专利名称：带有培养装置的类复杂器官前体及其构建和培养方法
技术领域：
本发明涉及一种复杂器官前体的设计及其构建方法，属于生物组织工程技术领域。
背景技术：
世界上每年患有组织缺损或器官衰竭的病人数逾千万，仅美国每年以外科手术治疗此类病人约800万。然而，活体供体组织器官有限，现有的机械装置不具备复杂组织器官的所有功能，不能防止患者的病情进一步恶化。据此，以提高此类疾患治疗水平为宗旨的组织工程(Tissue Engineering)技术应运而生。组织工程是一门由生物学、医学、材料学、工程学等多学科交叉产生的高新技术学科。其含义是应用生命科学与工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物[Merem RM.Med & BiolEng & Comput.1992；308-12]。近十年来，科学家们运用组织工程技术，利用人体残余器官的少量正常细胞进行体外繁殖，获得患者所需的、具有相同功能的器官，又不存在排斥反应，已取可喜的成果，不少新近成立的生物技术公司正准备正在投入巨资实现商品化。在美国，已形成价值40亿美元的产业，并以每年25％的速度递增。如Pro Osteon珊瑚骨移植材料产值超过1000万美元[Miller M，Biotech Bioeng，1996；504347-4348]。但现存的组织工程技术面临许多困难和限制，组织工程应用研究所取得的成功均是在那些结构与生理功能较为简单的组织如骨骼、软骨。传统的支架制备技术不能准确地控制孔的大小、结构、空间分布及贯通的通道，营养供应和血管长入都受到很大的限制。传统组织工程方法一般先制备结构支架，在进行细胞培养过程中由于上层细胞消耗大部分的氧气和营养，限制了这些组分向底层扩散，从而限制了细胞向支架深层的迁移等。这种先制备支架，再培养细胞的方法，耗时又费力，细胞在向支架内迁移的过程中很可能就已经变型、老化，达不到及时治疗临床病人的要求。同时传统的组织工程技术不能满足将不同的细胞在空间准确定位与定点放置，构建复杂组织器官的功能梯度结构的需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种带有培养装置的类复杂器官前体及其构建和培养方法，旨在前人工作的基础上，利用计算机建模、细胞组装技术，直接将细胞和细胞外基质仿生材料组装成三维结构，通过培养装置使类复杂器官前体在三维应力场的作用下，使细胞间建立连接并诱导生长，形成功能组织，使得此类器官前体向功能型器官过渡，从而达到修复再生的目的，具有广泛的应用前景。
本发明的技术方案如下
本发明提供了一种带有培养装置的类复杂器官前体，其特征在于所述的类复杂器官前体与一个辅助培养装置相连，所述的类复杂器官前体是由光滑曲面围成的三维结构的类器官腔体，其腔壁是由细胞与基质材料组成，在腔壁上设有多个液体进出通道；所述的辅助培养装置包括设置在腔体内的气囊和腔体外的气囊以及与内外气囊相连的气体压缩装置，在外气囊和内气囊之间填充有细胞培养液。
本发明提供的另一种带有培养装置的类复杂器官前体，其特征在于所述的类复杂器官前体与一个辅助培养装置相连，所述的类复杂器官前体是由光滑曲面围成的三维结构的类器官腔体，其腔壁是由细胞与基质材料组成，在腔壁上设有液体进口和液体出口，在腔体内设有细胞与基质材料组成的管网状结构；所述的辅助培养装置包括脉动或旋转的生物反应器，所述的类器官前体的液体进出口与所述的生物反应器的液体循环系统相连。
本发明提供的另一种三维结构的类复杂器官前体培养装置，其特征还在于在所述的细胞与基质材料组成的管网状结构上设有液体微流道。
