专利名称：定量检测转基因水平的方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及转基因水平的定量检测方法，特别是涉及一种使用携带内源和外源基因的重组质粒混合物制备的标准品检测转基因植物的转基因水平的方法，以及用于完成所述的定量检测的试剂盒。
背景技术：
由于转基因植物具有原品种所不具备的抗旱、抗病、抗虫、抗病毒或抗除草剂等优良生物学品质，所以转基因植物的生产面积逐年增加。例如，2002年全球转基因谷物(主要是大豆和玉米)的种植总面积达1.45亿英亩(约5867万公顷)。目前，全球已有16个国家约600万农民以种植转基因作物为生。
然而，世界上有些国家和地区，特别是欧洲至今仍对转基因食品采取强烈抵制态度。欧洲抵制美国等国家的转基因食品主要出于两方面的原因一是来自绿色和平组织的抵制；另一方面主要是国际贸易的影响。
正是由于转基因食品的支持者和反对者之间的争论不休，各国政府对转基因食品上市过程采取了一些具体措施。2001年，由113个国家和地区签署的联合国《生物安全议定书》明确规定，必须对转基因产品进行安全评价，在转基因产品越境转移时，应该征得进口国的同意，并进行标识。根据欧盟国家的新的转基因食品法规，凡含有0.9％以上转基因DNA或蛋白质的农作物或食品，在市场上销售时，必须贴上“GMO(转基因)”字样的标签。中国也于2002年3月开始实施转基因食品标识制度，并于2004年开始实施《进出境转基因产品检验检疫管理办法》。因此，迫切要求建立一种切实可靠的转基因产品的定量检测手段。
目前，用于转基因检测的已有方法主要有两类一是在核酸水平上进行检测，即通过PCR和Southern杂交方法检测基因组DNA中的转基因片段，或用RT-PCR和Northern杂交方法检测转基因植物的mRNA和反义RNA水平；二是在蛋白水平上进行检测，包括检测转基因植物中目的基因表达产物的酶联免疫吸附(ELISA)方法，和检测蛋白质表达产物的生物化学性质的生化检测法。
其中，聚合酶链反应(PCR)方法是目前应用于检测转基因植物或其产品的最常用方法。虽然理论上PCR方法能用于检测所有的转基因产品，但较易出现假阳性。另外，虽然ELISA方法具有很强的特异性，但无法检测未表达的目的基因。
由于目前所使用的转基因荧光定量检测试剂盒的的标准品几乎全部来自欧洲，所以检测试剂盒的生产成本很高，导致转基因产品的检测费用过大。为了减少转基因的检测费用，更好的推广转基因食品的标识制度，本发明人在基于原有欧洲标准品的转基因试剂盒的基础上，通过DNA重组技术成功地制备了用于转基因水平检测的质粒定量标准品，不但简化的标准品的制作工艺，而且大大降低了转基因试剂盒的生产和使用成本。
发明内容
本发明提供一种转基因含量的定量检测方法，特别是使用一种含有待检测转基因作物内源基因的重组质粒和含有待检测转基因植物插入片段的重组质粒的混合质粒定量检测转基因植物中的转基因水平的方法。本发明进一步提供基于所说的标准品的转基因水平检测试剂盒。
目前已有的转基因定量检测试剂盒中所使用的标准品大都是由Fluka公司提供的定量检测标准品(以下称为现有标准品)。该标准品在转基因检测试剂盒的生产成本中占很大比例，而且其基因提取过程繁杂，提取的数量也很有限，因此不利于转基因水平定量检测试剂盒的大批量生产。为了克服现有技术的缺陷和不足，本发明人在现有标准品的基础上，设计并制备了由分别携带植物固有内源基因和外源基因的重组质粒DNA的混合物构成的转基因水平检测标准品。
因此，本发明的一个目的是提供一种用于检测转基因植物的转基因水平的方法，特征在于其中所使用的转基因标准品是分别携带植物特有的内源基因和被转移的外源基因的重组质粒的混合物。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的转基因植物是转基因大豆。
本发明的另一个目的是提供一种用于检测转基因植物的转基因水平的试剂盒，特征在于其中所使用的转基因标准品是分别携带植物特有的内源基因或被转移的外源基因的重组质粒的混合物。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的转基因植物是转基因大豆。
转基因作物本身具有的固有基因称为内源基因，外源插入的基因称为外源基因。现有的定量标准品是由一定量的转基因作物和一定量的非转基因作物按比例混合而成的。
本发明的重组质粒标准品包含两个部分一是将内源基因插入质粒中制备内源基因重组质粒，二是将转基因植物中的插入片段导入质粒中制备外源基因重组质粒，内源基因参照重组质粒和外源基因重组质粒按一定的比例模拟现有标准品混合均匀，即得到转基因水平检测的定量标准品。一般说来，可以按照下述步骤制备本发明的标准品1)分别将转基因植物内源基因片段和外源插入片段克隆到适当的质粒载体中，然后将所得到的重组质粒导入大肠杆菌宿主细胞。大量培养所获得的阳性菌落并提取和纯化质粒DNA后，测定并计算重组质粒的拷贝数。梯度稀释已知拷贝数的重组质粒分别制备内源和外源重组质粒的线性梯度制剂。
