用于鉴定小麦面粉色泽相关基因的pcr体系的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于鉴定或辅助鉴定面粉色泽相关基因的PCR体系及其应用。本发明所提供的PCR体系中的引物对组为如下任一：1）引物对组A、引物对组B和引物对组C；2）引物对组A和引物对组C；3）引物对组C；引物对组A由引物对1（序列1和序列2）、引物对2（序列3和序列4）和引物对3（序列5和序列6）组成；引物对组B由引物对4（序列7和序列8）和引物对5（序列9和序列10）组成；引物对组C由引物对6（序列11和序列12）、引物对7（序列13和序列14）和引物对8（序列15和序列16）组成。这些引物对组各引物间不存在抑制和错配，实现同一温度一次PCR完成一组基因的鉴别，且结果可靠、特异性强。本发明为小麦色泽品质育种提供参考。
【专利说明】用于鉴定小麦面粉色泽相关基因的PCR体系【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于鉴定或辅助鉴定面粉色泽相关基因的PCR体系及其应用，特别涉及一种用于鉴定或辅助鉴定待测新疆冬小麦的面粉色泽相关基因如Psy-AUTaLox-Bl和Ppo-Dl的多重PCR引物对组、试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002]小麦面制食品作为我国人民最重要的主食之一，为我国以面食为主地区的人民提供50-80%以上的能量来源。随着社会生活水平不断提高，人们对小麦面制品品质的要求越来越高，品质育种也越来越受到重视。中国作为小麦最大的生产国和消费国，每年仅用来生产面条的小麦量约占小麦总消费量的40%。而面条、馒头、饺子等我国传统的蒸煮类面制食品，色泽越白越受到我国消费者青睐。因此，在我国传统面制品的感官评价体系中，面制品的色泽占很大的比例，越白评分越高。然而，目前我国主栽小麦品种的面粉平均白度较低(74.8)，不能满足市场和消费者对面粉白度(80.0以上)的要求。在2005年前，大多数面粉厂为满足消费者对面粉白度的要求，向面粉中添加过氧化苯甲酰(ΒΡ0)。但BPO会破坏营养物质且对人类健康构成威胁，在国家最新修订的小麦粉标准中，已明确规定禁止使用ΒΡ0。因此制订育种目标，选育出自然白的小麦具有重要意义。同时，亮黄色的面粉也有一定的消费量，如黄碱面条、乌冬面、意大利面等也很受欢迎。因此，根据不同的加工目的，分别需要选育适合加工高白度或亮黄色面粉的小麦新品种。
[0003]除了环境、增白剂、加工方式和栽培措施等外，小麦面粉及面制品颜色的形成主要受色素类物质和氧化还原酶类等遗传物质的影响。色素类物质主要包括黄色素(Yellowpigment, YP)和棕色素(Brown pigment),黄色素主要由类胡萝卜素(Carotenoid)和类黄酮(Flavonoid)组成,面粉中的氧化酶类主要包括多酹氧化酶(Polyphenol oxidase, ΡΡ0)、脂肪氧化酶(Lipoxygenase, L0X)和过氧化物酶(Peroxidase, POD)。YP 含量、LOX 及 PPO活性对面粉及面制品的色泽有重要影响。YP含量与面团黄度的相关系数高达0.8-0.9 ；L0X可催化多不饱和脂肪酸加氧形成过氧化物，反应所释放的氧自由基进一步氧化色素分子，使面粉变白；ΡΡ0在氧分子的参与下可催化单酚类物质最终变为氧合醌，生成褐色物质，决定面粉及面制品加工和贮存过程中色泽褐变的50-70%。当需要自然白小麦时，应选择含低YP含量基因型、高LOX活性基因型及低PPO活性基因型的小麦品种(系)。
[0004]多重PCR是一种高效、低成本的检测方法，已成为研究的热点。虽然已经报道了数套与小麦面粉色泽基因相关的多重PCR体系，但仅涉及到PPO活性基因的Ppo-Al和Ppo-Dl位点，或PSY活性基因的Psy-Al位点，还未见到检测PSY活性基因的Psy-Bl位点、ZDS活性基因的TaZds-Al和TaZds-Dl位点，以及LOX活性基因TaLox-Bl位点的多重PCR体系的报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定面粉色泽相关基因的PCR体系及其应用，特别涉及一种用于鉴定或辅助鉴定待测新疆冬小麦的面粉色泽相关基因如Psy-Al、TaLox-Bl和Ppo-Dl的多重PCR引物对组、试剂盒及其应用。
[0006]本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定待测小麦拉面品质性状相关基因的多重PCR引物对组为如下al)或a2)或a3)的引物对组:
[0007]a I)由引物对组A、引物对组B和引物对组C组成的引物对组；
[0008]a2 )由引物对组A和引物对C组成的弓丨物对组；
[0009]a3)引物对组C;
[0010]所述面粉色泽相关基因为Psy-Bl基因、TaZds-Al基因、TaZds-Dl基因、Ppo-Al基因、Psy-Al基因、TaLox-Bl基因和Ρρο-Dl基因。