本发明提供的一种带有培养装置的类复杂器官前体的构建和培养方法，其特征在于该方法包括如下步骤1)建立三维结构的类复杂器官前体模型根据人体器官的结构及功能特点，利用相应的计算机辅助设计软件设计出三维结构的类复杂器官前体模型及成形路径；2)种子细胞与基质材料混和物的制备制备浓度为1～40％的无菌基质材料溶液；购买或提取种子细胞，将所得的不同种类的种子细胞的悬浮液离心分离后分别与含有1～40％的基质材料的溶液均匀混合，制成细胞与基质材料的混合物；所述的基质材料为明胶、胶原、明胶/胶原、胶原/壳聚糖、明胶/壳聚糖或明胶/海藻酸钠，其中所述的胶原/壳聚糖、明胶/壳聚糖或明胶/海藻酸钠的混合溶液中胶原与壳聚糖、明胶与壳聚糖或明胶与海藻酸钠的质量比0.1～100∶1，所述种子细胞占所述基质材料混合溶液的1～90％；所述的基质材料的溶液为水溶液或pH＝6～8的0.09M的氯化钠或0.09M的氯化钠和3-羟甲基氨基甲烷盐酸溶液；所述的基质材料中还可加入1～10％的血清、0.0001～0.1％的细胞生长因子及基因或0.1～100％的细胞外基质混合物(Matrigel)、肝素、硫酸软骨素、透明质酸；3)种子细胞与基质材料混和物的三维受控堆积成形根据步骤1)中模型的成形路径，利用快速成形工艺，采用单喷头或多喷头的复合数字喷射技术，采用离散/堆积工艺，对步骤2)中种子细胞与基质材料的混合物进行离散/堆积成形，形成具有1)中模型所定义的三维结构的类器官前体的雏形，将此三维类器官前体雏形经物理凝聚、化学交联方法进行处理，得到三维类复杂器官前体；4)将类复杂器官前体内外设置气囊，在内外气囊之间注入细胞培养液；将内外气囊与气体压缩装置连接；通过气体压缩装置使内外气囊膨胀或收缩，使类复杂器官前体受到三维应力的作用，同时使细胞培养液通过腔体上的液体通道在腔内和腔外之间流动，使各层细胞间在可控三维应力的作用下建立紧密连接并诱导其生长，形成功能性器官。
本发明提供的另一种带有培养装置的类复杂器官前体的构建和培养方法，其特征在于该方法包括如下步骤1)建立三维结构的类复杂器官前体模型根据人体器官的结构及功能特点，利用相应的计算机辅助设计软件设计出三维结构的类复杂器官前体模型及成形路径；2)种子细胞与基质材料混和物的制备制备浓度为1～40％的无菌基质材料溶液；购买或提取种子细胞，将所得的不同种类的种子细胞的悬浮液离心分离后分别与含有1～40％的基质材料的溶液均匀混合，制成细胞与基质材料的混合物；所述的基质材料为明胶、胶原、明胶/胶原、胶原/壳聚糖、明胶/壳聚糖或明胶/海藻酸钠，其中所述的胶原/壳聚糖、明胶/壳聚糖或明胶/海藻酸钠的混合溶液中胶原与壳聚糖、明胶与壳聚糖或明胶与海藻酸钠的质量比0.1～100∶1，所述种子细胞占所述基质材料混合溶液的1～90％；所述的基质材料的溶液为水溶液或pH＝6～8的0.09M的氯化钠或0.09M的氯化钠和3-羟甲基氨基甲烷盐酸溶液；所述的基质材料中还可加入1～10％的血清、0.0001～0.1％的细胞生长因子及基因或0.1～100％的细胞外基质混合物(Matrigel)、肝素、硫酸软骨素、透明质酸；3)种子细胞与基质材料混和物的三维受控堆积成形根据步骤1)中模型的成形路径，利用快速成形工艺，采用单喷头或多喷头的复合数字喷射技术，采用离散/堆积工艺，对步骤2)中种子细胞与基质材料的混合物进行离散/堆积成形，形成具有1)中模型所定义的三维结构的类器官前体的雏形，将此三维类器官前体雏形经物理凝聚、化学交联方法进行处理，得到三维类复杂器官前体；4)将类复杂器官前体置于脉动或旋转的生物反应器的密封腔中，使类器官前体的液体进出口与所述的生物反应器的液体循环系统相连；通过脉动或旋转使复杂器官前体受到三维应力的作用，使各层细胞间在可控三维应力的作用下紧密接触，细胞间建立连接并诱导生长，形成功能组织；同时满足细胞增殖生长及新陈代谢的需要。
