一种鹅鸭源性羽绒成份的定量检测方法、定量检测试剂盒及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，具体地说，是关于一种鹅鸭源性羽绒成份的定量检测 方法、定量检测试剂盒及应用。
【背景技术】
[0002] 从古至今，羽绒作为一种天然保暖纺织填充材料，一直深受世人喜爱。中国是世 界上最大的羽绒制品生产国和出口国，出口数量占据了国际市场70%以上的份额，在国际 羽绒市场上占有举足轻重的位置。在羽绒羽毛产业中，除极小部分作为服饰或工艺品的装 饰羽毛外，很大部分是作为纺织填充材料的鹅绒和鸭绒。鹅绒与鸭绒相比，鹅绒的绒朵大， 中空度高，蓬松度好，回弹性优，保暖性强。一般鹅绒在各项指标上都优于鸭绒，因而在市 场上鹅绒的价格比鸭绒更高。有些不法羽绒商贩就企图以鸭绒冒充鹅绒，以获取巨大的经 济利益。因此世界各国的羽绒毛标准都对鹅绒中的鸭绒含量作了最高限定，一般不得超过 10%~15%。我国有部分企业曾因出口羽绒制品的鹅绒含量不达标而被退运索赔，也有企 业因此破产倒闭。
[0003] 鹅鸭绒均属水禽羽绒，其化学成分均为角质化的蛋白质，外形结构又大体相近。目 前国内外普遍采用显微镜法，通过观察羽绒羽毛的微观结构对鹅绒、鸭绒加以区分。此方法 是基于鹅鸭绒羽枝上的结节间距不同而进行区分，但当绒朵生长不完全时，鹅鸭绒两者之 间就不存在这种形态上的差别。图1为放大投影仪下典型的鸭毛绒、鹅毛绒的显微状态（放 大80倍）。图2为放大投影仪下无法区分毛绒的显微状态（放大80倍）。显微镜检测劳 动强度大，费时，费力，且依赖检测人员的经验，具有不可避免的主观性，而且不适宜大批量 样本的分析，因此建立准确客观地鉴别鹅绒和鸭绒的新方法，对于维护公平贸易和保护我 国羽绒企业对外贸易的顺利开展有着重要的意义。
[0004] 对于天然动物纤维而言，DNA检测方法不依赖于纤维固有的形态结构及其他理化 性质，而是依据物种自身的特异性核苷酸序列开展检测，因而不受检测人员的主观判断及 经验影响，结果更为准确和可靠。随着生物技术和生命科学的飞速发展，DNA检测技术已经 在食品检测、医疗诊断、司法鉴定及环境监测等领域得到了广泛的应用。近年，有很多学者 开展了基于DNA技术的纤维物种鉴别研究，对纺织品质量检测现代化技术的发展具有重要 的推动作用。
[0005] 家鹅分中国鹅和欧洲鹅两个系统，欧洲鹅起源灰雁（Anser anser)，中国鹅是由鸿 雁（Anser cygnoides)驯养而成。家鸭则主要是由绿头鸭（Anas platyrhynchos)和斑嘴 鸭（Anas poecilorhyncha)培育形成的。因此设计能横跨两个物种并相互区别的高效特异 性引物对和探针是本发明的关键点。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的是提供一种鹅鸭源性羽绒成分的定量检测方法，以解决现有的 鹅鸭源性羽绒成分不能进行批量样本的检测分析且费时费力的问题；本发明的第二个目的 是提供一种鹅鸭源性羽绒成分的定量检测试剂盒，以使鹅鸭源性羽绒成分的检测快速、准 确；本发明的第三个目的是提供一种鹅鸭源性羽绒成分的定量检测试剂盒的应用。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0008] 作为本发明的第一个方面，一种鹅鸭源性羽绒成分的定量检测方法，该方法包括 以下步骤：
[0009] 步骤一：以待测样品的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，获得PCR扩增产物；
[0010] 步骤二：检测扩增产物的荧光信号；
[0011] 步骤三：计算待测样品中鹅源性羽绒成分和鸭源性羽绒成分的含量；
[0012] 其中，用于PCR扩增的反应体系中含有扩增鹅源性羽绒成分特异性引物对和鹅源 性羽绒成分特异性探针，以及扩增鸭源性羽绒成分特异性引物对和鸭源性羽绒成分特异性 探针。
[0013] 根据本发明，所述扩增鹅源性羽绒成分特异性引物对的序列如SEQ ID N0 :1和SEQ ID N0 :2所示；所述鹅源性羽绒成分特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID N0 :3所示；所述扩 增鸭源性羽绒成分特异性引物对的序列如SEQ ID N0 :4和SEQ ID N0 :5所示；所述鸭源性 羽绒成分特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID N0 :6所示。
[0014] 根据本发明，步骤一的PCR扩增的条件如下：
[0015] PCR扩增的反应体系为25yl，包括2X实时荧光PCR试剂12. 5yl，引物各 0? 4 y M，探针 0? 2 y M，DNA 模板 5 y 1;