[0011]所述引物对组A由特异于所述Psy-Bl基因的两个引物对，和特异于所述TaZds-Al基因的一个引物对组成；具体的，所述特异于所述Psy-Bl基因的两个引物对分别为序列表中序列I和序列2所示的两条单链DNA组成的引物对1，以及序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的引物对2 ;所述特异于所述TaZds-Al基因的一个引物对为序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成的引物对3 ；
[0012]所述引物对组B由特异于所述TaZds-Dl基因的一个引物对，和特异于所述Ppo-Al基因的一个引物对组成；具体的，所述特异于所述TaZds-Dl基因的一个引物对为序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA组成的引物对4 ;所述特异于所述Ppo-Al基因的一个引物对为序列表中序列9和序列10所示的两条单链DNA组成的引物对5 ；
[0013]所述引物对组C由特异于所述Psy-Al基因的一个引物对、特异于所述TaLox-Bl基因的一个引物对，和特异于所述Ppo-Dl基因的一个引物对组成；具体的，所述特异于所述Psy-Al基因的一个引物对为序列表中序列11和序列12所示的两条单链DNA组成的引物对6 ;所述特异于所述TaLox-Bl基因的一个引物对为序列表中序列13和序列14所示的两条单链DNA组成的引物对7 ;所述特异于所述Ppo-Dl基因的一个引物对为序列表中序列15和序列16所示的两条单链DNA组成的引物对8。
[0014]其中，序列I由21个核苷酸组成；序列2由20个核苷酸组成；序列3由21个核苷酸组成；序列4由20个核苷酸组成；序列5由21个核苷酸组成；序列6由24个核苷酸组成；序列7由21个核苷酸组成；序列8由23个核苷酸组成；序列9由21个核苷酸组成；序列10由20个核苷酸组成；序列11由20个核苷酸组成；序列12由22个核苷酸组成；序列13由23个核苷酸组成；序列14由16个核苷酸组成；序列15由18个核苷酸组成；序列16由20个核苷酸组成。
[0015]本发明中，所述Psy-Bl基因涉及三个等位基因，分别是Psy-Bla、Psy-Blb和Psy-Blc ;所述TaZds-Al基因涉及两个等位基因，分别是TaZds-Ala和TaZds-Alb ;所述TaZds-Dl基因涉及两个等位基因，分别是TaZds-Dla和TaZds-Dlb ;所述Ppo-Al基因涉及两个等位基因，分别是Ppo-Ala和Ppo-Alb ;所述Psy-Al基因涉及三个等位基因，分别是Psy-Ala,Psy-Alb和Psy-Alc ;所述TaLox-Bl基因涉及两个等位基因，分别是TaLox-Bla和TaLox-Blb ;所述Ppo-Dl基因涉及两个等位基因，分别是Ppo-Dla和Ppo-Dlb。
[0016]所述引物对组A中每个引物对的两条引物在PCR反应体系中等量使用，且所述引物对I，所述引物对2和所述引物对3在PCR反应体系中的摩尔比为6:6:5 ;所述引物对组B中每个引物对的两条引物在PCR反应体系中等量使用，且所述引物对4和所述引物对5在PCR反应体系中的摩尔比为12:6 ;所述引物对组C中每个引物对的两条引物在PCR反应体系中等量使用，且所述引物对6、所述引物对7和所述引物对8在PCR反应体系中的摩尔比为 5:10:10。
[0017]具体的，所述引物对组A中，所述引物对I中的序列I和序列2所示的两条DNA单链在所述PCR反应体系中的终浓度均为0.3 μ M ;所述引物对2中的序列3和序列4所不的两条DNA单链在所述PCR反应体系中的终浓度均为0.3 μ M ;所述引物对3中的序列5和序列6所示的两条DNA单链在所述PCR反应体系中的终浓度均为0.25 μ Μ。所述引物对组B中，所述引物对4中的序列7和序列8所不的两条DNA单链在所述PCR反应体系中的终浓度均为0.6 μ M ;所述引物对5中的序列9和序列10所示的两条DNA单链在所述PCR反应体系中的终浓度均为0.3μ M ;所述引物对组C中，所述引物对6中的序列11和序列12所示的两条DNA单链在所述PCR反应体系中的终浓度均为0.25 μ M ;所述引物对7中的序列13和序列14所示的两条DNA单链在所述PCR反应体系中的终浓度均为0.5μ M ;所述引物对8中的序列15和序列16所示的两条DNA单链在所述PCR反应体系中的终浓度均为0.5 μ Μ。
[0018]含有所述引物对组的试剂盒也属于本发明的保护范围。
[0019]所述引物对组的制备方法也属于本发明的保护范围。
[0020]所述引物对组的制备方法，具体可包括将所述引物对组中各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装的步骤。
[0021]所述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。
[0022]所述试剂盒的制备方法，具体可包括如下步骤:将所述引物对组中各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装后,与下述物质中的至少一种包装在同一试剂盒内:PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和4种dNTP。
[0023]下述al)或a2)或a3)的方法也属于本发明的保护范围:
[0024]al)鉴定或辅助鉴定待测小麦含有Psy-Bla、Psy_Blb和Psy-Blc这三种基因中哪一种，含有TaZds-Ala和TaZds-Alb这两种基因中哪一种，含有TaZds-Dla和TaZds-Dlb这两种基因中哪一种，含有Ppo-Ala基因和Ppo-Alb基因这两种基因中哪一种；含有Psy-Ala或Psy-Alc基因还是含有Psy-Alb基因，含有TaLox-Bla和TaLox-Blb这两种基因中哪一种，以及含有Ppo-Dla和Ppo-Dlb这两种基因中哪一种；
[0025]a2)鉴定或辅助鉴定待测小麦含有Psy-Bla、Psy_Blb和Psy-Blc这三种基因中哪一种，以及含有TaZds-Ala和TaZds-Alb这两种基因中哪一种；含有Psy-Ala或Psy-Alc基因还是含有Psy-Alb基因，含有TaLox-Bla和TaLox-Blb这两种基因中哪一种，以及含有Ppo-Dla和Ppo-Dlb这两种基因中哪一种；
[0026]a3)鉴定或辅助鉴定待测小麦含有Psy-Ala或Psy-Alc基因还是含有Psy-Alb基因，含有TaLox-Bla和TaLox-Blb这两种基因中哪一种，以及含有Ρρο-Dla和Ρρο-Dlb这两种基因中哪一种；
[0027]所述al)的方法包括下述(I)和(2)的步骤:
[0028]所述(I)为如下bl)、b2)和 b3):
[0029]bl)以待测小麦的基因组DNA为模板，用所述引物对组中的所述引物对组A进行PCR反应，所述PCR反应的退火温度为59°C ；
[0030]在本发明中，所述PCR反应的程序具体为:95°C预变性5min ;95°C变性45s，59°C退火45s，72°C延伸30s，扩增反应进行35个循环；72°C延伸IOmin ;4°C，保温结束。
[0031]b2)以待测小麦的基因组DNA为模板，用所述引物对组中所述引物对组B进行PCR反应，所述PCR反应的退火温度为62°C ；
[0032]在本发明中，所述PCR反应的程序具体为:95°C预变性5min ;95°C变性30s，62°C退火30s，72°C延伸70s，扩增反应进行34个循环；72°C延伸5min ;4°C，保温结束。
[0033]b3)以待测小麦的基因组DNA为模板，用所述引物对组中所述引物对组C进行PCR反应，所述PCR反应的退火温度为64°C ；
[0034]在本发明中，所述PCR反应的程序具体为:95°C预变性5min ;94°C变性lmin，64°C退火lmin，72°C延伸90s，扩增反应进行36个循环；72°C延伸8min ;4°C，保温结束。
[0035](2)检测步骤(1)得到的PCR产物的大小，按照如下方法根据PCR产物确定所述待测小麦含有Psy-Bla、Psy-Blb和Psy-Blc这三种基因中哪一种，含有TaZds-Ala和TaZds-Alb这两种基因中哪一种，含有TaZds-Dla和TaZds-Dlb这两种基因中哪一种，以及含有Ppo-Ala基因和Ppo-Alb基因这两种基因中哪一种，含有Psy-Ala或Psy-Alc基因还是含有Psy-Alb基因，含有TaLox-Bla和TaLox-Blb这两种基因中哪一种，以及含有Ppo-Dla和Ppo-Dlb这两种基因中哪一种:
[0036]以所述引物对组A进行PCR反应的产物中，若含有大小为151bp的DNA片段，则所述待测小麦含有Psy-Bla基因或候选含有Psy-Bla基因；若含有大小为156bp的DNA片段，则所述待测小麦含有Psy-Blb基因或候选含有Psy-Blb基因；若含有大小为428bp的DNA片段，则所述待测小麦含有Psy-Blc基因或候选含有Psy-Blc基因；若含有大小为183bp的DNA片段，则所述待测小麦含有TaZd s-Ala基因或候选含有TaZds-Ala基因；若含有大小为179bp的DNA片段，则所述待测小麦含有TaZds-Alb基因或候选含有TaZds-Alb基因；
[0037]以所述引物对组B的进行PCR反应的产物中，若不含有大小为981bp的DNA片段，则所述待测小麦含有TaZds-Dla基因或候选含有TaZds-Dla基因；若含有大小为981bp的DNA片段，则所述待测小麦含有TaZds-Dlb基因或候选含有TaZds-Dlb基因；若含有大小为685bp的DNA片段，则所述待测小麦含有Ppo-Ala基因或候选含有Pp0-Ala基因；若含有大小为876bp的DNA片段，则所述待测小麦含有Ppo-Alb基因或候选含有Pp0-Alb基因；
[0038]以所述引物对组C的进行PCR反应的产物中，若含有大小为194bp的DNA片段，则所述待测小麦含有Psy-Ala或Psy-Alc基因或候选含有Psy-Ala或Psy-Alc基因(Psy-Alc基因极少)；若含有大小为231bp的DNA片段，则所述待测小麦含有Psy-Alb基因或候选含有Psy-Alb基因；若不含有大小为791bp的DNA片段，则所述待测小麦含有TaLox-Bla基因或候选含有TaLox-Bla基因；若含有大小为791bp的DNA片段，则所述待测小麦含有TaLox-Blb基因或候选含有TaLox-Blb基因；若含有大小为571bp的DNA片段，则所述待测小麦含有Ppo-Dla基因或候选含有Ρρο-Dla基因；若不含有大小为571bp的DNA片段，则所述待测小麦含有Ppo-Dlb基因或候选含有Ρρο-Dlb基因。