本发明与现有技术相比，具有以下优点及突出性效果本发明利用计算机建模、细胞组装机可以实现不同细胞和基质材料在空间的准确定位，克服了组织工程目前存在的在三维支架中诱导培养细胞需要时间长，细胞在支架中分布不均匀，细胞很难渗入到深层结构中等缺点。本发明模仿复杂器官的结构和功能，实现了三维尺度上类复杂器官前体的构建，并通过可控三维应力场和生物反应器的训练或培养，促使复杂器官中细胞按某一方向排列，提高了器官前体的机械强度，使之具有一些特殊的功能。同时满足了细胞增殖生长及新陈代谢的需要，有类器官前体向天然器官方向的转变。如可以模拟心脏的房室结构，实现了心脏的泵血功能，从而达到修复心脏受损心肌组织或整个心房器官、改善其功能的目的。
图1为带有气囊培养装置的类心脏前体的实施例的结构示意图。
图2为类肝脏前体的结构示意图。
图3为带有生物反应器的类肝脏前体的结构示意图。
具体实施例方式
图1本发明提供的一种带有气囊培养装置的类心脏前体的结构示意图。所述的类心脏前体与一个辅助培养装置相连，所述的类复杂器官前体是由光滑曲面围成的具有轴对称且开口的三维结构的类心脏腔体1，其腔壁2是由细胞与基质材料组成，在腔壁上设有多个液体进出通道3；所述的辅助培养装置包括设置在腔体内的内气囊4和腔体外的外气囊5以及与内外气囊相连的气体压缩装置6，在外气囊和内气囊之间填充有细胞培养液7。在气囊中加入一定量的气体，控制气体在内外气囊中的流动，从而控制内外气囊的收缩或膨胀。当外气囊膨胀、内气囊收缩时，类器官前体受到三维压应力的作用，向腔内收缩，同时营养液通过液体通道3在由腔外向腔内流动。当外气囊收缩、内气囊膨胀时，类器官前体受到三维拉应力的作用，向腔外膨胀，同时营养液通过液体通道由腔内向腔外流动。经过一段时间的训练，使得此类器官前体在三维应力场的作用下，一方面使各层细胞间在可控三维正应力的作用下紧密接触，促使细胞间建立起相互的连接，形成功能组织；另一方面促进了营养物质在此类器官前体中的流通，满足了细胞增殖生长及新陈代谢的需要。
图2为类肝脏前体的结构示意图。图3为带有生物反应器的类肝脏前体的结构示意图。所述的类肝脏前体与一个辅助培养装置相连，所述的类肝脏前体是由光滑曲面围成的三维结构的类肝脏前体的腔体1，其腔壁是由细胞与基质材料组成，在腔壁上设有液体进口8和液体出口9，在腔体内设有细胞与基质材料组成的管网状结构10；所述的辅助培养装置包括脉动或旋转的生物反应器11和一个与该生物反应器相连的液体泵12，所述的液体进出口与所述的生物反应器的液体循环系统相连。通过生物反应器的脉动力或旋转力的作用，使得此类肝脏前体中的细胞按某一方向有规律排列并建立起连接，形成功能性肝脏组织。
本发明的具体实施步骤如下1)具有三维结构的复杂器官前体模型的建立根据人体器官(如心脏、肝脏、肾脏等)的结构及功能特点，利用相应的计算机辅助设计软件(如SolidWorks)设计出一种具有轴对称的球形、椭圆形或不对称的扁圆形、树叶形特殊三维结构的复杂器官前体模型。此模型的特征是一种对称或不对称的光滑曲面围成的三维结构，此结构有腔体是有一定厚度的细胞与基质组成的薄壁，腔壁上有液体进出口。薄壁内可含有贯通的管网结构，以保证培养液(体外培养)或血液(体内植入)流通，腔壁上可带多孔。
