专利名称：抗凋亡基因在用于灌注培养的哺乳动物细胞中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及作为用于改善细胞存活、细胞生理学和蛋白质生产的手 段的抗凋亡基因。具体而言，本发明涉及通过在细胞中表达一种或多种 抗凋亡多肽抑制分泌重组因子VIII ( FVm )的细胞系中的程序性细胞死 亡。
背景技术：
哺乳动物细胞培养是选择用于许多重组蛋白质生产过程的系统，这
是由于其产生具有正确的翻译后修饰的蛋白质的能力。随着制造需要增 加，存在改善过程效率以增加产物得率和质量的强烈兴趣。凋亡细胞死 亡途径的修饰是可用于达到这个目标的一种途径。凋亡已被识别为细胞 培养中的死亡的主要原因，培养损伤的结果，例如营养物和生长因子剥 夺、氧耗尽、毒素积聚和切应力(Cotter和Al-Rubeai, Trends Biotechnol. 13 (4 ): 150-5, 1995; Mastrangelo,等人，Biotechnol. Bioeng. 67 ( 5 ): 544-54, 2000a; Mastrangelo,等人，Biotechnol. Bioeng. 67 ( 5 ): 544-54, 2000b; Mercille和Massie, Cytotechnology 15 ( 1隱3 ) : 117-28, 1994; Sanfeliu和Stephanopoulos, Biotechnol. Bioeng. 64 ( 1 ) : 46-53, 1999; Lengwehasatit和Dickson, Biotechnol. Bioeng. 80 ( 7 ) : 719-30, 2002; Zanghi,等人，Biotechnol. Bioeng, 64 ( 1 ) : 108-19, 1999; Wong,等 人，Biotechnol. Bioeng. 94 ( 2 ) : 373-82, 2006)。凋亡限制最大活细 胞密度，促进毒性代谢物从死细胞中释放，且可能减少异源蛋白质得率 (Chiang和Sisk, Biotechnol. Bioeng. 91 (7) : 779-92, 2005; Figue跳 等人，Biotechnol. Bioeng. 73 ( 3 ) : 211-22, 2001; Figueroa,等人， Metab. Eng. 5 ( 4 ) : 230-45, 2003; Figueroa,等人，Biotechnol. Bioeng. 85(6): 589-600, 2004; Mastrangelo,等人，2000a,b; Mercille和Massie, 1999)。为了解决这些问题，已存在研究抗凋亡基因在小规模、分批和灌注
细胞培养过程中的表达的众多报道(Chiang和Sisk, 2005; Mercille和 Massie, 1999; Kim和Lee ， Biotechnol. Bioeng. 71 ( 3 ) : 184-93， 2000; Mastrangelo,等人，2000a，b; Meents,等人，Biotechnol. Bioeng. 80(6): 706-16， 2002; Tey,等人，J. Biotechnol. 79 ( 2 ) : 147-59, 2000a; Tey, 等人，Biotechnol. Bioeng. 68( 1 ): 31-43， 2000b; Vives，等人，Biotechnol. Prog. 19 ( 1 ) : 84-9, 2003 )。在这些研究中的许多中，目的抗凋亡基 因的表达增加暴露于毒性损伤、营养物剥夺或毒素积聚的培养物的生存 力。这些研究中的几项已探究来自Bcl-2家族的抗凋亡基因的使用
(Singh，等人，Biotech. Bioeng. 52 ( 1 ) : 166-75, 1996; Goswami, 等人，Biotechnol. Bioeng. 62 ( 6 ) : 632-40, 1999; Tey,等人，2000a，b; Figue跳等人，2001; Meents,等人，2002; Arden和Betenbaugh, Trends Biotechnol. 22 (4) : 174-80, 2004; Sung,等人，Biotechnol. Prog. 21
(1 ) : 50-7, 2005; Saue酒ld,等人，Biotechnol. Bioeng. 94 (2): 362-72, 2006)。其他研究已探究了 Bcl-2的功能病毒同源物的使用， 例如腺病毒E1B-19K蛋白质(Merdlle,等人，Biotechnol. Bioeng. 63( 5 ): 516-28, 1999 )、卡波西肉瘤相关病毒KSBcl-2蛋白质和EB病毒BHRF-1 蛋白质(Vives，等人，2003 )。尽管Bcl-2和E1B-19K的序列同源性限 制于某些保守结构域(Chiou,等人，J. Virol. 68 ( 10) : 6553-66, 1994; Sub飄anian,等人，Oncogene 11 ( 11 ) : 2403-9, 1995a),但它们的 功能在抑制起因于腺病毒感染和腺病毒EIA蛋白质表达的凋亡中可互 换(Rao,等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 ( 16) : 7742-6， 1992; Chiou,等人，1994; Subramanian,等人，Cell Growth Differ. 6 ( 2 ): 131-7， 1995b) 。 E1B-19K通过与促凋亡(pro-叩叩totic )蛋白质Bax、 Bak和Bik，以及p53肿瘤抑制蛋白结合来抑制凋亡(Boyd,等人， Oncogene 11(9): 1921-8， 1995; Farrow,等人，Nature 374 (6524): 731-3， 1995; Han，等人，Mol. Cell Biol. 16 ( 10) : 5857-64， 1996a; Han,等人，Genes Dev 10 (4) : 461-77, 1996b; Lomonosova,等人， Oncogene 24( 45 ): 6796-808, 2005 )。在p53诱导的凋亡期间，E1B-19K 结合Bak且抑制Bax-Bak相互作用，从而阻止来自线粒体的促凋亡因子， 细胞色素c和Smac/DIABLO的释放(Henry,等人，Oncogene 21(5): 748-60, 2002)。