专利名称：阿尔茨海默病进展的生物标记的制作方法
技术领域：
本发明总体上涉及组织样品的体外分析检验，更具体地涉及富含 亮氨酸重复序列激酶2 (LRRK2)基因的遗传多态性方面。
背景技术：
图1描述了 LRRK2蛋白的结构和两种常见LRRK2多态性 (T1602S和T2352M )的位置。
具体实施例方式轻度认知损害(MCI)患者逸艮为阿尔茨海默病的3-4年的研究数 据用于调查两种常见LRRK2多态性T1602S和T2352在阿尔茨海默病进 展比例上的作用。为了發逸该研究成果，进一步检测了参与另一个研究的 安慰剂处理的阿尔茨海默患者在6个月时间里这两种常见LRRK2多态性 与其认知能力之间的关联性。发现LRRK2-T1602S与轻度认知损害转变为阿尔茨海默病显著相 关。TT基因型的轻度认知损害患者转变为阿尔茨海默病的风险较大。 LRRK2- T2352也显示了转变为阿尔茨海默病的趋势。CC基因型的轻度认 知损害患者倾向于皿为阿尔茨海默病。类似于APOE-E4等位基因，在 BuChE-K变体存在下，LRRK2騰T1602S与LRRK2画T2352显示出与从轻 度认知损害转变为AD的比例更大的相关性。人LRKK2基因(SEQ ID NO: 1)位于染色体12ql2的PARK8 基因座上。该基因具有多个结构域。LRKK2蛋白(SEQIDNO: 2)是受 体相互作用蛋白质(RIP)激酶。G2019S突变是最常见的LRRK2致病突 变(5-6%的常染色体显性和~ 1。/。的M迟发性病例)。G2019S突变位于 LRKK2基因的激酶结构域。图1示出LRRK2蛋白结构和另外两种常见多态性的位置。重点研 究多态性T1602S和T2352M，因为(1)它们是常见的多态性；(2 )它们 是错义的多态性。较小等位基因频率如下T1602S = 30%; T2352M = 34%。该多态 性引起的氨基酸改变如下T1602S - Thr -> Ser( 1602 A>T); T2352M - Thr -> Met (2352 OT )。才艮据连锁不平衡(LD)分析，T1602S和T2352M 存在强连锁不平衡(D， =0.979)。
14应理解，本发明的某些方面、模式、实施方式、改变和特征在下 述内容中作了不同程度的详细描述，以提供对本发明的本质理解。本发明 的多个方面涉及诊断/治疗诊断方法和试剂盒，其使用本发明的LRRK2突 变来鉴定易患病个体或才艮据药物反应、副作用或最优药物剂量对个体进行 分类。其它方面，本发明提供了用于验证化合物的方法和用于储存及分析 与本发明LRRK2突变相关的数据的计算机系统。因此，下面给出多种说 明这些方面的具体实施方式
。
定乂本文所使用的术语"基因型"指个体同源染色体对基因座上的一 或多个多态性位点处发现的不定型5，-3，核苷酸对序列。在此使用的基因型 包括全基因型和/或亚基因型。
24本文所使用的术语"基因座"指与基因(尤其指LRRK2基因)或 物理或表型特征对应的染色体或DNA分子上的位置。本文所使用的术语"多态性位点"指在群体内的基因座中在该处 发现至少两个可改变序列的位置，其中最频繁出现的有不超过99%的频 率。本文所^:用的向受试者或患者施用药剂或药物包括自体施用和由 他人施用。还应理解所述医学状况治疗或预防的多种才莫式旨在意^^未着"实 质上的"，其包括了全部也包括并非完全的治疗或预防，其中得到了一些 生物或医学相关的结果。
ZJ /^0源储—个实施方式中，LRRK2调节剂可以是LRRK2蛋白(SEQ ID NO: 2)的杂环化合物抑制剂。