[0016] 进行PCR扩增程序为：95°C变性10min ;进入循环，95°C变性15s，60°C退火和延伸 lmin，共40个循环。
[0017] 作为本发明的第二个方面，一种鹅鸭源性羽绒成分的定量检测试剂盒，所述定量 检测试剂盒包括：
[0018] (a)扩增鹅源性羽绒成分特异性引物对，所述扩增鹅源性羽绒成分特异性引物对 的序列如SEQ ID N0 :1和SEQ ID N0 :2所示；
[0019] (b)鹅源性羽绒成分特异性探针，所述鹅源性羽绒成分特异性探针的核苷酸序列 如 SEQ ID N0 :3 所示；
[0020] (c)扩增鸭源性羽绒成分特异性引物对，所述扩增鸭源性羽绒成分特异性引物对 的序列如SEQ ID N0 :4和SEQ ID N0 :5所示；
[0021] (d)鸭源性羽绒成分特异性探针，所述鸭源性羽绒成分特异性探针的核苷酸序列 如 SEQ ID N0 :6 所示。
[0022] 根据本发明，所述试剂盒还包括：
[0023] (a)鹅源性标准参照物；
[0024] (b)鸭源性标准参照物。
[0025] 作为本发明的第三个方面，一种鹅鸭源性羽绒成分的定量检测试剂盒的应用，所 述定量检测试剂盒用于定量检测鹅源性羽绒成分和鸭源性羽绒成分。
[0026] 本发明的有益效果是：
[0027] 1、可快速、简便地检测鹅鸭混合绒中的鹅绒和鸭绒含量；
[0028] 2、灵敏度高，荧光定量PCR只需微量的DNA模板；
[0029] 3、针对鹅源性羽绒成分和鸭源性羽绒成分的特异性引物对和探针特异性好，准确 性高，误差小于±5%。
【附图说明】
[0030] 图1为放大投影仪下典型的鸭绒（左）和鹅绒（右）的显微状态（放大80倍）。
[0031] 图2为放大投影仪下无法区分毛绒的显微状态（放大80倍）。
[0032] 图3为鹅源性成分的引物探针的特异性检测结果。
[0033] 图4为鸭源性成分的引物探针的特异性检测结果。
[0034] 图5为鹅源性成分和鸭源性成分检测体系的灵敏度检测结果，其中，红色线代表 鹅源性成分检测体系的灵敏度检测结果，黑色线代表鸭源性成分检测体系的灵敏度检测结 果，从右往左各点分别代表鹅绒DNA和鸭绒DNA1倍、10倍、100倍、1000倍、10000倍梯度 稀释。
[0035] 图6为鹅鸭绒定量标准曲线，其中，从右往左各点分别代表鹅绒含量为90%， 80%，70%，60%，50%，40%，30%，20% 的鹅鸭混合绒 DNA。
【具体实施方式】
[0036] 以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本 发明而非用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常 规条件，如《分子克隆：实验室手册》（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989)中所述的条件或厂商提供的条件进行。
[0037]实施例1、引物对和探针的设计
[0038] 根据NCBI中已发表的鸿雁和灰雁、绿头鸭和斑嘴鸭的线粒体基因组序列（登录 号：KP238480. 1，NC_011196. 1，EU009397. 1，NC_022418. 1)，兼顾鸿雁和灰雁两者线粒体基 因的相同部分，与绿头鸭和斑嘴鸭的相应区域序列进行比较，选取合适的序列进行引物探 针设计。
[0039] 针对鹅源性成分的目的片段长度为84bp。荧光定量引物对和探针的序列如下：
[0040] AnserF5 :5'-ACCCATTTTAATGAATGCTCACAG-3'（SEQ ID N0 :1)
[0041] AnserR5 :5'-AATCCGTCTGATACGAACTGCA-3'（SEQ ID NO :2)
[0042] AnserP5 :FAM-ATGCTCCAACAACAACT-MGB(SEQ ID NO :3)
[0043] 针对鸭源性成分的目的片段长度为108bp。荧光定量引物对和探针的序列如下：
[0044] duckB-1 :5' -AATGCATAACATGACCTAAATTTATTAGAGA-3'（SEQ ID N0 :4)
[0045] duckB-2 :5'-GCTGGTTAATTGGGTAATGTTTGTT-3'（SEQ ID NO :5)
[0046] duckB-P：FAM-ACTAAAGACGATCCAAAC-MGB(SEQ ID NO：6)
[0047] 其中，FAM表示荧光报告基团，MGB表示淬灭基团。本发明采用荧光探针法，其检测 原理是利用荧光标记特异性探针来识别模板。与现有技术中SYBR染料法相比，本发明荧光 标记特异性探针的特异性更强。
[0048] 实施例2、羽绒DNA的抽提
[0049] 纯白鹅绒和纯白鸭绒均购自上海民强羽绒厂，且经显微镜检测