[0039]所述a2)的方法包括下述(3)和(4)的步骤:
[0040]所述(3)为如下Cl)和c2):
[0041]cl)以待测小麦的基因组DNA为模板，用所述引物对组中的所述引物对组A进行PCR反应，所述PCR反应的退火温度为59°C ；
[0042]在本发明中，所述PCR反应的程序具体为:95°C预变性5min ;95°C变性45s，59°C退火45s，72°C延伸30s，扩增反应进行35个循环；72°C延伸IOmin ;4°C，保温结束。
[0043]c2)以待测小麦的基因组DNA为模板，用所述引物对组中所述引物对组C进行PCR反应，所述PCR反应的退火温度为64°C ；
[0044]在本发明中，所述PCR反应的程序具体为:95°C预变性5min ;94°C变性lmin，64°C退火lmin，72°C延伸90s，扩增反应进行36个循环；72°C延伸8min ;4°C，保温结束；
[0045](4)检测步骤(3 )得到的PCR产物的大小，所述检测步骤(3 )得到的PCR产物的大小的方法同步骤(2)。
[0046]所述a3)的方法包括下述 (5)和(6)的步骤:
[0047](5)以待测小麦的基因组DNA为模板，用所述引物对组中所述引物对组C进行PCR反应，所述PCR反应的退火温度为64°C ；
[0048]在本发明中，所述PCR反应的程序具体为:95°C预变性5min ;94°C变性lmin，64°C退火lmin，72°C延伸90s，扩增反应进行36个循环；72°C延伸8min ;4°C，保温结束；
[0049](6)检测步骤(5)得到的PCR产物的大小，所述检测步骤(5)得到的PCR产物的大小的方法同步骤(2)。
[0050]在上述方法中，所述大小为151bp的DNA片段的核苷酸序列具体如序列表中序列17所示；所述大小为156bp的DNA片段的核苷酸序列具体如序列表中序列18所示；所述大小为428bp的DNA片段的核苷酸序列具体如序列表中序列19所示；所述大小为183bp的DNA片段的核苷酸序列具体如序列表中序列20所示；所述大小为179bp的DNA片段的核苷酸序列具体如序列表中序列21所示；所述大小为981bp的DNA片段的核苷酸序列具体如序列表中序列22所示；所述大小为685bp的DNA片段的核苷酸序列具体如序列表中序列23所示；所述大小为876bp的DNA片段的核苷酸序列具体如序列表中序列24所示；所述大小为194bp的DNA片段的核苷酸序列具体如序列表中序列25所示；所述大小为231bp的DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列26所示；所述大小为791bp的DNA片段的核苷酸序列具体如序列表中序列27所示；所述大小为571bp的DNA片段的核苷酸序列具体如序列表中序列28所示。
[0051]在本发明的一个实施例中，用所述引物对组中的所述引物对组A进行PCR反应的反应体系中，作为模板的所述待测小麦的基因组DNA的量为100-200ng，dNTPs的终浓度为200 μ M，DNA聚合酶的量为1.5U。PCR反应程序具体为:95°C预变性5min ;95°C变性45s，59°C退火45s，72°C延伸30s，扩增反应进行35个循环；72°C延伸IOmin ;4°C，保温结束。
[0052]在本发明的一个实施例中，用所述引物对组中的所述引物对组B进行PCR反应的反应体系中，作为模板的所述待测小麦的基因组DNA的量为100-200ng，dNTPs的终浓度为200 μ M0 PCR反应程序具体为:95°C预变性5min ;95°C变性30s，62 °C退火30s，72 °C延伸70s，扩增反应进行34个循环；72°C延伸5min ;4°C，保温结束。
[0053]在本发明的一个实施例中，用所述引物对组中的所述引物对组C进行PCR反应的反应体系中，作为模板的所述待测小麦的基因组DNA的量为100-200ng，dNTPs的终浓度为225 μ M，DNA聚合酶的量为1.5U。PCR反应程序具体为:95°C预变性5min ;94°C变性lmin，64°C退火lmin，72°C延伸90s，扩增反应进行36个循环；72°C延伸8min ;4°C，保温结束。
[0054]本发明的另一个目的是提供一种培育面粉白度提高的小麦品种的方法。
[0055]本发明所提供的培育面粉白度提高的小麦品种的方法，包括采用如下a) -g)中至少一种的小麦作为亲本进行育种的步骤:
[0056]a)含有或候选含有Psy-Blb基因；
[0057]b)含有或候选含有TaZds-Ala基因；
[0058]c)含有或候选含有TaZds-Dlb基因；
[0059]d)含有或候选含有Ppo-Alb基因；
[0060]e)含有或候选含有Psy-Alb基因；
[0061 ] f )含有或候选含有TaLox-Bla基因 ；
[0062]g)含有或候选含有Ppo-Dla基因。