Aven是在酵母双杂交筛选中鉴定的抗凋亡蛋白质(Chau，等人， Mol. Cell 6 ( 1 ): 31-40, 2000),其抑制胱天蛋白酶激活。外部或内 部凋亡刺激后，细胞色素c从线粒体膜间间隙中释放，在其中它起始 Apaf-l寡聚化，且这种结合召募且激活胱天蛋白酶-9( Saleh,等人，J. Biol. Chem. 274 ( 25 ) : 17941-5,1999; Adams和Cory, Curr. Opin. Cell Biol. 14 ( 6 ) : 715-20, 2002 )。激活的胱天蛋白酶-9进一步激活下游胱天 蛋白酶，从而导致细胞降解(Wolf和Green, J. Biol. Chem. 274 ( 29 ): 20049-52, 1999)。 Aven抑制Apaf-l自締合且因此抑制胱天蛋白酶9 激活(Chau,等人，2000) 。 Aven与Bcl-xL结合，从而在胱天蛋白酶-l 诱导的凋亡后增强Bcl-XL的抗凋亡性质(Chau,等人，2000)。此外， Aven表达增强Bcl-XL在暴露于各种凋亡损伤的中国仓鼠卵巢(CHO) 细胞中的保护作用，所述凋亡损伤包括在失效培养基中培养和血清撤除
(Figueroa,等人，2004)。近来，观察到表达Aven和E1B-19K的CHO 细胞生长至更高的细胞密度，存活更久，且在小规模旋转瓶(spinner flask)中和大规模补料分批培养中产生更高水平的单克隆抗体。容量生 产力中的增加主要是由于由Aven和E1B-19K表达提供的增强的细胞生 存力(Figueroa, 等人,Biotechnol. Bioeng., ■ Epub, 2006)。
用于动物细胞的分批和补料分批处理的可替代培养方式是灌注培 养。在灌注培养过程中，分泌重组蛋白质的细胞保留在生物反应器中， 而新鲜营养培养基持续供应，且条件培养基连同目的蛋白质和代谢副产 物连续取出。与其中代谢副产物的积聚和营养物的耗尽可以限制细胞培 养性能的分批培养不同，灌注培养确立了允许细胞以高密度培养长时间 段的稳态环境(Tolbert,等人，In Vitro 17 ( 10 ) : 885-90, 1981; Butler， 等人，J. Cell Sci. 61: 351-63, 1983; Prior,等人，J. Parenter Sci. Technol. 43 (1) : 15-23, 1989; Ozturk,等人，Biotechnol. Bioeng. 48 ( 3 ): 201-206, 1995; Michaels,等人，European Society for Animal Cell Technology (ESACT) Conference, 1999)。然而，细胞生存力中的减 少仍在灌注培养中观察到，其中凋亡被筌定为死亡的主因，特别是在高 细胞密度和低灌注率条件下(Al-Rubeai,等人，Cytotechnology 9(1-3): 85-97, 1992; Merdlle,等人，1994; Banik和Heath, Appl. Biochem. Biotechnol. 61 (3) : 211-29， 1996; Bierau,等人，J. Biotechnol. 62
(3 ): 195-207,1998; Thrift,等人，European Society for Animal CellTechnology ( ESACT ) Conference, 2003 )。存在通过在分泌重组蛋白 质的细胞中表达抗凋亡蛋白质例如Bcl-2( Bierau,等人，1998; Fassnacht, 等人，Cytotechnology 30: 95-105,1998; Tey,等人，Apoptosis 9 ( 6 ): 843-52， 2004 )和E1B-19K ( Mercille和Massie， Biotechnol. Bioeng. 63
(5 ): 529-43, 1999 )来调查灌注培养中的凋亡抑制的研究。这些报道 证实与亲代细胞培养相比较，表达抗凋亡基因的细胞培养的细胞生存力 中的改善和活细胞密度中的增加。然而，对比生产力的作用已是相矛盾 的。Bierau等人报道在旋转滤器(spin filter)和超声滤器灌注生物反应 器中培养的Bcl-2表达杂交瘤细胞系中比单克隆抗体生产力中的减少。 用在固定床反应器中培养的Bcl-2表达杂交瘤细胞系的另一项研究显示 比单克隆抗体生产力中的增加(Fassnacht,等人，1999)。表达E1B-19K 的NS0骨髓瘤细胞系显示更高的嵌合抗体比生产力(Mercille和Massie, 1999),但表达Bcl-2的另一种NS0细胞系呈现较低的比抗体生产力
(Tey,等人，2004 )。然而，这些先前研究在有限数目的稀释率上且 伴随与灌注率一致改变细胞密度检查细胞生存力和生产力。在一项研究 中的补料策略这样设计，从而使得细胞随着时间推移积聚，并且灌注率
(培养基体积/细胞培养体积/天)相应于增高细胞密度而增加(Tey,等
人，2004)。在另一项研究中，培养以恒定VVD (新鲜培养基体积/有 效细胞悬浮体积/天)进行，而细胞密度在随后阶段时增至平台(Mercille 和Massie, 1999)。
上文描述的增加蛋白质生产力的各种方法已在不同程度上成功。然 而，仍需要开发增加细胞相关产物例如重组蛋白质特别是在大规模商业 生产中的生产的方法。此外，需要开发用于阻止或延迟程序性细胞死亡 的方法。
发明概述
本发明的目的是提供通过在细胞中表达一种或多种抗凋亡多肽用
于阻止或延迟分泌重组Fvm的细胞系中的程序性细胞死亡的方法。该
方法包括在细胞中表达或诱导一种或多种抗凋亡多肽例如Aven或 E1B-19K的表达，从而使得细胞中的程序性细胞死亡被阻止或延迟。
本发明的另 一 个目的是提供增加经由重组细胞的细胞相关产物生 产的方法，所述重组细力包例如分泌重组FVin的细胞。该方法包括在细胞中表达或诱导一种或多种抗凋亡多肽例如Aven或E1B-19K的表达， 从而使得经由细胞的细胞相关产物生产得到增加。
本发明的另 一 目的是提供增加重组细胞例如分泌重组FVIII的细胞 的生产的方法。所述方法包括在细胞中表达或诱导一种或多种抗凋亡多 肽例如Aven或E1B-19K的表达，从而使得重组细胞的生产得到增加。
本发明的另一个目的是提供增加小规^t、分批或灌注细胞培养过程 中的重组细胞例如表达重组FVIII的细胞生产的方法。此外，本发明的 目的是提供大规模生物反应器或商业生产的培养设备中的重组细胞例 如例如表达重组FVIII的细胞生产的方法。本发明的另一个目的是提供 增加大规模灌注细胞培养生物反应器或商业生产的灌注细胞培养设备 中的重组细胞例如例如表达重组FVIII的细胞生产的方法。