2)用内源基因线性梯度制剂对一定量和已知浓度的现有标准品中的内源基因进行定量分析，获得该含量下内源基因的拷贝数；用外源基因线性梯度制剂对一定量和已知浓度的现有标准品中的外源基因进行定量分析，获得该含量下外源基因的拷贝数。
3)根据该含量现有标准品的外源基因的拷贝数推算其它定量标准品中的外源基因的拷贝数。
4)按一定的比例将适当拷贝数的外源基因重组质粒和内源基因重组质粒混合均匀即得到本发明的质粒定量标准品。
用于转基因植物中转基因水平检测的方法是荧光PCR方法。众所周知，荧光定量PCR技术是在常规PCR的基础上，加入一个与靶序列互补的、一端标记有荧光发射基团，另一端标记有荧光淬灭基团的荧光标记探针。当探针未与靶基因相结合时，发射基团与淬灭基团相对接近，因受淬灭基团的抑制而不产生荧光。如果荧光标记探针与靶基因互补结合，则荧光发射基团与淬灭基团相对分离，导致淬灭作用解除，荧光发射基团产生荧光。由于荧光发射基团产生的荧光的强度与PCR产物的量成正比，因而可以实时地检测PCR扩增情况。荧光PCR方法采用完全闭管检测，不需PCR后处理，避免了交叉污染。同时采用实时检测技术，所得Ct值和原始模板数量完全线性相关，所以其定量准确率极高。
为了方便起见，虽然以上主要以转基因大豆为例，描述了本发明方法和试剂盒的原理和基本精神，但本领域技术人员应该理解到，本发明的方法和试剂盒并不仅适用于转基因大豆的转基因水平的定量检测，而且可用于其他转基因植物，例如转基因玉米、小麦、大麦、水稻、番茄等转基因水平定量检测。本发明的方法不仅适用于转基因植物中CaMV 35S启动子的定量检测，也适用于Nos终止子和CP4 EPSPS、CryIA(b)、Pat、Bar等外源插入基因的定量检测。
可以使用Excel办公软件分析本发明转基因水平检测方法和试剂盒的可靠性和准确性。例如，可以使用本发明的标准品和基于该标准品的试剂盒，按常规方法检测并记录具有不同转基因水平的标准品及待测样品中的外源基因和内源基因的Ct值(循环域值)，然后将所得数据输入Excel文件，分别计算出定量标准品和各待测样品的平均Ct值(Ct)和ΔCt值(ΔCt＝FamCt-JoeCt)。根据标准品GMO水平的对数值及相应的ΔCt值，做出回归曲线方程LogX＝Y-b/m，并计算出它们之间的线性关系。
我们的分析结果表明，本发明的质粒标准品具有良好的检测灵敏度，可检测的转基因水平甚至低达如0.1％。分析还显示，使用本发明的质粒标准品测得的标准曲线的相关系数大于0.96。与现有试剂盒的标准品相比，两者的定量偏差≤20％。
特别是，与目前常用的转基因定量标准品相比，本发明的标准品无须进行复杂的DNA提取，可以一次性大量制备质粒标准品，所以大大节省了基于该标准品的试剂盒的生产和使用成本。
图1是Fluka生产的定量标准品外源基因的PCR扩增曲线图。
图2是Fluka生产的定量标准品内源基因的PCR扩增曲线图。
图3是本发明的定量标准品外源基因的PCR扩增曲线图。
图4是本发明的定量标准品内源基因的PCR扩增曲线图。
具体实施例方式
实施例1转基因大豆CaMV 35S启动子荧光PCR定量检测试剂盒中使用的质粒标准品的制备本实施例以转基因大豆的检测为例，具体说明本发明的质粒标准品及其试剂盒的制备和使用效果。
(1)重组质粒的制备采用特异性引物分别扩增转基因大豆(IRMM-410S，购自Fluka公司)烟草花叶病毒(CaMV)35S启动子和大豆外源凝集素(Lectin)基因片段。PCR产物经纯化后，与puCm-T质粒(购买自上海生工生物技术服务有限公司)连接并将连接产物转入大肠杆菌感受态DH5α中。37℃过夜培养后，利用蓝白斑筛选法挑选白色阳性菌落(具体操作方式参见《分子克隆》第三版第8章方案4)。
阳性菌落经37℃培养16小时后，使用碱裂解法提取质粒DNA，以进一步鉴定阳性菌落。
(2)线性质粒梯度制剂的制备将如上获得的含有CaMV 35S启动子和Lectin基因片段的重组质粒经纯化后，以紫外分光光度法测定质粒DNA的OD260值(重复测10次的平均值)，获得质粒浓度。根据插入片段和PuCm-T载体片段的大小估算出重组质粒的碱基数，并将质粒的浓度转换成质粒拷贝数。
对重组质粒10×梯度稀释(5次)，分别获得具有已知拷贝数的、携带CaMV 35S启动子基因和携带Lectin基因片段之质粒的梯度制剂。经荧光PCR检测，测知两种质粒线性梯度制剂间的线性关系(参见表1)。