[0063]从众多小麦品种中选择满足a) -g)中至少一项的小麦的方法，即为上述“鉴定或辅助鉴定待测小麦含有Psy-Bla、Psy_Blb和Psy-Blc这三种基因中哪一种，含有TaZds-Ala和TaZds-Alb这两种基因中哪一种，含有TaZds-Dla和TaZds-Dlb这两种基因中哪一种，含有Ppo-Ala基因和Ppo-Alb基因这两种基因中哪一种；含有Psy-Ala或Psy-Alc基因还是含有Psy-Alb基因，含有TaLox-Bla和TaLox-Blb这两种基因中哪一种，以及含有Ppo-Dla和Pp0-Dlb这两种基因中哪一种”的方法。所选择的小麦满足上述a)-g)七项中的项数越多，表示所选择的小麦越适合作为培育面粉白度提高的小麦品种时采用的亲本，并且在同等条件下，对于d)和g)优先选择含有或候选含有Ppo-Alb基因的小麦品种作为亲本。
[0064]在本发明中，所述待测小麦具体为如下小麦品种(系)中的至少一种:宁冬6号、周麦16、周麦17、西农979、西农88、陕354、小偃54、徐州25、西农6028、西农8727和西峰27。
[0065]本发明所提供的引物对组A或引物对组B或引物对组C的各引物对之间不存在相互抑制作用和错配，检测品种(系)的结果可靠、重复性好，成本低。本发明所提供的引物对组A或引物对组B或引物对组C均选用同样的退火温度，实现了相同温度一次PCR完成一组基因的鉴别，且特异性强，检测过程耗时短。本发明提供一种更全面的快速评价小麦色泽品质的方法，并为小麦色泽品质育种提供参考。
【专利附图】
【附图说明】
[0066]图1为实施例1中11份小麦品种(系)面粉色泽相关基因Psy-Bl和TaZds-Al的多重PCR扩增结果。其中，Al和A2 (两次重复)为TaZds-Al基因的基因型单一 PCR检测结果；BI和B2 (两次重复)及B3和B4 (两次重复)为Psy-Bl基因的基因型单一 PCR检测结果；C为多重PCR扩增结果。其中，1:宁冬6号；2:周麦16 ；3:周麦17 ；4:西农979 ；5:西农88 ；6:陕 354 ；7:小偃 54 ；8:徐州 25 ；9:西农 6028 ；10:西农 8727 ；11:西峰 27。
[0067]图2为实施例2中11份小麦品种(系)面粉色泽相关基因TaZds-Dl和Pp0-Al的多重PCR扩增结果。其中，Al和A2 (两次重复)为TaZds-Dl基因的基因型单一 PCR检测结果；B1和B2 (两次重复)为Ppo-Al基因的基因型单一 PCR检测结果；C为多重PCR扩增结果。其中，M:标准分子量DL2000 ；1:宁冬6号；2:周麦16 ；3:周麦17 ；4:西农979 ；5:西农88 ；6:陕 354 ；7:小偃 54 ；8:徐州 25 ；9:西农 6028 ；10:西农 8727 ；11:西峰 27。
[0068]图3为实施例3中11份小麦品种(系)面粉色泽相关基因Psy-Al、TaLox-Bl和Ppo-Dl的多重PCR扩增结果。其中，Al和A2 (两次重复)为Psy-Al基因的基因型单一 PCR检测结果；B1和B2 (两次重复)为Ppo-Dl基因的基因型单一 PCR检测结果；C1和C2 (两次重复)为TaLox-Bl基因的基因型单一 PCR检测结果；D为多重PCR扩增结果。其中，M:标准分子量DL2000 ；1:宁冬6号；2:周麦16 ；3:周麦17 ；4:西农979 ；5:西农88 ；6:陕354 ；7:小偃54 ；8:徐州25 ；9:西农6028 ；10:西农8727 ；11:西峰27。
[0069]图4为对比例I中7份已知基因型小麦品种(系)面粉色泽相关基因Psy-Bl和TaZds-Al的多重PCR扩增结果。其中，1、8:周麦17 ；2:周麦16 ；3:宁冬6号；4:西农88 ；
5:小偃54 ；6:西农979 ；7:西农6028。
[0070]图5为对比例2中7份已知基因型小麦品种(系)面粉色泽相关基因TaZds-Dl和Ppo-Al的多重PCR扩增结果。其中，1、3:宁冬6号；2:西农979 ；4:西农88 ；5:周麦16 ；6:周麦 17 ；7:陕 354 ;8、9:徐州 25。
[0071]图6为对比例3中5份已知基因型小麦品种(系)面粉色泽相关基因Ppo-Al、TaLox-Bl和Ppo-Dl的多重PCR扩增结果。其中，1:宁冬6号；2:陕354 ；3:西峰27 ；4:西农 6028 ；5:西农 979。
【具体实施方式】
[0072]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0073]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0074]实施例1、小麦面粉色泽相关基因Psy-Bl和TaZds-Al的多重PCR检测
[0075]本实施例的多重PCR引物对组由特异于Psy-Bl基因的两个引物对，和特异于TaZds-Al基因的一个引物对组成；其中，所述特异于Psy-Bl基因的两个引物对分别为序列表中序列I和序列2所示的两条单链 DNA组成的引物对1，以及序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的引物对2 ;所述特异于TaZds-Al基因的一个引物对为序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成的引物对3。