本发明的另一个目的是提供用于生产细胞相关产物的重组细胞，例 如分泌重组FVIII的细月包系。重组细月包表达或可以^皮i秀导以表达至少2 种抗凋亡多肽。
^L4描述了 5种E1B-19K细胞系的免疫印迹结果以证实E1B-19K 表达，和6种Aven-E1B-19K细胞系以证实Aven和E1B-19K表达。
^/S描述了在摇瓶悬浮培养中以5 x 10e细胞/mL接种后，与空白 载体和亲代细胞系相比较，E1B-19K细胞系的生存力。每个数据点表示 具有5%或更小的标准差的16细胞计数。
^/C描述了在摇瓶培养中以5 x 1()S细胞/mL接种后，与空白载体 和亲代细胞系相比较，Aven-E1B-19K细胞系的生存力。每个数据点表 示具有5%或更小的标准差的16细胞计数。
^/Z)描述了在摇瓶培养中以5xl()S细胞/mL接种后，E1B-19K和 Aven-E1B-19K细胞系的平均生存力的比4交。Aven-E1B-19K细胞系显示 平均生存力中的最大改善，随后为E1B-19K细胞系，使用空白载体和亲 代细胞系作为对照。
恩Z4描述了在摇瓶培养中以5 x 1()S细胞/mL接种后，在第2天时 胱天蛋白酶-3激活的细胞的百分比。
/^2S描述了在摇瓶培养中以5 x 1()S细胞/mL接种后，在第2天时 膜联蛋白-V阳性细胞(膜联蛋白-V阳性7-AAD阴性)的百分比。活、
9凋亡和死细胞使用膜联蛋白-V和7-AAD染色进行区分。
恩14描述了在摇瓶培养中以5 x 1()S细胞/mL接种后，在第6天时 Aven-E1B-19K细胞系的Aven表达水平和百分比生存力之间的关联。 Aven表达水平由图1A中的免疫印迹进行定量。
^35描述了在摇瓶培养中以5 x 1(^细胞/mL接种后，在第6天时 Aven-E1B-19K和E1B-19K细胞系的E1B-19K表达水平和百分比生存力 之间的关联。Aven和ElB-19K表达水平由图1A中的免疫印迹进行定量。
z^3C描述了 E1B-19K表达水平和百分比生存力之间的关联，类似 于图2B但包括高E1B-19K表达克隆(#6, #11)。
W描述了未处理的、由用于递送毒胡萝卜素的相同体积的DM S 0 处理、或由2 毒胡萝卜素处理的亲代、空白载体、E1B-19K #6和 Aven-E1B-19K#22细胞系。评估了 48小时处理后的生存力。每个值是 使用相同处理的三(3)个细胞培养瓶的平均生存力。
恩4S描述了未处理的、由用于递送毒胡萝卜素的相同体积的DMSO 处理、或由2 |iM毒胡萝卜素处理的亲代、空白载体、E1B-19K #6和 Aven-E1B-19K#22细胞系。评估了 24小时处理后的胱天蛋白酶-3激活 的细胞的百分比。
^5^4描述了当在最佳条件下通过每2天传代培养且就生长率和生 产力监控时的细胞系性能。细胞系的标准化生长率使用亲代细胞系的值 作为100%进行计算。生长率由传代时的活细胞密度进行计算(每2天)。
^5S描述了当在最佳条件下通过每2天传代培养且就生长率和生 产力监控时的细胞系性能。细胞系的标准化比生产力使用亲代细胞系的 值作为100%进行计算。比生产力使用如由生色测定测量的培养物中分 泌的FVIII量进行测定。
^ M描述了在以灌注率中的逐步下降操作的12 -L生物反应器中的 细胞培养时间概况。亲代培养物的活细胞密度(空心正方形)和百分比 生存力(实心三角形)。
^ 65描述了在以灌注率中的逐步下降操作的12 -L生物反应器中的 细胞培养时间概况。亲代培养物的胱天蛋白酶-3激活的细胞的百分比。
恩6C描述了在以灌注率中的逐步下降操作的12-L生物反应器中的 细胞培养时间概况。Aven-E1B-19K培养物的活细胞密度(空心正方形) 和百分比生存力(实心三角形)。恩6D描述了在以灌注率中的逐步下降操作的12-L生物反应器中的 细胞培养时间概况。Aven-E1B-19K培养物的胱天蛋白酶-3激活的细胞 的百分比。
^ 描述了在以灌注率中的逐步下降操作的12-L生物反应器中的 亲代和Aven-E1B-19K培养物之间的比较。比生产力相对于0.5灌注率 的亲代培养的值。
激75描述了在以灌注率中的逐步下降操作的12 - L生物反应器中的 亲代和Aven-E1B-19K培养物之间的比较。比生产力作为关于每种培养 物的起始水平的百分比绘图。
^ 7C描述了在以灌注率中的逐步下降操作的12 -L生物反应器中的 亲代和Aven-E1B-19K培养物之间的比较。生长率相对于0.5灌注率的 亲代值。
^ 描述了在以灌注率中的逐步下降操作的12 - L生物反应器中的 亲代和Aven-E1B-19K培养物之间的比4支。生长率作为起始生长率的百 分比。值是由在各自的灌注率时操作的培养物的每日测量计算的平均值。
/^&4描述了在灌注率比葡萄糖消耗率中的逐步下降期间亲代和 Aven-E1B-19K培养物之间的比较。
描述了在灌注率比谷氨酰胺消耗率中的逐步下降期间亲代 和Aven-E1B-19K培养物之间的比较。
^ SC描述了在灌注率比乳酸生产率中的逐步下降期间亲代和 Aven-E1B-19K培养物之间的比较。
^ SZ)描述了在灌注率比摄氧率作为起始水平的百分比中的逐步 下降期间亲代和Aven-E 1B-19K培养物之间的比较。
^ S￡描述了在生物反应器中的灌注率葡萄糖水平中的逐步下降 期间亲代和Aven-E1B-19K培养物之间的比较。
恩SF描述了在生物反应器中的灌注率谷氨酰胺水平中的逐步下 降期间亲代和Aven-E1B-19K培养物之间的比4交。
恩9描述了以减少的灌注率运行的亲代和Aven-E 1B-19K培养物的 平均细胞直径。
发明详述本发明涉及阻止或延迟重组细胞中的程序性细胞死亡。本发明提供 了通过在细胞中表达一种或多种抗凋亡多肽阻止或延迟重组细胞中的 程序性细胞死亡的方法。本发明还提供了通过在细胞中表达一种或多种 抗凋亡多肽增加重组细胞中的细胞相关产物生产的方法。此外，本发明 提供了用于生产细胞相关产物或细胞疗法的重组细胞。
本发明涉及阻止或延迟分泌重组Fvm的重组细胞中的程序性细月包
死亡。本发明提供了通过在细胞中表达一种或多种抗凋亡多肽例如Aven 或E1B-19K阻止或延迟分泌重组FVIII的重组细胞中的程序性细胞死亡 的方法。本发明还提供了通过在细胞中表达一种或多种抗凋亡多肽例如 Aven或E1B-19K增加分泌重组FVIII的重组细^^的生产的方法。此外，