其它实施方式中，杂环化合物可以是3-[1- (3， 5-二甲基-1H-p比咯 -2-基)画甲基画(Z) -亚基画5-甲氧基-l，3-二氢J引哚隱2画酮；3-[1- (1H 吲咪■2-基 ) -甲- ( Z) -亚基-5-甲氧基-1，3-二氢-丐|哚-2-酮；5-甲氧基-3-[1- (4，5，6，7-四氢-lH-吲哚-2-基)-甲-(Z)-亚基卜1,3-二氢-丐|哚-2-酮；3-[1- (3，5-二甲 基画lH-吡咯画2画基)國甲-(Z)画亚基]-5-曱氧基画2-氧代画2，3-二氢-丐l哚-4画甲酸 甲酯；3画[1画(3，5-二甲基画lH-吡咯-2-基)-甲-(Z)國亚基卜5画曱氧基画2画氧代 -2，3-二氢J引咮-4-甲酸乙酯；3-[1- (3,5-二甲基-lH誦吡咯画2-基)-甲-(Z)画 亚基]-5-甲氧基-2-氧代-2，3-二氢-丐l咮-4-曱酸甲酯；或3-[l-( 3，5-二甲基-lH-吡咯-2-基) 隱甲-(Z)画亚基-5画甲氧基-2画氧代-2，3-二氢画丐1咮-4陽曱酸。或者，杂环化合物可选自可以评估LRRK2调节剂的药理性质，如在药物Pull-Down实验 中进行评估。上述杂环化合物可以在浓度低于20jiM时在Pull-Down实验 中显示出活性。化合物12显示的ICso值约为lnM。[421LRRK2基因(SEQ IDNO: 1)可在从轻度认知损害逸艮为阿尔 茨海默病和从中度阿尔茨海默病进展为更严重的阿尔茨海默病中发挥作 用。因此，LRRK2调节剂可以用来治疗MCI患者或阿尔茨海默病患者， 以减緩从轻度认知损害向阿尔茨海默病的*或从中度阿尔茨海默病向更 严重阿尔茨海默病的*。
差萄^W^^W蒌;C和或在SNP与特定表型间的相关性并不必然地表示或需要该SNP是该表 型的致因。相反，这种关联可能仅仅归因于SNP和那些实际造成给定表型 的遗传因子之间的基因组邻近性，以致SNP和所述遗传因子紧密连锁。换 句话说，SNP可能与"真正的"功能性变体连锁不平衡("LD，，)。在位 于基因组两个不同位置上的等位基因的关联比预期的高时，则存在LD(又 名等位基因关联)。因此SNP由于其与引起特定表型的突变邻近可以做为 有价值的标记。在描述本发明多态性位点时，为了方便以基因的正义链作为参照。 然而，正如熟练的技术人员所理解的，包含基因的核酸分子可能是互补的 双链分子，因而述及正义链上特定位点也指与之互补的反义链上的相应位 点。也就是说，可参照任一链上相同的多态性位点，同时可以将寡核苷酸 设计为和含有多态性位点的靶片段处的任一链特异杂交。因此，本发明还 包括与此处所述基因组变体的正义链互补的多核苷酸单链。
5TV户^蒌定和裙迷[47]4艮多不同技术可以用来鉴定和表征SNP,包括单链构象多态性 (SSCP)分析，变性高效液相色语(DHPLC)进行的异源双链体分析及 直接DNA测序和计算机方法。Shi等人，a,Vi. C&附.47:164-172 ( 2001 )。 公共数据库中有很多序列信息。目前最常用的SNP分型方法包括杂交，引物延伸和切割法。每种 方法都必须和适当的检测系统连接。检测技术包括荧光偏振(Chan等人， (7e"o附e及仏9:492-499 (1999 ))、焦磷酸盐释放的发光检测(焦磷酸测 序)(Ahmadiian等人，^w"/. 5/oc/^附.280:103-10 (2000 ))、基于荧光 共振能量转移(FRET)的切割测试、DHPLC和质谱分析(Shi， C7zVi. C7^附. 47:164-172 (2001);美国专利No.6，300,076 Bl)。美国专利No.6,297，018 和No.6，300,063公开了其它检测和表征SNP的方法。也可用错配检测技术来确定多态性，其包括但不限于用核糖探针 的RNA酶保护方法(Winter等人，/Voc. 7Va仗USA 82:7575 (1985); Meyers等人，Sdewce 230:1242 (1985))和识别核酸错配的 蛋白质，如五.mutS蛋白质(Modrich P, ^朋J ev 25:229-253 (1991))。或者，变体等位基因可以通过单链构象多态性(SSCP)分析 (Orita等人，Ge"o附/cs 5:874-879 ( 1989) ; Humphries等人，出自 Mofecw/ar D/flg7i頻's1 6>/ GWi"/c Diseases, R. Elles编著,第321-340页 (1996 ))或变性梯度凝胶电泳(DGGE ) ( Wartell等人，7V"c/爿"Vfe.