[0076]本实施例的多重PCR引物对组可同时检测Psy-Bl和TaZds-Al两个基因位点的5种基因型 Psy-Bla、Psy-Blb、Psy-Blc、TaZds_Ala 和 TaZds-Alb。含有 Psy-Bla 基因的材料，PCR扩增出151bp (序列17)的一个条带；含有Psy-Blb基因的材料，PCR扩增出156bp (序列18)的一个条带；含有Psy-Blc基因的材料，PCR扩增出428bp (序列19)的一个条带；含有TaZds-Ala基因的材料，PCR扩增出183bp (序列20)的一条带；含有TaZds-Alb基因的材料，PCR扩增出179bp (序列21)的一个条带。
[0077]—、小麦基因组的制备
[0078]采用CTAB法对11份小麦品种(系)进行基因组DNA的提取，得到对应于11份小麦品种(系)的基因组DNA，作为拉面色泽相关基因Psy-Bl和TaZds-Al多重PCR扩增的模板。其中，11份小麦品种(系)为宁冬6号、周麦16、周麦17、西农979、西农88、陕354、小偃54、徐州25、西农6028、西农8727和西峰27。这11个小麦品种(系)的Psy-Bl和TaZds-Al基因的基因型详见表1。
[0079]其中，西农979、西农88、陕354、小偃54、徐州25、西农6028和西农8727的Psy-Bl基因的基因型参见“叶石.陕西小麦籽粒PPO活性基因和YP含量基因的等位变异检测和分布分析.西北农林科技大学，2010年，硕士论文”一文；陕354、小偃54、徐州25的TaZds-Al基因的基因型参见“董长海.普通小麦籽粒黄色素含量相关基因的克隆与功能标记开发.河北农业大学，2011年，硕士论文” 一文。
[0080]同时，本发明的发明人对以上11个小麦品种(系)的Psy-Bl和TaZds-Al基因的基因型均经过至少两次各个位点的单一 PCR鉴定，具体如下:
[0081](I)以上11个小麦品种(系)的TaZds-Al基因的基因型检测参见“董长海.普通小麦籽粒黄色素含量相关基因的克隆与功能标记开发.河北农业大学，2011年，硕士论文”一文进行。以小麦基因组DNA为模板，采用YP2A-1标记引物(表2中序列5/序列6)进行单一PCR扩增。结果显示:小麦品种(系)宁冬6号、周麦16、西农88、徐州25、西农8727和西峰27经PCR扩增得到大小为179bp的目的条带，表明其TaZds-Al基因的基因型为TaZds-Alb ；周麦17、西农979、陕354、小偃54和西农6028经PCR扩增得到大小为183bp的目的条带，表明其TaZds-Al基因的基因型为TaZds-Ala。实验重复至少两次，结果一致。见图1中Al和A2。
[0082](2)以上11个小麦品种(系)的Psy-Bl基因的基因型检测参见“叶石.陕西小麦籽粒PPO活性基因和YP含量基因的等位变异检测和分布分析.西北农林科技大学，2010年，硕士论文”一文进行。以小麦基因组DNA为模板，分别采用YP7B-1标记引物(表2中序列I/序列2)、YP7B-2标记引物(表2中序列3/序列4)进行单一 PCR扩增。结果显示:小麦品种(系)宁冬6号、周麦17、西农6028和西峰27采用序列I/序列2进行PCR扩增得到大小为151bp的目的条带，表明其Psy-Bl基因的基因型为Psy-Bla ;小麦品种(系)周麦16、西农979、西农88、小偃54和西农8727采用序列I/序列2进行PCR扩增得到大小为156bp的目的条带，表明其Psy-Bl基因的基因型为Psy-Blb ;小麦品种(系)陕354和徐州25采用序列3/序列4进行PCR扩增得到大小为428bp的目的条带，表明其Psy-Bl基因的基因型为Psy-Blc。实验重复至少两次，结果一致。见图1中BI和B2及B3和B4。
[0083]表111份小麦品种(系)面粉色泽相关基因Psy-Bl和TaZds-Al的基因型
【权利要求】
1.用于鉴定或辅助鉴定待测小麦面粉色泽相关基因的多重PCR引物对组，所述面粉色泽相关基因为Psy-Bl基因、TaZds-Al基因、TaZds-Dl基因、Ppo-Al基因、Psy-Al基因、TaLox-Bl基因和Ppo-Dl基因，其特征在于:所述多重PCR引物对组由引物对组A、引物对组B和引物对组C组成；所述引物对组A由特异于所述Psy-Bl基因的两个引物对，和特异于所述TaZds-Al基因的一个引物对组成；所述引物对组B由特异于所述TaZds-Dl基因的一个引物对，和特异于所述Ppo-Al基因的一个引物对组成；所述引物对组C由特异于所述Psy-Al基因的一个引物对、特异于所述TaLox-Bl基因的一个引物对，和特异于所述Ppo-Dl基因的一个引物对组成； 所述引物对组A中，所述特异于所述Psy-Bl基因的两个引物对分别为序列表中序列I和序列2所示的两条单链DNA组成的引物对1，以及序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的引物对2 ;所述特异于所述TaZds-Al基因的一个引物对为序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成的引物对3 ； 所述引物对组B中，所述特异于所述TaZds-Dl基因的一个引物对为序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA组成的引物对4 ;所述特异于所述Ppo-Al基因的一个引物对为序列表中序列9和序列10所不的两条单链DNA组成的引物对5 ； 所述引物对组C中，所述特异于所述Psy-Al基因的一个引物对为序列表中序列11和序列12所示的两条单链DNA组成的引物对6 ;所述特异于所述TaLox-Bl基因的一个引物对为序列表中序列13和序列14所示的两条单链DNA组成的引物对7 ;所述特异于所述Ppo-Dl基因的一个引物对为序列表中序列15和序列16所不的两条单链DNA组成的引物对8。