2)种子细胞与基质材料混和物的制备购买或提取种子细胞，将选定的生物材料溶解于溶液中，制备浓度为1～40％的无菌基质材料溶液。将所得的不同种类的种子细胞的悬浮液离心分离后分别与含有1～40％的基质材料的溶液均匀混合，制成细胞与基质材料的混合物；所述的基质材料为明胶、胶原、明胶/胶原、胶原/壳聚糖、明胶/壳聚糖或明胶/海藻酸钠，其中所述的胶原/壳聚糖、明胶/壳聚糖或明胶/海藻酸钠的混合溶液中明胶与壳聚糖或明胶与海藻酸钠的质量比0.1～100∶1，所述种子细胞占所述基质材料混合溶液的1～90％；所述的基质材料的溶液为水溶液或pH＝6～8的0.09M的氯化钠或0.09M的氯化钠和3-羟甲基氨基甲烷盐酸溶液；所述的基质材料中还可加入1～10％的血清、0.0001～0.1％的细胞生长因子及基因或0.1～100％的细胞外基质混合(Matrigel)、肝素、硫酸软骨素、透明质酸；3)种子细胞与基质材料混和物的三维受控堆积成形根据1)中模型定义成形路径，利用快速成形工艺，采用单或多喷头的复合数字喷射技术，采用离散/堆积工艺，对2)中种子细胞与基质材料的共混物进行离散/堆积成形，形成具有1)中模型所定义的三维轴对称结构的类器官前体的雏形。将此三维类器官前体经物理凝聚、化学交联等方法进行处理，使之在相当长的时间内保持结构稳定。
4)类器官前体中的细胞沿可控的三维应力场的训练及体外诱导培养将3)中制得的类器官前体置入特定的装置中，使得其中的细胞受到可控的三维应力场的作用，细胞间建立起连接并诱导生长，最终趋向于形成特定的功能。具体方法如下a)将一个与3)中制得类器官前体内腔大小相符的内气囊消毒后，通过此类器官前体的上端开口放入内腔中；然后将整个系统放入外气囊中。在内外气囊之间注入类器官前体培养所必须的营养液(如图1)。在气囊中加入一定量的气体，使气囊膨胀到一定容积。通过计算机控制系统，控制气体在内外气囊中的流动，从而控制内外气囊的收缩。当外气囊膨胀、内气囊收缩时，类器官前体受到三维压应力的作用，向腔内收缩，同时营养液通过多孔及血管通道由腔外向腔内流动。当外气囊收缩、内气囊膨胀时，类器官前体受到三维拉应力的作用，向腔外膨胀，同时营养液通过多孔及血管通道由腔内向腔外流动。经过一段时间的训练，使得此类器官前体在三维应力场的作用下，一方面使各层细胞间在可控三维正应力的作用下紧密接触，促使细胞间建立起相互的连接，形成组织；另一方面促进了营养物质在此类器官前体中的流通，满足了细胞增殖生长及新陈代谢的需要。这样，在应力场的多重作用下，细胞间建立连接并诱导生长，使此类器官前体趋向于形成特定的功能。
b)对于肝脏、肾脏等多血管复杂器官，采用生物反应器对其进行诱导培养(图3，37℃、5％CO2)。其中生物反应器可为流动式、脉动式或旋转式。也可将整个生物反应器放在CO2培养箱中对其进行诱导培养。
下面举出的几个实施例以进一步理解本发明实施例1类心肌腔前体的制备1)类心肌腔前体三维结构模型的建立根据心脏的结构及功能特点，利用相应的计算机辅助设计软件(如SolidWorks)设计出一种具有轴对称的特殊三维结构的类心心肌腔前体模型(图1)。
2)种子细胞与基质材料混和物的制备提取内皮细胞、心肌细胞与成纤维细胞的混合物，将I型胶原按重量比0.4％溶于1％的醋酸溶液中，将心内皮细胞、肌细胞与成纤维细胞的混合物与胶原溶液、细胞外基质Matrigel(0.1％)水溶液按10∶1∶1均匀混和，制成细胞与基质材料混和物，用氢氧化钠溶液(0.1N)调节混和物pH到7。
3)细胞与基质材料混和物的三维受控堆积成型及体外诱导培养根据1)中模型定义成形路径，利用快速成形工艺，采用单喷头的复合数字喷射技术，采用离散/堆积工艺，对2)中细胞与基质材料的共混物进行离散/堆积成形，形成具有1)中模型所定义的三维轴对称结构的类心肌腔前体的雏形，此结构有中空的腔体。腔体由一定厚度的细胞与基质组成的薄壁，上端开口，腔壁上可带多孔。将此三维类心肌腔前体在37℃、5％的CO2培养箱中经物理凝固45分钟，加入新鲜的富含血清的培养液继续7天。