1318:2699-2706( 1990); Sheffield等人，/Voc. TV",/. Sd. USA 86:232-236 (1989))进行鉴定。聚合酶介导的引物延伸法也可用于鉴定多态性。几 种此类方法已经在专利和科学文献中描述，并包括"遗传比特分析"方法 (WO 92/15712 )和连接酶/聚合酶介导的遗传比特分析(美国专利 No.5，679，524 )。相关方法公开在WO 91/02087、WO 90/09455、WO 95/17676 和美国专利No. 5,302,509和5,945,283中。如美国专利No.5,605，798所述， 含有多态性的延伸引物可通it^谱检测。另 一种引物延伸方法是等位基因 特异性PCR (Ruafio等人，iVwc/. J"Vfa. 17:8392 (1989 ) ; Ruafio等 人，7V"c/爿"V/s.及m. 19: 6877-6882 (1991) ; WO 93/22456; Turki等人， / C7,Vi. /wv^^. 95:1635-1641 (1995))。另外，可通过用PCT专利申请 WO 89/10414所述的等位基因特异性引物组同时扩增多个核酸区来研究多 个多态性位点。—个实施方式中，可适用于下述实施例显示的结果，可以在患者 筛查的同时采集患者的血样并使用如PUREGENETMDNA Isolation Kit (D-50K)提取DNA可以用TaqMan⑧技术或Third Wave Technologies Invader Assay才支术进4亍基因型分型。
慕裙芬^的卓无型》费和差厨型为、型本发明提供对个体基因进行单元型分型和/或基因型分型的方法和 组合物。如本文所使用，术语"基因型"和"单元型"指分别包含核苷酸 对或核苷酸的基因型和单元型，所述核苷酸对或核苷酸出现在一或多个此 处描述的多态性位点处，并也可以任选地包括出现在基因上一或多个其它 多态性位点的核苷酸对或核苷酸。其它多态性位点可能是现在已知晓的多 态性位点或随后发现的位点。本发明的基因型分型寡核苷酸可固定于或合成于如微芯片、珠、 玻璃片等的固体表面上。参见例如，WO 98/20020和WO 98/20019。本发明的基因型分型方法可包括从个体中分离包括目的基因或其 片段的两个拷贝的核酸混合物，并确定在这两个拷贝中一或多个多态性位 点上核普酸对的的特征。熟练的技术人员很容易理解，个体中基因的两个 "拷贝"可能是相同的等位基因，或者可能是不同的等位基因。优选的具 体实施方式中，基因型分型方法包括鉴定每个多态性位点处核苷酸对的特 征。通常，核酸混合物分离自从个体获得的生物样品，比如血样或组织样 品。合适的组织样品包括全血、精液、唾液、泪液、尿液、排泄物、汗液、 口腔涂片、皮肤和毛发。在基因型分型和单元型分型方法中，可通过直接从基因或其片段 的一或两个拷贝扩增包含有多态性位点的靼区域，并通过常规手段对扩增 区域测序来确定核苷酸(或核苷酸对)在多态性位点处的特征。个体基因 的基因型或单元型也可通过用含有一个或两个基因拷贝的核酸样品与核酸 阵列或子阵列杂交来确定，例如公开的PCT专利申请WO 95/11995所述。另外，出现在本发明任何多态性位点的等位基因的特征可通过对 与那些目的位点处于连锁不平衡的其它多态性位点进行基因型分型而间接 地鉴定。如上所述，如果在一个位点处存在的特异变体暗示在第二个位点 处另一变体的存在，那么将这两个位点称为是连锁不平衡的。(Stevens JC， 71^/， Z>/ag. 4: 309-317 (1999))。与本发明多态性位点处于连锁不平衡的多态 性位点可位于同一基因区中或其它的基因组区。其它已知的核酸扩增方法可用来扩增靼区域，包括基于转录的扩 增体系(美国专利No.5，130，238; EP 329,822;美国专利No.5，169,766;公 开的PCT专利申请WO 89/06700 )和等温法(Walker等人，iVoc. 7Va汰/4ow/. 《" USA 89:392-396 (1992))。
