ANGPTL4在诊断涉及PPARδ活性失调的疾病中的应用。
23.调节序列，其包含由SEQ.ID NO22，26，30，34组成的组的一种或多种序列或其片段。
24.调节序列，其包含由SEQ.ID NO23，27，31，35组成的组的一种或多种序列或其片段。
25.调节序列，其包含由SEQ.ID NO24，28，32，36组成的组的一种或多种序列或其片段。
26.调节序列，其包含由SEQ.ID NO25，29，33，37组成的组的一种或多种序列或其片段。
27.调节序列，其包含SEQ.ID NO38或其片段。
28.一种筛选PPAR活性调控剂的方法，其包括下述步骤a)提供宿主，其含有一种或多种可操作地连接可检测的核酸的PPRE’s；b)将所述的宿主与候选物接触；和c)定量所述的可检测核酸的mRNA或蛋白的表达水平。
29.根据权利要求28的方法，其包含相对于对照，测定可检测核酸的mRNA或蛋白的表达水平。
全文摘要
本发明涉及用作PPARδ活性的生物标记的ANGPTL4、诊断与PPARδ活性失调相关的疾病(例如血脂异常、肥胖或胰岛素抗性)的方法、监测患有与PPARδ活性失调相关疾病的患者的治疗的方法以及鉴别调控PPARδ活性的化合物的方法。
文档编号C12N15/63GK1680603SQ20051006278
公开日2005年10月12日 申请日期2005年3月30日 优先权日2004年3月30日
发明者罗格·G·克莱克, 马丁·埃贝林, 克里斯托夫·加尔德, 马库斯·迈尔, 马修·布莱克·赖特 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司