4)类心肌腔沿可控三维应力场的训练将一个与3)中制得类心脏前体内腔大小相符的气囊消毒后，通过此类心肌腔前体的上端开口放入内腔中。在此类心肌腔前体的腔外也包裹一相应大小的消毒气囊。然后将整个系统放入一封闭等容腔内。在此封闭等容腔中，注入类心肌腔前体培养所必须的营养液(如图1)。在气囊中加入一定量的气体，使气囊膨胀到制定容积。通过计算机控制系统，控制气体在内外气囊中的流动，从而控制内外气囊的收缩。当外气囊膨胀、内气囊收缩时，类心肌腔前体受到三维压应力的作用，向腔内收缩，同时营养液通过多孔及血管通道由腔内向腔外流动。当外气囊收缩、内气囊膨胀时，类心肌腔前体受到三维拉应力的作用，向腔外膨胀，同时营养液通过多孔及血管通道由腔外向腔内流动。经过一段时间的训练，使得此类心肌腔前体在三维应力场的作用下，一方面使各层细胞间在可控三维正应力的作用下紧密接触，促使细胞间建立起相互的连接，形成组织；另一方面促进了营养物质在此类器官前体中的流通，满足了细胞增殖生长及新陈代谢的需要。这样，在应力场的多重作用下，细胞间建立连接并诱导生长，并具有三维方向的自主收缩能力，使此类心肌腔前体趋向于形成心脏的特定功能。
实施例2心房前体的制备1)类心肌腔前体三维结构模型的建立根据心脏的结构及功能特点，利用相应的计算机辅助设计软件(如SolidWorks)设计出一种具有轴对称的特殊三维结构的类心房前体模型(图1)。
2)种子细胞与基质材料混和物的制备购买已建系的胚胎干细胞、内皮细胞，将胚胎干细胞、内皮细胞分别与30％的明胶/壳聚糖(100∶1w/w)溶液制成胚胎干细胞、内皮细胞与基质材料混和物。分别在胚胎干细胞、内皮细胞与基质材料混和物中加入0.1％的心肌细胞生长因子或内皮细胞生长因子，混合均匀。
3)胚胎干细胞、内皮细胞与基质材料混和物的三维受控堆积成型及体外诱导培养根据1)中模型定义成形路径，利用快速成形工艺，采用两喷头的复合数字喷射技术，采用离散/堆积工艺，对2)中胚胎干细胞、内皮细胞与基质材料、生长因子的共混物进行离散/堆积成形，形成具有1)中模型所定义的三维轴对称结构的类心房前体的雏形。将此三维类器官前体经3％的多聚磷酸钠处理10分钟，再用0.2％的戊二醛水溶液交联2分钟，使之在相当长的时间内保持结构稳定。
4)类心肌腔沿可控三维应力场的训练将一个与3)中制得类心房前体内腔大小相符的气囊消毒后，通过此类心脏前体的上端开口放入内腔中。在此类心脏前体的腔外也包裹一相应大小的消毒气囊。然后将整个系统放入一封闭腔内。在此封闭腔中，注入类心脏前体培养所必须的营养液(如图1)。在气囊中加入一定量的气体，使气囊膨胀到制定容积。通过计算机控制系统，控制气体在内外气囊中的流动，从而控制内外气囊的收缩。当外气囊膨胀、内气囊收缩时，内心脏前体受到三维压应力的作用，向腔内收缩，同时营养液通过多孔及血管通道由腔外向腔内流动。当外气囊收缩、内气囊膨胀时，类心房前体受到三维拉应力的作用，向腔外膨胀，同时营养液通过多孔及血管通道由腔内向腔外流动。经过一段时间的训练，使得此类心房前体在三维应力场的作用下，一方面使各层细胞间在可控三维正应力的作用下紧密接触，促使细胞间建立起相互的连接，形成组织；另一方面促进了营养物质在此类器官前体中的流通，满足了细胞增殖生长及新陈代谢的需要。这样，在应力场的多重作用下，细胞间建立连接并诱导生长，并具有三维方向的自主收缩能力，使此类心房前体趋向于形成心房的特定功能。此类心房前体可直接贴附在病损肝脏上，起到修复再生的目的。
实施例3类肝脏前体的制备1)类肝脏前体模型的建立根据肝脏的结构及功能特点，设计出一种简化的具有管网结构的肝脏前体计算机辅助CAD(Computer-aided design)模型(图2)。
2)种子细胞与基质材料混和物的制备采用病人肝脏分离培养得到肝细胞(包括肝干细胞)、星状细胞、胆管上皮细胞或其混合细胞、内皮细胞，将内皮细胞、几种复合肝细胞与明胶/壳聚糖(1∶100w/w)的0.09M NaCI溶液分别复合，制备细胞与基质材料混和物。