爭在差西^^弄^^T核夯^与"^差^^染it靶区域中的多态性可在扩增前或后用本领域已知的几种基于杂交的方法之一来检测。通常利用等位基因特异的寡核苷酸进行此类方法。等 位基因特异的寡核苷酸可用作不同的标记探针对，其中该探针对的 一 个成 员显示出完全匹配于耙序列的一个变体，而另外一个成员显示出完全匹配 于不同变体。 一些实施方式中，可使用一套等位基因-特异的寡核苷酸或寡 核苷酸对一次检测一个以上的多态性位点。优选地，当与每个待检测的多
态性位点杂交时，该套成员的互相之间的溶解温度在5。C内，更优选地在 2。C内。另 一发现单元型内容与临床反应之间相关性的方法使用基于g-最小化的最优化算法(其中之一是遗传算法)的预测模型。参见RJudson， "Genetic Algorithms and Their Uses in Chemistry" 出自 j ev/e將/" Owi/7M她'owfl/ Ore/m'5^v，第十章，KB Lipkowitz & DB Boyd编著(VCH Publishers, New York, 1997 )第1-73页。模拟退火(Press等人，7Vw eWm/ 及e"]pey /" C: 爿W 5We",折c Q 附/;"ftVig， 第十章 (Cambridge
University Press, Cambridge, 1992)、神经网络(E Rich & K Knight, v4fftyZ"'fl//"te///)g^"c，第二版，第十章(McGraw-Hill, New York, 1991)、 标准梯度下降法(Press等人，见上文第十章)，也可以使用其它整体或局 部优化方法(见Judson的讨论，见上文)。
摔憂试者差^型4'卓倍费与治^应吝亩^^另一优选实施方式中，目的性状是患者表现出的对一些治疗性治 疗的临床反应，如，对药物靼向的反应或对医学状况治疗性治疗的反应。为推导出治疗的临床反应与基因型或单元型之间的相关性，从接 受治疗的个体群(即下文中的"临床群")所表现的临床反应中获得基因 型或单元型的数据。这一临床数据可通过分析已经在进行的临床试验的结 果和/或通过设计并进行一或多种新临床试验而获得。然后分析这些结果以确定观察到的多态性组间临床反应中任何变 异是否是统计学上显著的。可以用到的统计分析方法描述在L.D. Fisher &
G. vanBelle, 5/os^fl船ft'cs: j M"/itfrfo/0gy 幼e J^a/狄 iSWe"ces
(Wiley-lnterscience， New York, 1993 )。这个分析也包括关于基因中的哪 些多态性位点对表型的差异贡献最为显著的回归计算。—个实施方式中，如首次通过的分析，进行Fishers Exact检验来 评估作为基因型函数的反应。本领域技术人员将理解，进行此归属决定将包括一定程度的不确 定性。因此，将对照组水平的标准偏差用于做出概率确定并且本发明的方 法可应用于很大范围基于概率的基因型組决定。因此，例如但不限于在一 个实施方式中，如果测量到的基因表达产物水平落在任何对照组中值的2.5 标准偏差之内，那么该个体可归属于该基因型组。另一个实施方式中，如 果测量到的基因表达产物水平落在任何对照组中值的2.0标准偏差之内， 那么该个体可以归属于该基因型组。又一个实施方式中，如果测量到的基 因表达产物水平落在任何对照组中值的1.5标准偏差之内，那么该个体可 以归属于该基因型组。再一个实施方式中，如果测量到的基因表达产物水 平落在任何对照组中值的1.0或更低标准偏差之内，那么该个体可以归属 于该基因型组。为了推导治疗的临床反应以及基因型或单元型之间的相关性，需 要获得由接受治疗的个体群(下文中称作"临M")表现出的临床反应 数据。可通过分析已经进行的临床试验的结果获得该临床数据和/或可通过 设计并进行一或多种新临床试验获得临床数据。在不同对照组中如此测定的基因表达产物的标准对照水平将随之 与给定患者基因表达产物的测定水平进行比较。该基因表达产物可以是与 特定基因型组相关的特征mRNA或该基因型组的多肽基因表达产物。随后 将根据测定水平与给定组的对照水平之间的相似程度将患者分类或归属于 特定基因型组。