2.用于鉴定或辅助鉴定待测小麦面粉色泽相关基因的多重PCR引物对组，为下述I)或 2): O由权利要求1中的所述引物对组A和所述引物对组C组成的引物对组； 2)为权利要求1中的所述引物对组C。
3.根据权利要求1或2所述的引物对组，其特征在于:所述引物对组A中每个引物对的两条引物在PCR反应体系中等量使用，且所述引物对1，所述引物对2和所述引物对3在PCR反应体系中的摩尔比为6:6:5 ;所述特异引物对组B中每个弓丨物对的两条引物在PCR反应体系中等量使用，且所述引物对4和所述引物对5在PCR反应体系中的摩尔比为12:6 ;所述引物对组C中每个引物对的两条引物在PCR反应体系中等量使用，且所述引物对6、所述引物对7和所述引物对8在PCR反应体系中的摩尔比为5:10:10。
4.含有权利要求1-3中任一所述引物对组的试剂盒。
5.权利要求1-3中任一所述引物对组的制备方法，其特征在于:所述制备方法包括将权利要求1-3中任一所述引物对组中各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装的步骤。
6.权利要求4所述试剂盒的制备方法，包括如下步骤:将权利要求1-3中任一所述的引物对组中各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装后，与下述物质中的至少一种包装在同一试剂盒内=PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和4种dNTP。
7.下述al)或a2)或a3)的方法: al)鉴定或辅助鉴定待测小麦含有Psy-Bla、Psy_Blb和Psy-Blc这三种基因中哪一种，含有TaZds-Ala和TaZds-Alb这两种基因中哪一种，含有TaZds-Dla和TaZds-Dlb这两种基因中哪一种，含有Ppo-Ala基因和Ppo-Alb基因这两种基因中哪一种；含有Psy-Ala或Psy-Alc基因还是含有Psy-Alb基因，含有TaLox-Bla和TaLox-Blb这两种基因中哪一种，以及含有Ppo-Dla和Ppo-Dlb这两种基因中哪一种； a2)鉴定或辅助鉴定待测小麦含有Psy-Bla、Psy_Blb和Psy-Blc这三种基因中哪一种，以及含有TaZds-Ala和TaZds-Alb这两种基因中哪一种；含有Psy-Ala或Psy-Alc基因还是含有Psy-Alb基因，含有TaLox-Bla和TaLox-Blb这两种基因中哪一种，以及含有Ppo-Dla和Ppo-Dlb这两种基因中哪一种； a3)鉴定或辅助鉴定待测小麦含有Psy-Ala或Psy-Alc基因还是含有Psy-Alb基因，含有TaLox-Bla和TaLox-Blb这两种基因中哪一种，以及含有Ρρο-Dla和Ρρο-Dlb这两种基因中哪一种； 其特征在于:所述al)的方法包括下述(I)和(2)的步骤: 所述(I)为如下bl)和b2): bl) 以待测小麦的基因组DNA为模板，用权利要求1-3中任一所述引物对组中的所述引物对组A进行PCR反应，所述PCR反应的退火温度为59°C ； b2)以待测小麦的基因组DNA为模板，用权利要求1或3所述引物对组中所述引物对组B进行PCR反应，所述PCR反应的退火温度为62°C ； b3)以待测小麦的基因组DNA为模板，用权利要求1-3中任一所述引物对组中所述引物对组C进行PCR反应，所述PCR反应的退火温度为64°C ； (2)检测步骤(1)得到的PCR产物的大小，按照如下方法根据PCR产物确定所述待测小麦含有Psy-Bla、Psy-Blb和Psy-Blc这三种基因中哪一种，含有TaZds-Ala和TaZds-Alb这两种基因中哪一种，含有TaZds-Dla和TaZds-Dlb这两种基因中哪一种，含有Ppo-Ala基因和Ppo-Alb基因这两种基因中哪一种，含有Psy-Ala或Psy-Alc基因还是含有Psy-Alb基因，含有TaLox-Bla和TaLox-Blb这两种基因中哪一种，以及含有Ρρο-Dla和Ρρο-Dlb这两种基因中哪一种: 以所述引物对组A进行PCR反应的产物中，若含有大小为151bp的DNA片段，则所述待测小麦含有Psy-Bla基因或候选含有Psy-Bla基因；若含有大小为156bp的DNA片段，则所述待测小麦含有Psy-Blb基因或候选含有Psy-Blb基因；若含有大小为428bp的DNA片段，则所述待测小麦含有Psy-Blc基因或候选含有Psy-Blc基因；若含有大小为183bp的DNA片段，则所述待测小麦含有TaZds-Ala基因或候选含有TaZds-Ala基因；若含有大小为179bp的DNA片段，则所述待测小麦含有TaZds-Alb基因或候选含有TaZds-Alb基因； 