3)细胞与基质材料混和物的三维受控堆积成型及体外诱导培养根据1)中模型定义成形路径，利用快速成形工艺，采用单喷头的复合数字喷射技术，采用离散/堆积工艺，对2)中复合细胞与基质材料的共混物进行离散/堆积成形，形成具有1)中模型所定义的三维轴对称结构的类肝脏前体的雏形。将此三维类肝脏前体经0.1％的戊二醛交联，使之在相当长的时间内保持结构稳定。
4)类肝脏前体模型的体外培养将3)中制得类肝脏前体放在脉动生物反应器中(图3)，让培养液流经前体中的管道。经过一周的训练，使得此类肝脏前体在液体流动力的作用下，细胞按某一方向有规律排列并建立起连接，形成肝组织。
实施例4人工肝脏前体的制备分离病人的骨髓干细胞，体外培养、扩增。将不同种类细胞悬液离心后分别或混合与40％明胶的0.09M的氯化钠三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液混合均匀，由细胞组装机制备将骨髓干细胞/基质材料组装成的多管道三维立体结构。用1％的戊二醛溶液反应30秒钟，生理盐水冲洗。此结构放在旋转生物反应器中培养两周，可直接贴附在病损肝脏上，起到修复再生的目的。
实施例5人工肝脏前体的制备购买已建系的胚胎干细胞、肝细胞基因等，体外诱导、培养、扩增。将不同种类细胞悬液离心后分别与20％明胶/海藻酸钠(100∶1w/w)的水溶液混合均匀，加入0.1％的肝细胞生长因子，由细胞组装机制备干细胞、肝细胞基因、细胞生长因子与明胶/海藻酸钠基质组成的多管道三维立体结构，先用10％的氯化钙交联20分钟，再用0.1％的戊二醛生理盐水交联10秒钟，放到脉动生物反应器中培养。
实施例6乳房前体的制备分离脂肪细胞，体外培养、扩增。将脂肪细胞悬液离心后分别与1％明胶/硫酸软骨素(100∶1w/w)0.09M NaCI溶液、脂肪细胞生长因子混合均匀，用快速成形技术制备伞房形乳房前体，由0.25％戊二醛水溶液交联2分钟，用旋转生物反应器培养两周，此复合体可直接植于乳房损伤处。
实施例7乳房前体的制备分离脂肪干细胞，体外培养、扩增。将脂肪干细胞悬液离心后与10％胶原/明胶(1∶1w/w)溶液混合均匀，按乳房的形状由快速成形技术制备多管道细胞与基质的三维结构，用0.02％戊二醛水溶液交联3分钟，再用含0.1％肝素水溶液浸泡30分钟，用脉动生物反应器培养两周，此复合体可直接植于乳房损伤处。
实施例8肾脏前体的制备分离肾细胞基因，体外培养、扩增。将肾细胞基因(DNA)与1％明胶/海藻酸钠(100∶1w/w)水溶液、细胞生长因子混合均匀，用细胞组装技术制备直径0.5μm的肾形前体，用0.3％戊二醛水溶液交联1分钟，用脉动生物反应器培养两周。此复合体可直接植于肾损伤处。
实施例9肾脏前体的制备分离肾细胞，体外培养、扩增。将肾细胞悬液离心后分别与重量比30％明胶0.09M NaCI溶液(pH6)混合均匀，由快速成形技术制备多管道肾形三维结构，0.3％戊二醛水溶液交联2秒钟，用含0.1％的透明质酸的水溶液浸泡30分钟，用脉动生物反应器培养后，直接种植于体内。
实施例10胰腺前体的制备分离胰岛细胞，体外培养、扩增。将胰岛细胞悬液离心后分别与重量比20％明胶水溶液、胰岛素混合均匀，用快速成形技术制备的网管状由0.3戊二醛水溶液交联。用脉动生物反应器培养一周后，此复合体可直接植于胰腺、肝脏等部位。
实施例11胰腺前体的制备分离胰岛细胞基因，体外培养、扩增。将胰岛细胞基因与重量比20％明胶/海藻酸钠(1∶2w/w)0.09M NaCI溶液pH7.4、胰岛素混合由快速成形技术制备多管道细胞与明胶/海藻酸钠基质的三维结构，5％乳酸钙溶液交联10分钟，再用0.25％戊二醛生理盐水溶液交联1分钟，用旋转生物反应器培养后种植于体内。