基:操作技术可以包括标准重组^DNA技术，其中目的靶基因被整 合到哺乳动物基因组或染色体外因子内，以允许整合的基因作为异源蛋 白表达。本申请中描述的技术对于其凋亡在细胞培养过程中发生的哺乳 动物和其他真核细胞系可以是合适的。这些细胞系可以得自诸如美国典 型培养物保藏中心(ATCC)的来源。此种技术对于经历程序性细胞死 亡且可以进行基因操作以产生目的异源蛋白的任何真核细胞可以是合 适的，例如上文列出的那些。
一种或多种抗凋亡多肽在细胞中的表达可以通过本领域技术人员 已知的任何合适的方法来实现。例如，人们可以引入编码一种或多种抗 凋亡多肽的一种或多种多核香酸构建体。此种构建体可以是表达构建 体，且可以包括与编码一种或多种抗凋亡多肽的多核普酸可操作地连接 的至少一种诱导型启动子。
根据本发明，可以表达一种或多种抗凋亡多肽。抗凋亡多肽包括在 细胞中具有抑制或减少凋亡的活性的任何多肽。例如，抗凋亡多肽可以 由异源多核苷酸编码，例如真核细胞或病毒中的基因。在一个实施方案 中，抗凋亡多肽是Aven或E1B-19K。
在重组细胞中，抗凋亡多肽可以单独或与其他组合表达。例如，Aven 可以单独表达或与E1B-19K共表达。 一种或多种表达构建体可以用于表 达2种或更多抗凋亡多肽。
本发明的重组细胞包括本领域技术人员已知且可用的任何合适的 细胞。在一个实施方案中，重组细胞是幼仓鼠肾(BHK)或CHO细胞。此外，本发明的方法可以应用于大规模生物反应器或商业生产的培养设 备中的重組细胞。
本发明还提供了用于生产细胞相关产物的重组细胞。这些细胞表达 或可以被诱导表达一种或多种抗凋亡多肽。在一个实施方案中，这些细
胞表达至少2种抗凋亡多肽。
为了使本发明更好理解，阐述下述实施例。这些实施例仅用于举例 说明的目的，且不应解释为以任何方式限制本发明的范围。本文提及的 所有出版物整体？ I入本文作为参考。
实施例
检查了在被工程改造以表达单独及与Aven基因组合的E1B-19K基 因的BHK生产细胞系中的FVIII表达。细胞系最初在小规模摇瓶培养中 就生存力和产物得率进行分析。随后，表达Aven和ElB-19K的细胞系 的行为在以一系列比灌注率(培养基体积/活细胞/天)运行的灌注培养 中与亲代细胞系进行比较。活细胞密度维持在恒定水平上而比灌注率逐 步减少，从允许营养物快速周转的高速率到其中营养培养基慢得多地补 料和失效培养基一致地更慢地取出的低速率。评估改变灌注率对生存 力、胱天蛋白酶-3激活水平、营养物消耗、代谢物生产和蛋白质生产力 的作用，且将其在亲代细胞系和表达Aven和E1B-19K的细胞系之间进 行比较。
灌注系统可以由用于细月包培养的生物反应器和用于细^W呆留的沉 积槽组成。使用倾斜沉积槽，使活细胞与条件培养基分开且返回生物反 应器(Batt,等人，Biotechnol. Prog. 6 ( 6) : 458-64， 1990; Searles, 等人，Biotechnol. Prog. 10 (2) : 198-206， 1994)。将新鲜培养基持续 供应给生物反应器以维持培养体积。细胞培养物以调整的清除率取出以 维持生物反应器中的细胞密度。此种生物反应器设置使得能够检查比灌 注率和培养物中的凋亡之间的关联，且允许阐述在灌注策略上用抗凋亡 基因的细胞工程改造的任何可能利益。
实施例1.质粒构建
栽体pBUDCE4.1 ( pBUD ) (Invitrogen, Carlsbad， CA )用于Aven (SEQIDNO: 1-2 )和E1B-19K ( SEQ ID NO: 3-6)的組成型表达。该载体设计用于2种基因的同时组成型表达，其中使用pCMV启动子和 pEF-la启动子。使用BamHI位点将Aven基因亚克隆到pBUDCE4.1载 体内且通过CMV启动子进行表达。使用Notl和Xhol位点将E1B-19K 基因亚克隆到相同的pBUDCE4.1载体内且通过EF-1 oc启动子进行表达。 Aven-E1B-19K载体包含由相应启动子表达的每种基因。E1B-19K载体 仅包含由EF-la启动子表达的E1B-19K基因。空白载体指原始 pBUDCE4.1载体。
实施例2.稳定细胞系的产生
表达重组FVIII的BHK-21细胞系(BHK-FVin)用空白载体、 E1B-19K载体、或Aven-E1B-19K载体进行超转染(s叩ertmnsfect), 其中使用LipofectaminePlus (Invkrogen， Carlsbad, CA)，根据制造商 的说明书。稳定细胞系在补加有5%FBS的贴壁培养中在1 mg/mLZeocin (Invitrogen)的选择下产生。分离每种构建体的约100个克隆且就FVIII 表达水平(SEQIDNO: 7)进行分析。选择约25个克隆分离物，且通 过免疫印迹检测Aven的表达和E1B-19K表达。基于Aven和/或E1B-19K 的表达水平和FVIII生产力，使每种构建体的3-6个克隆适应在不存在 Zeocin的情况下的无血清悬浮培养。来自不含抗生素培养的细胞的Aven 和E1B-19K表达通过另一轮免疫印迹证实是稳定的(图1A)。
实施例3.免疫印迹分析
细胞用包含1% NP画40、 120 mM Tris-HCl、 150mMNaCl、 0.2 mM PMSF和1 mMEDTA的裂解緩沖液进行收集。蛋白质浓度使用BCA蛋 白质测定试剂盒(Pierce, Rockford, IL)进行测定。每个泳道装载等量 蛋白质。蛋白质通过凝胶电泳进行分离，转移至硝酸纤维素膜(Bio-Rad， Hercules, CA )，并且用兔抗Aven抗体以1:1000的稀度(Chau,等人， 2000)，和小鼠抗E1B-19K抗体以1:40的稀度(Calbiochem, SanDiego， CA)进行免疫印迹。
实施例4.摇瓶培养分析和凋亡检测
将细胞以5 x 1()S细胞/mL的密度接种在摇瓶中且在维持于37。C和 5。/。C02的培养箱中进行培养。培养物每24小时就生存力、胱天蛋白酶-3激活、膜联蛋白-V结合测定和营养物测量进行检查。细胞计数通过锥