^ f存餘成贞^",,悉^炎拔"鍵本发明提供用于根据受试者的遗传变异类型将其分类的SNP探 针。本发明的SNP探针是寡核苷酸，其在传统等位基因识别检测中辨别 SNP。某些优选的实施方式中，根据本发明这一方面的寡核苷酸与SNP核 酸的一个等位基因互补，但与该SNP核酸的任何其它等位基因不互补。本 发明这一实施方式的寡核苷酸可以以多种方式在SNP之间进行辨别区分。 例如，在严谨杂交条件下，合适长度的寡核苷酸将与一个SNP杂交而不与 任何其它的SNP杂交。可使用放射性标记或荧光分子标签来标记寡核苷 酸。或者，合适长度的寡核苷酸能用作PCR引物，其中3，末端的核苷酸 与含有SNP的一个等位基因而非任何其它等位基因互补。在此实施方式 中，PCR扩增的有或无决定了该SNP的单元型。对于基于抗体的试剂盒，该试剂盒可以包括，例如(l)第一抗体， 例如附着在固体支持物上，其结合对应于本发明标记的多肽；和任选地， (2)不同的第二抗体，其与该多肽或第一抗体结合且缀合有可检测标记。对于基于寡核苷酸的试剂盒，该试剂盒可以包括，例如(l)寡核 苦酸，例如带有可检测标记的寡核苷酸，其与本发明标记所对应的多肽的 编码核酸序列杂交；或(2)用于扩增对应于本发明标记的核酸分子的引物 对。试剂盒也可以包括，例如緩冲剂、防腐剂或蛋白质稳定剂。试剂 盒还可以包括用于检测可检测标记的必需组分，例如酶或底物。该试剂盒 也可以含有一个对照样品或一系列对照样品，其能够进行测定并与检测样
品相比较。试剂盒中的每个组分可以封闭在单个容器中且所有多个容器可
23以和用于解释使用该试剂盒进行检测的结果的说明书一起放在单个包装 内。—方面，本发明包括一或多个分离的多核苷酸。本发明还包括其 等位变体，也就是该分离多核苷酸的天然发生的可变形式，其编码与该多 核苷酸所编码的那些多肽相同、同源或相关的突变多肽。或者，非天然发 生的变体可由由本领域已知的诱变技术或直接合成技术生产。因此，能够在低严谨性下与编码本发明突变多肽的核酸序列杂交 的核酸序列也认为属于本发明的范围。标准分子生物克隆教科书中充分表 4i了才示〉焦严i堇小生^f^。参见例如Mofecw/tff C7ow/"g爿Za6orato/^ Afaw a/ 第二版，Sambrook， Fritsch， & Maniatis编著(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 ) ; C7o肌'"g， Fio/M舰s /朋J //， D.TV. Glover编
著(1985 ); O"，"c/eo舰5^te&， M.J. Gait编著(1984); W"c/"c /0;6"V//zWo"， B.D. Hames & S.J. Higgins编著(1984 )。
差^衷这水"f时《在可能以多种方式进行生物样品(例如个体组织或体液)中基因表 达产物的水平的测定。术语"生物样品"旨在包括分离自受试者的组织、 细胞、生物液体和其分离物，以及存在于受试者中的组织、细胞和液体。 许多表达检测方法使用分离的RNA。对于体外方法，可以使用任何不针对 mRNA分离进行选择的RNA分离技术从细胞中纯化RNA。参见例如 Ausubd等人编著,C"/r. /VW. Afo/.祝o/. (John Wiley & Sons, New York, 1987-1999)。
24[99]一个实施方式中，确定耙基因的mRNA表达产物水平。测定特定 mRNA水平的方法是本领域众所周知的且包括Northern印迹分析、反转 录PCR和实时定量PCR或通过与寡核苷酸阵列或孩t阵列杂交。其它更多 优选实施方式中，可通过测定体液或组织样品(包括但不限于血液或血清) 中基因表达产物蛋白质或多肽的水平进行表达水平的测定。可以使用本领 域技术人员公知的技术容易地加工大量组织样品，例如，美国专利No. 4,843,155的一步RNA分离方法。测定样品中与本发明标记相应的mRNA水平的替代方法包括核 酸扩增的方法，例如通过RT-PCR (美国专利No. 4,683,202提出的实验性 实施方式)；连接酶链式反应(Barany等人，iVoc. A^/. Jaw/. USA 88:189-193 (1991 ));自主持续序列复制(Guatdli等人，iVoc. iVfl汉Jaw/. S". USA 87: 1874-1878 (1990 ));转录扩增体系(Kwoh等人，/Voc. TV"//.