表1CaMV 35S启动子质粒和Lectin基因片段质粒各梯度拷贝数及线性关系 (3)2％转基因大豆标准品中CaMV 35S启动子和Lectin基因拷贝数的定量检测利用改良的CTAB提取方法提取100mg 2％的转基因大豆标准品(Fluka公司生产，简称Fluka标准品)的DNA，并将其融解于100μl 1×TE(10mM Tris，1mM EDTA pH8.0)中。
使用如上制得的分别携带CaMV 35S启动子和Lectin基因的重组质粒线性梯度制剂，分别对该标准中的CaMV 35S启动子和Lectin基因的拷贝数进行定量分析(重复10次)。经计算，上述标准品中CaMV 35S启动子的浓度为6.09E+008拷贝/ml，Lectin基因的拷贝数为3.91E+010拷贝/ml。
(4)本发明的用于大豆转基因水平检测的质粒标准品的获得根据上述结果，将分别携带CaMV 35S启动子基因和Lectin基因的重组质粒按照一定的比例混合，得到用于大豆转基因水平检测的2％质粒标准品。
根据5％、1％、0.5％、0.1％Fluka标准品与2％Fluka标准品中CaMV 35S启动子的倍数关系，将已知拷贝数的含CaMV 35S启动子基因的重组质粒与含Lectin基因的重组质粒按照一定的比例混合，即可得到5％、1％、0.5％、0.1％转基因水平的质粒标准品。将上述的标准品组合起来，即得到完整的5％、2％、1％、0.5％和0.1％转基因的本发明的质粒标准品。
(5)本发明质粒标准品的使用效果用改良的CTAB提方法提取公司5％、2％、1％、0.5％、0.1％Fluka标准品各10份。分别配制转基因大豆CaMV 35S启动子扩增体系和Lectin基因扩增体系。扩增所使用的反应体系如下列表2中所示
表2转基因大豆CaMV 35S启动子反应液和Lectin基因反应液
PCR反应中，用于扩增待检外源基因CaMV 35S启动子基因的上游和下游引物分别是5’-GCC TCT GCC GAC AGT GGT-3’(SEQ ID NO1)和5’-AAGACG TGG TTG GAACGT CTT C-3’(SEQ ID NO2)；探针序列是5’-(FAM)-CAA AGA TGG ACC CCC ACC CAC G-(TAMRA)-3’待用于扩增待检内源基因Lectin基因的上游和下游引物分别是5’-TCCACC CCC ATC CAC ATT T-3’和5’-GGC ATA GAA GGT GAA GTT GAAGGA-3’；探针是5’-(FAM)-AAC CGG TAG CGT TGC CAG CTT CG-(TAMRA)-3’。
以上引物及探针序列均引自欧盟委员会转基因检测引物和探针数据库。
对转基因大豆的实际检测结果表明，本发明的质粒标准品和基于这些标准品制备的检测试剂盒可检测的大豆转基因水平低达0.1％以下，并且其标准曲线的线性关系大于0.96。另外，以Fluka标准品为待检品，使用本发明的标准品和试剂盒检测的结果显示，各定量点(5％、2％、1％、0.5％、0.1％)的定量偏差均小于20％(参见表3)。
表3以Fluka定量标准品为待测品，用质粒定量标准品进行定量的结果 (6)质粒标准品的稳定性试验将本发明的转基因大豆35S启动子荧光PCR定量检测试剂盒中的质粒标准品于37℃分别放置0、1、3、5、7天后，对上述Fluka标准品(5％、2％、1％、0.5％、0.1％)进行转基因水平检测。试验结果显示放置0-7天后，本发明的质粒定量标准品，在对各不同转基因水平的Fluka标准品的定量偏差≤20％；质粒定量标准品的标准曲线的线性关系大于0.96。该质粒标准品在4℃或-20℃下的保存期限为1年以上。
权利要求
1.一种用于检测转基因植物的转基因含量的方法，特征在于其中所使用的转基因含量定量标准品是分别携带植物特有的内源基因和被转移的外源基因的两个重组质粒的混合物。
2.根据权利要求1的方法，其中所说的转基因植物是转基因大豆。
3.一种用于检测转基因植物的转基因水平的试剂盒，特征在于其中所使用的转基因标准品是分别携带植物特有的内源基因或被转移的外源基因的重组质粒的混合物。
4.根据权利要求4的方法，其中所说的转基因植物是转基因大豆。
全文摘要
本发明提供了转基因水平的定量检测方法，特别是提供了一种使用携带内源和外源基因的两个重组质粒定量检测转基因植物的转基因水平的方法，本发明进一步提供了用于完成所述的定量检测方法的试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK1840692SQ200510063648
公开日2006年10月4日 申请日期2005年3月29日 优先权日2005年3月29日
发明者宋庆涛, 黄奇林 申请人:英科新创(厦门)科技有限公司