实施例12胰腺前体的制备分离胰岛基因，体外培养、扩增。将胰岛基因与重量比1％明胶/壳聚糖(100∶1w/w)0.09M NaCI·三(羟甲基)氨基甲烷盐酸溶液(pH8.0)、混合均匀，由快速成形技术制备多管道细胞与基质的三维结构，0.1％戊二醛生理盐水溶液交联20秒，用脉动生物反应器培养一周后，可直接种植于体内或体外培养一段时间再植入体内。
实施例13肺前体的制备分离肺上皮细胞、肺细胞，体外培养、扩增。将分离细胞悬液离心后分别与重量比1％明胶/海藻酸钠(1∶1w/w)的0.09M NaCI溶液(pH≈7.4)、细胞生长因子混合均匀，用双喷头细胞组装机制备树枝状肺前体，由戊二醛交联，脉动生物反应器培养。
实施例14肺前体的制备分离肺上皮细胞、肺细胞。将肺上皮细胞、肺细胞悬液离心后分别与重量比10％明胶/壳聚糖(1∶2w/w)溶液(pH6)、细胞生长因子混合均匀，由快速成形技术制备扁园形多管道细胞与基质的三维结构，5％三磷酸钠交联后再用0.1％戊二醛生理盐水溶液交联20秒，用1％的肝素水溶液浸泡30分钟，脉动生物反应器培养2周。
实施例15脾前体的制备分离脾细胞、内皮细胞，体外培养、扩增。将脾细胞、内皮细胞悬液离心后分别与20％的明胶/壳聚糖(pH7.4)溶液混合，用双喷头细胞组装机制备细胞与基质材料的类脾前体，由0.2％戊二醛生理盐水溶液交联，旋转生物反应器体外循环培养，接植于脾损伤处。
权利要求
1.一种带有培养装置的类复杂器官前体，其特征在于所述的类复杂器官前体与一个辅助培养装置相连，所述的类复杂器官前体是由光滑曲面围成的三维结构的类器官腔体，其腔壁是由细胞与基质材料组成，在腔壁上设有多个液体进出通道；所述的辅助培养装置包括设置在腔体内的气囊和腔体外的气囊以及与内外气囊相连的气体压缩装置，在外气囊和内气囊之间填充有细胞培养液。
2.一种带有培养装置的类复杂器官前体，其特征在于所述的类复杂器官前体与一个辅助培养装置相连，所述的类复杂器官前体是由光滑曲面围成的三维结构的类器官腔体，其腔壁是由细胞与基质材料组成，在腔壁上设有液体进口和液体出口，在腔体内设有细胞与基质材料组成的管网状结构；所述的辅助培养装置包括脉动或旋转的生物反应器和一个与该生物反应器相连的液体泵12，所述的类器官前体的液体进出口与所述的生物反应器的液体循环系统相连。
3.按照权利要求2所述的三维结构的类复杂器官前体培养装置，其特征在于在所述的细胞与基质材料组成的管网状结构上设有液体微流道。
4.一种如权利要求1所述的带有培养装置的类复杂器官前体的构建和培养方法，其特征在于该方法包括如下步骤1)建立三维结构的类复杂器官前体模型根据人体器官的结构及功能特点，利用相应的计算机辅助设计软件设计出三维结构的类复杂器官前体模型及成形路径；2)种子细胞与基质材料混和物的制备制备浓度为1～40％的无菌基质材料溶液；购买或提取种子细胞，将所得的不同种类的种子细胞的悬浮液离心分离后分别与含有1～40％的基质材料的溶液均匀混合，制成细胞与基质材料的混合物；所述的基质材料为明胶、胶原、明胶/胶原、胶原/壳聚糖、明胶/壳聚糖或明胶/海藻酸钠，其中所述的胶原/壳聚糖、明胶/壳聚糖或明胶/海藻酸钠的混合溶液中胶原与壳聚糖、明胶与壳聚糖或明胶与海藻酸钠的质量比0.1～100∶1，所述种子细胞占所述基质材料混合溶液的1～90％；所述的基质材料的溶液为水溶液或pH＝6～8的0.09M的氯化钠或0.09M的氯化钠和3-羟甲基氨基甲烷盐酸溶液；所述的基质材料中还可加入1～10％的血清、0.0001～0.1％的细胞生长因子及基因或0.1～100％的细胞外基质混合