USA 86: 1173-1177 (1989 ) ) ; Q-Beta复制酶(Lizardi等人， 7^朋/柳6: 1197 (1988 ));滚环式复制(美国专利No. 5,854,033 ); 或任何其它核酸扩增方法，接着使用本领域技术人员公知的技术检测扩增 的分子。当此类核酸分子以很低数目存在时，这些检测方案特别适用于检测核酸分子。如本文所使用的"扩增引物，，定义为可以与基因(分别为正
链和负链，或反之亦然)的5，或3，区退火且在两者间含有短的区域的核酸 分子对。通常，扩增引物长度为约10-30个核苷酸并位于长度大约50-200 核苷酸区域的两侧。实时定量PCR (RT-PCR)是评估基因(例如本发明的基因，例 如含有目的SNP和多态性的那些)表达水平的一种方法。RT-PCR检测法 利用RNA反转录酶催化从RNA链(包括mRNA链)合成DNA链。可特 异性检测并定量产生的DNA并且这一方法可用于确定特定物种mRNA的 水平。如此4故的一种方法是TAQMAN⑧(PE Applied Biosystems， Foster City, Calif, USA)以及在PCR反应期间利用AMPLITAQ GOLDTM DNA 聚合酶的5，核酸酶活性来切割特异形式的探针。这被称作TAQMAN1, 针。参见Luthra等人，j附./ i^说o/. 153: 63-68 (1998 ) ; Kuimelis等人， 7Vmc/. ^"Vfe Ser. 37: 255-256( 1997 );和Mullah等人，7Vwc/及化
26 (4) :1026-1031 ( 1998))。反应期间，探针的切割将报告染料和淬灭 染料分离，导致报告荧光的增加。通过监控报告染料荧光的增加直接检测 PCR产物的累积。Heid等人，Genome Res. 6 (6) :986-994 (1996))。 核酸耙标的起始拷贝数越高，越快地观察到荧光的显著增加。参见Gibson, Heid & Williams等人，Genome Res. 6: 995-1001 (1996 )。测量细胞转录状态的其他技术产生有限复杂度的限制性片段库 用于电泳分析，如组合限制性双酶切和分型引物的方法(见例如EP 0 534858 Al)，或具有最接近于指定mRNA末端位点的选择限制性片段的方 法(见例如Prashar & Weissman， /Voc. TV"拔Jc^/. 5W. fASJ 93(2) 659-663 (1996))。可以通过可检测标记的或可以随后标记的探针检测本发明基因 编码的蛋白质的表达。对于探针或抗体而言的术语"标记的"旨在包括通
以及通过与直接标记的另一试剂反应而间接标记探针或抗体。间接标记的 实例包括使用荧光标记的二抗检测一抗以及用生物素末端标记的DNA探 针以便其可以用荧光标记的链霉亲和素进行检测。通常，探针是识别所表 达蛋白质的抗体。可以使用多种形式来确定样品是否含有结合给定抗体的 耙蛋白质。用于检测本发明的靶多肽的免疫检测法包括但不限于，例如， 点印迹、Western印迹、蛋白质芯片、竟争性和非竟争性蛋白质结合检测 法、酶联免疫吸附检测法(ELISA)、免疫组化、荧光活化细胞分选(FACS ) 和其它常用的及科学和专利文献中广泛描述的方法，以及许多商业使用的 方法 熟练技术人员可以很容易利用已知的蛋白质/抗体检测方法确定细胞 是否表达本发明的标记和该特定多tt达产物在血液或其身体组织中的相 对浓度。可以使用本领域技术人员公知的技术分离来自个体的蛋白质。所 用的蛋白质分离方法可以是例3口 Harlow & Lane, Jwft'6oWd'爿IflAomto^ ikffl聰fl/ ( Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988))中所述的那些。此夕卜，可以使用开发用于生产"嵌合抗体，，的技术(参见Morrison 等人，Proc. Natl. Acad. Sci USA 81 : 6851-6855 (1984); Neuberger等人， Nature 312: 604-608( 1984 );和Takeda等人，Nature 314: 452-454( 1985 ))， 该嵌合抗体通过剪接具有合适抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与具有合 适生物学活性的人抗体分子基因而产生。