虫蓝排除测定使用Cedex细胞计数设备(Innovatis， Bielefeld,德国) 来进行。胱天蛋白酶-3激活使用GuavaPCA系统(Guava Technologies, Hayward, CA)进行检测。细胞用冷PBS进行洗涤，用Cytofix/Cytoperm 溶液(BD Pharmingen, San Diego, CA)进行固定，且随后在用Guava 系统分析前用PE缀合的单克隆活性胱天蛋白酶-3抗体(BD Pharmingen) 进行染色。对于膜联蛋白-V结合测定，收集细胞，并且使用GuavaNexin 试剂盒进行温育，且根据制造商的说明书(Guava Technologies )在Guava PCA系统上进行分析。谷氨酰胺、谷氨酸、葡萄糖和乳酸的水平通过 YSI分析仪(YSI Life Sciences, Yellow Springs, OH)进行测量。
实施例5. FVIII定量
因子VIII使用生色测定试剂盒(Chromogenix， Milano,意大利) 和凝固测定进行定量。在生色测定中，FVIII量通过因子X至因子Xa 的激活的因子刺激进行定量。反应用过量提供的因子X和因子IXa来进 行。激活的因子Xa切割生色底物，从而导致变色。测量在405 nm处的 吸光度，且FVIII活性针对标准曲线进行测量。凝固测定根据样品加入 FVIII缺乏血浆后血纤蛋白凝块发展的速率来测量FVIII活性。反应通过 激活部分促凝血酶原激酶试剂和CaCl2得到促进。
实施例6.生物反应器评估
2个12-L生物反应器用亲代细胞系或Aven-E1B-19K细胞系以1 x 106细胞/mL的密度进行接种。细胞积聚直至细胞密度达到20 x 106细胞 /mL,随后通过调整细胞弃去率使细胞密度维持恒定在20 x 106细胞/mL。 溶解氧浓度维持在50%空气饱和。pH控制在设定点6.8,且温度维持于 35.5°C。细胞生存力、活细胞密度和细胞直径通过Cedex细胞计数设备 (Innovatis, Bielefeld,德国)进行测量。谷氨酰胺、谷氨酸、葡萄糖 和乳酸的水平通过YSI分析仪(YSI Life Sciences, Yellow Springs, OH) 进行测量。摄氧率计算为假定为100%的在0.5灌注率时的其初始值的百 分比。相对摄氧率由硅酮管和反应器中的氧分压中的差异进行测定，同 时假定传质率和面积(ka)值、反应器体积和平均活细胞密度在培养过 程中保持恒定。
15实施例7.在高细胞密度摇瓶培养中的细胞生存力
将表达E1B-19K的5种细胞系、表达Aven-ElB-19K的6种细胞系、 空白载体细胞系和亲代细胞系以高密度(5 x 1C)S细胞/mL)接种到摇瓶 内。如图1B和1C中所示，表达E1B-19K和Aven-E1B-19K的细胞系的 生存力针对对照亲代和空白载体细胞系进行比较。6天后，最佳表现的 E1B-19K克隆(#6)的生存力为48%,最佳表现的Aven-E1B-19K克隆 (#22)是65%活的。空白载体细胞系的生存力是12%,且亲代细胞系 的那种是10%。观察到每种克隆分离物在不同时间点时的生存力测量中 的一些变异性。与2种对照细胞系相比较，表达抗凋亡基因的细胞系一 般维持更高的生存力。为了证实E1B-19K和Aven-E1B-19K的构建体对 细胞生存力具有作用，测定细胞系的平均细胞生存力和标准差且进行绘 图(图1D)。表达E1B-19K的BHK-FVIII细胞维持在第3天时超过对 照平均18个百分点和在第6天时超过对照23个百分点的生存力。表达 Aven和Aven-E1B-19K的BHK-FVIII细胞系的平均值呈现甚至更高的生 存力水平在第3天时超过对照平均35个百分点，和在第6天时超过 对照36个百分点。相对于对照细胞系，E1B-19K的表达改善细胞生存 力，以及对于以高密度接种的分批细胞培养，Aven和ElB-19K表达的 组合进一步改善细胞存活。
实施例8.摇瓶培养中的凋亡
细胞就胱天蛋白酶-3激活和膜联蛋白-V表面染色进行分析以检查 细胞死亡模式。胱天蛋白酶-3的激活是在凋亡级联中导致"不可恢复点" 的主要事件，这导致其他胱天蛋白酶的激活(Adams, Genes Dev. 17( 20 ): 2481-95, 2003; Danial和Korsmeyer, Cell 116 (2 ) : 205-19, 2004)。 胱天蛋白酶-3激活和膜联蛋白-V测定在第2天时进行，当生存力从66% 变成89%时，并且在大量死细胞变得明显前。如图2A中所示，除一种 细胞系外的所有E1B-19K细胞系(#6、 #8、 #11、 #15)和所有 Aven-E1B-19K细胞系都显示比亲代或空白载体克隆更低的胱天蛋白酶 -3激活细胞百分比。
在凋亡级联中的早期阶段时，磷脂酰丝氨酸从质膜的内部小叶易位 至外部小叶。膜联蛋白-V对于磷脂酰丝氨酸具有高结合亲和力，且因此 与凋亡细胞结合。死细胞中膜完整性的丧失暴露内部小叶中的磷脂酰丝氨酸，从而也允许膜联蛋白-V结合(VanEngeland,等人，Cytometry 31 (1 ): 1-9, 1998)。可透过膜的DNA染色剂例如7-AAD的使用区分 凋亡细胞与死细胞。活、凋亡和死细胞使用膜联蛋白-V和7-AAD染色 进行区分。如图2B中所示，也是7-AAD阴性的膜联蛋白-V阳性细胞的 百分比在E1B-19K细胞系#6、 #8、 #11和#15以及所有Aven-E1B-19K 细胞系中更低。与胱天蛋白酶-3测定一样，在亲代、空白载体和E1B-19K 细胞系#20中发现更高百分比的膜联蛋白-V阳性/7-AAD阴性细胞。 E1B-19K#20细胞系表达极低水平的E1B-19K(图1A),但细胞生存力 中的一些改善在高细胞密度培养中观察到(图1B)。与大多数E1B-19K 克隆相比较，凋亡细胞的百分比在第2天时在大多数Aven-E1B-19K克 隆中更低。在图1D中相对于E1B-19K克隆，凋亡细胞中的这种减少与 Aven-E 1B-19K克隆的生存力中的改善相关联。
实施例9.细胞生存力和表达水平之间的关联
相对表达水平Aven和E1B-19K由使用光密度计测量的免疫印迹条 带强度进行评估(图1A)，且针对高细胞密度摇瓶第6天时的细胞生 存力进行绘图(在图1B和1C中显示)。6种Aven-E1B-19K细胞系就 细胞生存力和Aven表达之间的关联进行;险查。如图3A中所示，在百分 比生存力和Aven的表达水平之间无明显关联。Aven-ElB-19K细胞系弁12 和#22包括高生存力和更高的表达水平，但Aven-E1B-19K克隆W0具有 更低的生存力，尽管Aven表达水平高。百分比生存力和E1B-19K的表 达水平之间的关联显示于图3B和3C中。对于表达中等E1B-19K水平 的这些细胞系，在第6天时E1B-19K表达水平与E1B-19K和 Aven-E1B-19K细胞系的百分比生存力相对成比例(图3B )。发现呈现 高生存力的细胞系表达增加水平的ElB-19K(Aven-ElB#22, Aven-E1B #12, E1B-19K #8)，且具有针对细胞死亡的有限保护的细胞系显示更 低的表达水平。相对于具有低多倍的表达水平的克隆，具有极高表达水 平的2种E1B-19K细胞系(#6和#11)在高密度细胞培养的第6天时不 呈现存活中的任何显著改善(E1B-19K克隆弁6， 48%活的；E1B-19K克 隆#11， 33%活的)，且显示比表达Aven和ElB-19K的一些克隆更〗氐的 生存力(图3C)。实施例10.由毒胡萝卜素诱导的凋亡