物、肝素、酸软骨素、透明质酸；3)种子细胞与基质材料混和物的三维受控堆积成形根据步骤1)中模型的成形路径，利用快速成形工艺，采用单喷头或多喷头的复合数字喷射技术，采用离散/堆积工艺，对步骤2)中种子细胞与基质材料的混合物进行离散/堆积成形，形成具有1)中模型所定义的三维结构的类器官前体的雏形，将此三维类器官前体雏形经物理凝聚、化学交联方法进行处理，得到三维类复杂器官前体；4)将类复杂器官前体内外设置气囊，在内外气囊之间注入细胞培养液；将内外气囊与气体压缩装置连接；通过气体压缩装置使内外气囊膨胀或收缩，使复杂器官前体受到三维应力的作用，同时使细胞培养液通过腔体上的液体通道在腔内和腔外之间流动，使各层细胞间在可控三维应力的作用下紧密接触，细胞间建立连接并诱导生长，形成功能组织；同时满足细胞增殖生长及新陈代谢的需要。
5.一种如权利要求2所述的三维结构的类复杂器官前体培养装置构建方法，其特征在于该方法包括如下步骤1)建立三维结构的类复杂器官前体模型根据人体器官的结构及功能特点，利用相应的计算机辅助设计软件设计出三维结构的类复杂器官前体模型及成形路径；2)种子细胞与基质材料混和物的制备制备浓度为1～40％的无菌基质材料溶液；购买或提取种子细胞，将所得的不同种类的种子细胞的悬浮液离心分离后分别与含有1～40％的基质材料的溶液均匀混合，制成细胞与基质材料的混合物；所述的基质材料为明胶、胶原、明胶/胶原、胶原/壳聚糖、明胶/壳聚糖或明胶/海藻酸钠，其中所述的胶原/壳聚糖、明胶/壳聚糖或明胶/海藻酸钠的混合溶液中胶原与壳聚糖、明胶与壳聚糖或明胶与海藻酸钠的质量比0.1～100∶1，所述种子细胞占所述基质材料混合溶液的1～90％；所述的基质材料的溶液为水溶液或pH＝6～8的0.09M的氯化钠或0.09M的氯化钠和3-羟甲基氨基甲烷盐酸溶液；所述的基质材料中还可加入1～10％的血清、0.0001～0.1％的细胞生长因子及基因或0.1～100％的细胞外基质混合物、肝素、硫酸软骨素、透明质酸；3)种子细胞与基质材料混和物的三维受控堆积成形根据步骤1)中模型的成形路径，利用快速成形工艺，采用单喷头或多喷头的复合数字喷射技术，采用离散/堆积工艺，对步骤2)中种子细胞与基质材料的混合物进行离散/堆积成形，形成具有1)中模型所定义的三维结构的类器官前体的雏形，将此三维类器官前体雏形经物理凝聚、化学交联方法进行处理，得到三维类复杂器官前体；4)将类复杂器官前体置于脉动或旋转的生物反应器的密封腔中，使类器官前体的液体进出口与所述的生物反应器的液体循环系统相连；通过脉动或旋转使复杂器官前体受到三维应力的作用，使各层细胞间在可控三维应力的作用下紧密接触，细胞间建立连接并诱导生长，形成功能性器官。
全文摘要
带有培养装置的类复杂器官前体及其构建和培养方法，本发明根据人体器官的结构及功能特点，采用计算机软件设计出三维结构的类复杂器官前体模型及成形路径；然后利用快速成形或其它细胞组装技术将种子细胞与基质材料混和物堆积成三维类器官雏形，再利用辅助培养装置如内外气囊或生物反应器对类器官雏形进行训练和诱导培养，使其向功能性器官转化。本发明模仿复杂器官的结构和功能，实现了三维尺度上类复杂器官前体的构建，并通过可控三维应力场和生物反应器的训练或培养，促使复杂器官中细胞按某一方向排列，提高了器官前体的机械强度，使之具有一些特殊的功能。同时满足了细胞增殖生长及新陈代谢的需要，有类器官前体向天然器官方向的转变。
文档编号C12N5/08GK1673360SQ200510063378
公开日2005年9月28日 申请日期2005年4月11日 优先权日2005年4月11日
发明者颜永年, 王小红, 林峰, 熊卓, 吴任东, 张人佶, 卢清萍 申请人:清华大学