以所述引物对组B的进行PCR反应的产物中，若不含有大小为981bp的DNA片段，则所述待测小麦含有TaZds-D I a基因或候选含有TaZds-D I a基因；若含有大小为98 Ibp的DNA片段，则所述待测小麦含有TaZds-Dlb基因或候选含有TaZds-Dlb基因；若含有大小为685bp的DNA片段，则所述待测小麦含有Ppo-Ala基因或候选含有Pp0-Ala基因；若含有大小为876bp的DNA片段，则所述待测小麦含有Ppo-Alb基因或候选含有Ppo-Alb基因； 以所述引物对组C的进行PCR反应的产物中，若含有大小为194bp的DNA片段，则所述待测小麦含有Psy-Ala或Psy-Alc基因或候选含有Psy-Ala或Psy-Alc基因；若含有大小为231bp的DNA片段，则所述待测小麦含有Psy-Alb基因或候选含有Psy-Alb基因；若不含有大小为791bp的DNA片段，则所述待测小麦含有TaLox-Bla基因或候选含有TaLox-Bla基因；若含有大小为791bp的DNA片段，则所述待测小麦含有TaLox-Blb基因或候选含有TaLox-Blb基因；若含有大小为571bp的DNA片段，则所述待测小麦含有Pp0-Dla基因或候选含有Ppo-Dla基因；若不含有大小为571bp的DNA片段，则所述待测小麦含有Pp0-Dlb基因或候选含有Ppo-Dlb基因； 所述a2)的方法包括下述(3)和(4)的步骤: 所述(3)为如下Cl)和c2): Cl)以待测小麦的基因组DNA为模板，用权利要求1-3中任一所述引物对组中的所述引物对组A进行PCR反应，所述PCR反应的退火温度为59°C ； c2)以待测小麦的基因组DNA为模板，用权利要求1-3中任一所述引物对组中所述引物对组C进行PCR反应，所述PCR反应的退火温度为64°C ； (4)检测步骤(3)得到的PCR产物的大小，所述检测步骤(3)得到的PCR产物的大小的方法同步骤(2); 所述a3)的方法包括下述(5)和(6)的步骤: (5)以待测小麦的基因组DNA为模板，用所述引物对组中所述引物对组C进行PCR反应，所述PCR反应的退火温度为64°C ； (6)检测步骤(5)得到的PCR产物的大小，所述检测步骤(5)得到的PCR产物的大小的方法同步骤(2)。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于:所述大小为151bp的DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列17所示；所述大小为156bp的DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列18所示；所述大小为428bp的DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列19所示；所述大小为183bp的DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列20所示；所述大小为179bp的DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列21所示；所述大小为981bp的DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列22所示；所述大小为685bp的DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列23所示；所述大小为876bp的DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列24所示；所述大小为194bp的DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列25所示；所述大小为231bp的DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列26所示；所述大小为791bp的DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列27所示；所述大小为571bp的DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列28所示。
9.一种培育面粉白度提高的小麦品种的方法，包括采用通过权利要求7的方法鉴定得到的如下a) -g)中至少一种的小麦作为亲本进行育种的步骤: a)含有或候选含有Psy-Blb基因； b)含有或候选含有TaZds-Ala基因； c)含有或候选含有TaZds-Dlb基因； d)含有或候选含有Ppo-Alb基因； e)含有或候选含有Psy-Alb基因； f)含有或候选含有TaLox-Bla基因； g)含有或候选含有Ppo-Dla基因。
【文档编号】C12Q1/68GK103525937SQ201310509511
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月24日 优先权日:2013年10月24日
【发明者】穆培源, 张晓科, 相吉山, 徐红军, 张钰玉, 桑伟, 韩新年, 聂迎彬, 崔凤娟, 邹波 申请人:新疆农垦科学院