哺乳动物细胞中的重组FVIII已显示具有低分泌效率(Kaufman, 等人，J. Biol. Chem. 263 ( 13 ) : 6352-62， 1988 )。发现大多数细胞内 FVni在内质网(ER )中与伴侣蛋白复合，所述伴侣蛋白包括BiP( Domer, 等人，J. Cell. Biol. 105 ( 6 Pt 1 ) : 2665-74,1987)、钙联接蛋白和钙网 蛋白(Pipe,等人，J. Biol. Chem. 273 ( 14 ) : 8537-44, 1998)。毒胡 萝卜素是通过抑制钙摄取到ER内破坏细胞内钙稳态的化学药品
(Lytton,等人，J. Biol. Chem. 266 ( 26 ) : 17067-71, 1991 )。用毒胡 萝卜素处理细胞诱导ER应激和胱天蛋白酶-12激活，从而导致凋亡
(Nakagawa,等人，Nature 403 ( 6765 ) : 98-103, 2000)。
工程改造的细胞系Aven-E1B-19K #22和E1B-19K #6加上空白载体 和亲代细胞系在摇瓶培养中用毒胡萝卜素进行处理。用溶于DMSO的2 juM毒胡萝卜素溶液处理48小时后，对照(空白载体和亲代)显示比对 于E1B-19K存6和Aven-E1B-19K弁22观察到的那些低得多的生存力(图 4A) 。 E1B-19K弁6和Aven-E1B-19K#22的生存力超过85%,且2种对 照生存力低于50%。作为阴性对照，未处理的细胞或用DMSO处理的 那些对于任何细胞系不显示生存力中的显著丧失。为了检查凋亡诱导， 胱天蛋白酶-3激活在毒胡萝卜素处理后24小时进行评估。约20%的对 照细胞系显示胱天蛋白酶-3激活，且小于5%的抗凋亡工程改造细胞系 显示胱天蛋白酶-3激活(图4B)。未处理的和DMSO处理的细胞显示 较低水平的胱天蛋白酶-3活性，从而指出毒胡萝卜素处理负责胱天蛋白 酶-3的刺激(图4B)。在24小时时间点时在生存力中不存在差异，即 使胱天蛋白酶-3活性在对照细胞和表达抗凋亡基因的细胞系之间显示 显著差异。
实施例11.连续传代培养中的表达
细胞系在最佳条件下进行培养以评估细胞性能。选择维持高生长率 且具有可与亲代细胞系比较的比生产力的细胞系。细胞每2天在摇瓶悬 浮培养中进行传代且就生长率和FVIII生产力进行监控。评估了在高细 胞密度分批培养中已维持更高生存力的细胞系(Aven-E1B-19K #12、 Aven國ElB-19K #22、 Aven-E1B-19K #24和E1B-19K #6 )。这些细月包系 的生长率略微减少至亲代的81%-92% (图5A)。发现这些克隆的比生
18产力在亲代的83%-130%之间变动(图5B)。尽管大多数工程改造的克 隆分离物具有比亲代细胞系略微更低的生产力，但在每个细胞的基础 上，Aven-E1B曙19K #22细胞系产生比亲代细胞系多约30%的FVIII。根 据这些小规模研究，由于在对于亲代细胞系高细胞密度培养中的高生存 力、略微减少的生长率(81%)和优良的生产力(130%),选择 Aven-E1B-19K细胞系#22作为最终克隆。
实施例12.关于灌注培养中的生存力和凋亡的共表达 亲代BHK-FVIII细胞系和BHK-FVIII Aven-E1B-19K #22细胞系在 12-L连续灌注生物反应器中进行评估。生物反应器进行接种且细胞积聚 直至达到2 x 107细胞/mL的细胞密度，在这个点上密度通过从系统中清 除细胞得到维持。比灌注率最初设定为0.5 riL/细胞/天，随后以下述顺 序降低0.5、 0.3、 0.2和0.15，随后增回至0.5以观察细胞在以低灌注 率操作后是否能够恢复。每天从生物反应器中取出样品以测定细胞生存 力、凋亡状态、营养物和代谢物水平、以及FVin浓度。其他参数包括 溶解氧、温度和培养基组成保持恒定。
图6A显示活细胞密度和亲代细胞培养的生存力的时间概况。随着 细胞在生物反应器中积聚，细胞密度在前7天内增加。2xlO、田胞/mL 的活细胞密度在第7天时达到，在这个时间点上培养模式从细胞积聚转 变成假稳态。假稳态通过以调整速率从生物反应器中放出培养物来达 到，以使活细胞密度维持在2 x 10"田胞/mL的恒定水平。在以0.5 r|L/ 细胞/天的比灌注率的最初操作期间，生物反应器中的细胞生存力保持相 对恒定在97%。在第17天时，使灌注率减少至0.3，并且亲代细胞系的 生存力在这个时间段期间维持在94%-97%。当灌注率在第23天时再次 降至0.2时，平均生存力在接下来以0.2灌注率的7天操作时间段内减 至91%。当灌注率甚至进一步降至0.15时，生存力相对稳定地减至约 80%。在第37天时，灌注率返回0.5,且在培养时间段结束时细胞生存 力恢复至94%。为了检查是否存在凋亡，每天执行胱天蛋白酶-3激活测 定(图6B)。胱天蛋白酶-3激活细胞的百分比在0.5的最初比灌注率期 间处于基线，且在0.3的灌注率时仅略微更高。当灌注率为0.2时，百 分比增至5%，这对应于平均细胞生存力从94%到91%的减少。在0.15 灌注率时，在细胞生存力稳定下降的相同时间段期间，胱天蛋白酶-3激活细胞的百分比快速增加以显示超过15%的激活。执行膜联蛋白-V染色
且显示与胱天蛋白酶-3激活模式相似的概况。在低灌注率时细胞生存力
中的减少至少部分是由于细胞经历凋亡。
Aven-E1B-19K细胞生长至相似的细胞密度(2 x 107细胞/mL )且实 施灌注率中相似的逐步下降(图6C和6D)。尽管操作条件相似，但 Aven-E 1B-19K培养物的生存力概况与对于亲代细胞观察到的那种相当 不同。Aven-E1B-19K细力包生存力在灌注率的完整范围内保持差不多恒 定在约94%时(图6C)。当灌注率减至0.15 T(L/细胞/天时，未观察到 生存力中的减少，与关于亲代培养物的平均80%相比较，保持恒定在约 94%。因为在计划的0.15最低比灌注率时，细胞生存力对于 Aven/E1B-19K细胞系不减少，所以比灌注率在第27天时从0.15进一步 减至O.l,且以这种最小速率运行4天。即使在这种低灌注率下，细胞 生存力在整个4天时间段内维持在94%的平均值升高。相比之下，由于 来自培养物的活细胞完全丧失的危险，亲代细胞培养物的灌注不可能减
少至低于0.15的水平。培养时间段自始至终也对Aven-E1B-19K培养物 进行凋亡分析，且显示对于大多数培养时间段细胞维持胱天蛋白酶-3激 活的基础水平(图6D)。在胱天蛋白酶-3活性细胞的百分比中存在轻 微但持续的升高，对于以O.IO灌注率操作的Aven-E1B-19K细胞达到2% 的平均值。膜联蛋白-V阳性细胞的百分比在这些灌注率时显示相似的低 激活水平。Aven-E1B-19K细胞系维持高生存力，并且即使当以显示负 面影响亲代细胞系的极低比灌注率培养时也不经历显著水平的凋亡。
实施例13.关于灌注培养中的FVIII比生产力和生长率的共表达 为了比较灌注生物反应器环境中的亲代和Aven-E1B-19K #22细胞 系的生产力，在不同灌注率时测量FVin水平。在图7A中显示的是作为 在0.5 r(L/细胞/天灌注率时亲代对照的FVIII生产力的函数的对于2种细 胞系在每个细胞的基础上的比生产力。图7B中显示的是相对于在0.5 灌注率时每种培养物的100%值，伴随减少的灌注率关于每种培养物的 生产力中的减少。当灌注率渐进地降低时，2种培养物显示生产力中的 下降。在所有比灌注率时，Aven-E1B-19K#22细胞系的生产力更高(参 见图4B)。当生产力作为起始水平的百分比进行检查时(图7B),表 达Aven和E1B-19K的效应是明显的。在灌注率从0.5减至0.3后，亲代
20和Aven-E1B-19K培养物的比生产力从100%降至80%。当比灌注率减至 0.2和0.15时，生产力中的下降对于亲代细胞系显著更急促。亲代生产 力在0.2灌注率时降至其初始值的约23%且在0.1灌注率时降至约10%, 并且Aven-E1B-19K #22细胞系在那个相同时间间隔维持其起始生产力 水平的56°/。和32%。在恢复时间段期间(在结束时的0.5灌注率)，亲 代生产力仅恢复至其最初值的37%,从而反映由新鲜营养物灌注中的严 重减少引起的亲代细胞性能的损伤量。相比之下，Aven-E1B-19K细胞 系能够恢复至初始生产力的80%。
减少比灌注率的另一个结果是生长率的减少。图7C显示作为以0.5 比灌注率运行的亲代培养物的函数绘图的细胞比生长率。图7D显示对 于亲代和Aven-E1B-19K细胞系作为起始生长率的百分比的生长率。 Aven-E 1B-19K细胞系在0.5的灌注率时的比生长率是对于那种相同的灌 注率亲代细胞系的生长率的约一半(图7C)。在灌注率下降时，亲代 细胞的生长率也渐进地下降(图7D)。在灌注率中的每次减少后，亲 代细胞的生长率从100%降至80%、 52%和31%。生长率中的这种减少 是预期的，因为较低的灌注率减少营养物可用性。当灌注率在减至0.15 后增至0.5时，亲代细胞生长率处于其最高值，开始值的134%(图7D)。 相比之下，在灌注率降低时，Aven-E1B-19K细胞系显示非常不同的生 长率模式。在0.3、 0.2、 0.15的较低灌注率时,Aven-E1B-19K培养物的 生长率从100%略微变成109%、 84%和84%,且在0.1的灌注率时快速 降至3P/o(图7D)。在灌注率0.15时，Aven-E1B-19K细胞系的生长率 仍处于其在0.5灌注率时的值的84%,而亲代对照生长率仅为在0.5灌 注率时的值的30%。当灌注率返回0.5时，Aven-E1B-19K细胞系的生长 率的确再一次增加，但它的水平非常接近于其最初生长率而不是对于亲 代对照观察到的那种(图7D)。
实施例14.关于灌注培养中的营养物代谢的共表达 为了检查在不同灌注率时的细胞代谢对营养物和代谢物水平的作 用，每天测量生物反应器中的谷氨酰胺、葡萄糖、溶解氧和乳酸水平。 比消耗和生产率(消耗或生产的营养物量/细胞/天)显示于图8A-8D中。 生物反应器中的葡萄糖和谷氨酰胺水平显示于图8E和8F中。如对于生 长率观察到的，伴随减少的灌注率，亲代细胞系的葡萄糖(图8A)和谷氨酰胺(图8B)消耗率趋于下降，并且随后在0.5恢复时间段期间反 弹至超过初始值的水平。生物反应器中可用的葡萄糖在任一情况下都不
是限制性的(图8E);对于亲代和Aven-E1B-19K细胞系，可用的谷氨 酰胺在较低的灌注率(0.3、 0.2、 0.15和0.1)时低(图8F)。在所有灌 注率中，Aven-E1B-19K细胞系具有比亲代一致更低的比葡萄糖和谷氨 酰胺消耗率(图8A和8B)。比营养物消耗率中的这种减少先前在对于 表达ElB-19K(Mercille和Massie, 1999 )和Bcl-2 ( Bierau,等人，1998) 的细胞系的灌注培养中已观察到。此外，与亲代相比较，在渐进地更低 的灌注率时谷氨酰胺消耗的减少对于Aven-E1B-19K细胞系较不明显。 Aven-E1B-19K细胞系在0.15的灌注率时的谷氨酰胺消耗水平是其在0.5 时的值的24%，而亲代细胞系在0.15时的谷氨酰胺消耗是其在0.5时的 值的10%。在培养结束时灌注率返回至0.5后，亲代细胞系显示葡萄糖 和谷氨酰胺消耗中急速得多的增加。
比乳酸生产率对于Aven-E1B-19K细胞系更低(图8C ),这暗示与 在不同灌注率时的亲代细胞系相比较，在每个细胞的基础上这些细胞产 生更少的糖酵解代谢物以及消耗更少的营养物。对于亲代和 Aven-E1B-19K细胞系，乳酸生产率伴随较低的灌注率减少，但下降不 如对于Aven-E1B-19K细胞系的严重。与葡萄糖和谷氨酰胺消耗趋势不 同，随着灌注率从0.5降至0.15,亲代细胞系的摄氧率从100%增至122%, 且Aven-ElB-19K摄氧率维持相对稳定从92o/o到103% (图8D )。当在 Aven-E1B-19K培养物中灌注率降至0.1时，才聂氧率不增加。
实施例15.细J包大小
图9显示在以不同灌注率运4亍的生物反应器中亲代和 Aven-E1B-19K细胞系的平均细胞直径。亲代细胞系的细胞大小从0.5灌 注率时的17.9 nm分别降至0.3、0.2和0.15灌注率时的17.7、 16.6和15.8 ium。这种减少与在较低的灌注率时减少的生存力关联(图6A)。细胞 体积的丧失或细胞皱缩是凋亡的主要特点之一 (Bortner和Cidlowski, Cell Death Differ. 9 ( 12 ) : 1307-10, 2002 );因此细胞大小中的这种 减少可能涉及凋亡诱导。相比之下，Aven-E1B-19K细胞系显示细胞大 小从0.5灌注率时的18.5 ium分另'J降到0.3、 0.2、 0.15和0.1灌注率时的 17.8、 17.7、 17.5和17.1 |um的4交小减少。当灌注率最初增至0.5时，亲
22代和Aven-E1B-19K细胞系的细胞直径增至起始水平或更高。
E1B-19K的表达使高细胞密度摇瓶培养中的BHK-FVIII细胞延迟经 历凋亡，并且Aven和E1B-19K的共表达相对于亲代和空白载体细胞系 甚至进一步增强保护。因此抗凋亡基因的表达允许在低得多的灌注率时 更有效的存活和蛋白质生产。这些效应提供可以导致更强壮和生产性的 细胞系用于在生物技术中的灌注细胞培养应用的利益。
在上述说明书中提及的所有出版物和专利引入本文作为参考。在不 背离本发明的精神和范围的情况下，本发明描述的方法的各种修饰和改 变对于本领域技术人员将是显而易见的。尽管本发明已结合具体实施方 案进行描述，但应当理解如要求保护的本发明不应不当地限制于此种具 体实施方案。事实上，对于生物化学领域或相关领域技术人员显而易见 的、用于执行本发明的上述方式的各种修饰预期在下述权利要求的范围 内。本领域技术人员将认识到，或能够使用仅仅常规实验确定关于本文 描述的本发明的具体实施方案的许多等同方案。此种等同方案预期由下 述权利要求包含。
权利要求
1. 一种用于阻止或延迟表达重组因子VIII的细胞中的程序性细胞死亡的方法，其包括在所述细胞中表达一种或多种抗凋亡多肽，从而使得所述细胞中的程序性细胞死亡被阻止或延迟。
2. 权利要求1的方法，其中所述一种或多种抗凋亡多肽的表达受至 少 一种诱导型异源启动子控制，所述诱导型异源启动子与编码所述一种 或多种抗凋亡多肽的多核苷酸可操作地连接。
3. 权利要求1的方法，其中所述抗凋亡多肽由真核细胞或病毒中的 基因编码。
4. 权利要求1的方法，其中所述抗凋亡多肽选自Aven和ElB-19K。
5. 权利要求l的方法，其包括表达1种抗凋亡多肽。
6. 权利要求5的方法，其中所述抗凋亡多肽是E1B-19K。
7. 权利要求l的方法，其包括表达至少2种抗凋亡多肽。
8. 权利要求7的方法，其中所述至少2种抗凋亡多肽包括E1B-19K 和Aven。
9. 权利要求l的方法，其中所述重组细胞是哺乳动物细胞。
10. 权利要求9的方法，其中所述重組细胞选自人细胞、鼠细胞和 啮齿类动物细胞。
11. 权利要求10的方法，其中所述重组细胞是CHO细胞。
12. 权利要求10的方法，其中所述重组细胞是BHK细胞。
13. 权利要求1的方法，其中所述重组细胞在小规模、分批或灌注 细胞培养过程中。
14. 权利要求1的方法，其中所述重组细胞在大规模生物反应器或 商业生产的培养设备中。
15. 权利要求14的方法，其中所述重组细胞在大规模灌注细胞培养 生物反应器或商业生产的灌注细胞培养设备中。
16. —种增加经由重组细胞的因子VIII生产的方法，其包括在所述 细胞中表达一种或多种抗凋亡多肽，从而使得经由所述细胞的因子VIII 生产得到增加。
17. 权利要求16的方法，其中所述一种或多种抗凋亡多肽的表达受 至少一种诱导型异源启动子控制，所述诱导型异源启动子与编码所述一 种或多种抗凋亡多肽的多核苷酸可操作地连接。
18. 权利要求16的方法，其中所述抗凋亡多肽由真核细胞或病毒中 的基因编码。
19. 权利要求16的方法，其中所述抗凋亡多肽选自Aven和 E1B-19K。
20. 权利要求16的方法，其包括表达1种抗凋亡多肽。
21. 权利要求20的方法，其中所述抗凋亡多肽是E1B-19K。
22. 权利要求16的方法，其包括表达至少2种抗凋亡多肽。
23. 权利要求22的方法，其中所述至少2种抗凋亡多肽包括 E1B-19K和Aven。
24. 权利要求l的方法，其中所述重组细胞是哺乳动物细胞。
25. 权利要求24的方法，其中所述重组细胞选自人细胞、鼠细胞和 啮齿类动物细胞。
26. 权利要求25的方法，其中所述重组细胞是CHO细胞。
27. 权利要求25的方法，其中所述重组细胞是BHK细胞。
28. 权利要求16的方法，其中所述重组细胞在小规模、分批或灌注 细胞培养过程中。
29. 权利要求16的方法，其中所述重组细胞在大规模生物反应器或 商业生产的培养设备中。
30. 权利要求29的方法，其中所述重组细胞在大规模灌注细胞培养 生物反应器或商业生产的灌注细胞培养设备中。
31. —种增加表达重组因子VIII的细胞生产的方法，其包括在所述 细胞中表达一种或多种抗凋亡多肽，从而使得所述重组细胞的生产得到 增力口。
32. —种用于生产因子VIII的重组细胞，其表达或能够表达至少2 种抗凋亡多肽。
33. 权利要求32的重组细胞，其中所述抗凋亡多肽由真核细胞或病 毒中的基因编码。
34. 权利要求33的重组细胞，其中所述抗凋亡多肽选自Aven和 E1B-19K。
35. 权利要求33的重组细胞，其中所述一种或多种抗凋亡多肽的表 达受至少 一种诱导型异源启动子控制，所述诱导型异源启动子与编码所 述一种或多种抗凋亡多肽的多核苷酸可操作地连接。
36. 权利要求32的重组细胞，其中所述重组细胞是哺乳动物细胞。
37. 权利要求36的重组细胞，其中所述重组细胞选自人细胞、鼠细 胞和啮齿类动物细胞。
38. 权利要求37的重组细胞，其中所述重组细胞是CHO细胞。
39. 权利要求37的重组细胞，其中所述重组细胞是BHK细胞。
40. 权利要求33的重组细胞，其中所述细胞在小规模、分批或灌注 细胞培养过程中生产因子VIII。
41. 权利要求33的重组细胞，其中所述细胞在大规模生物反应器或 商业生产的培养设备中生产因子VIII。
42. 权利要求33的重组细胞，其中所述细胞在大规沖莫灌注细胞培养 生物反应器或商业生产的灌注细胞培养设备中生产因子VIII。
全文摘要
本发明涉及通过在表达重组因子VIII的细胞中表达一种或多种抗凋亡多肽来阻止或延迟程序性细胞死亡，从而使得细胞中的程序性细胞死亡被阻止或延迟。本发明还涉及通过在细胞中表达一种或多种抗凋亡多肽来增加重组因子VIII的生产，从而使得经由细胞的重组因子VIII生产得到增加。用于生产因子VIII的重组细胞。
文档编号C12N5/00GK101473029SQ200780023015
公开日2009年7月1日 申请日期2007年4月21日 优先权日2006年4月21日
发明者J·C·思里夫特, J·E·墨菲, K·B·康斯坦蒂诺夫, M·贝滕鲍夫, T·尼维钱永 申请人:拜尔健康护理有限责任公司;约翰斯霍普金斯大学