嵌合抗体是这样的分子，其中不 同部分来源于不同的动物物种，例如具有鼠单抗来源的可变区或高变区和 人免疫球蛋白恒定区的那些抗体。可以在诸如Western印迹或免疫荧光技术等方法中使用抗体或抗 体片段来检测表达的蛋白质。此种应用中，通常优选将抗体或蛋白质固定 到固体支持物上。适合的固相支持物或载体包括任何能结合抗原或抗体的 支持物。熟知的支持物或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡 聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和改良的纤维素、，聚丙烯酰胺、辉长岩和磁铁 石。通过构建微阵列可以进行蛋白质的全基因组(即蛋白质组)监控， 其中结合位点包括，对多种由细胞基因组编码的蛋白质物质特异的固定抗 体，优选单克隆抗体。优选地，对于编码蛋白质的大部分，或至少对于与 检测或确认目的生物网络模型相关的蛋白质存在抗体。如上所指出，用于 制造单克隆抗体的方法是众所周知的。参见例如Harlow & Lane, J丄ff6om,， Ato柳/ ( Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1988 ))。优选的实施方式中，针对基于 细胞的基因组序列设计的合成肽片段产生单克隆抗体。用该抗体阵列，来 自细胞的蛋白质与该阵列接触并且用本领域已知的检测法测定其结合。
/农^^W: 二举凝應^泳 二维凝胶电泳是本领域众所周知的且通常包括沿第一方向的等 电聚焦接着是沿第二方向的SDS-PAGE电泳。参见例如Hames等人，Ge/ ^7e"ra/^res/s" /Vote,'"*1: iVcr"/cfl/々/ /Y flc/r (IRL Press, New York, 1990) ; Shevchenko等人，iV",/.Sc/. USA 93: 14440-14445 (1996) ; Sagliocco等人，12: 1519-1533 (1996)和Lander, 274: 536-539 (1996 )。
颠斜力廣粉浙可以使用质镨分析技术(MS)确定靶多肽的特征以及表达水平。 基于MS的分析方法学可用于分析分离的靶多肽以及分析生物样品中的靶 多肽。用于分析靶多肽的MS形式包括电离(I)技术，例如但不限于基质 辅助激光解吸(MALDI)、连续或乐Pt电喷射电离(ESI)和相关方法， 例如离子喷射或热喷射，以及massive cluster impact (MCI)。该离子源 可以与检测形式相匹配，包括线性或非线性反射式飞行时间(TOF)、单极或多极、单或多个扇形磁场、傅里叶变换离子回旋共振(FTICR)、离 子阱及其组合，例如离子阱/TOF。对于电离，可以使用多种基质/波长组 合(例如基质辅助激光解吸(MALDI))或溶剂组合(例如ESI)。对于质i普(MS)分析，可以将靶多肽溶解在适合的溶液或试剂 系统。溶液或试剂系统的选择(例如有机或无机溶剂)将取决于靶多肽的 性质和所执行的MS类型，以及基于本领域众所周知的方法。例如对于 MALDI参见Vorm等人，Oie附.61 : 3281 (1994);和对于ESI见 Valaskovic等人，爿w"/. C&附.67: 3802 (1995 )。肽的MS也描述于例如 PCT国际申请No. WO 93/24834和美国专利No. 5，792，664。选择使气化过 程中引入的能量分解靶多肽的风险最小化的溶剂。例如，通过在基质中包 埋样品可以实现靼多肽分解风险的降低。适合的基质可以是有机化合物，
例如糖(例如戊糖或己糖)或多糖例如纤维素。该化合物热分解为C02和
H20以便不形成可以导致化学反应的残留物。基质也可以是无机化合物， 例如铵的硝酸盐，其分解后基本上无残留。这些和其它溶剂的使用是本领 域技术人员已知的。参见例如美国专利No. 5,062,935。电喷雾MS描述于 Fenn等人，/ C/^附.88: 4451-4459 (1984 );和PCT申请No. WO 90/14148;且当前的应用在综述中进行总结。参见Smith等人，Jw"/. C7^附. 62:882-89 (1990);和Ardrey， 5^"r仍o /^ 4: 10-18 (1992)。
U8由MS确定的靶多肽的质量可以与相应的已知多肽质量相比较。 例如，当靶多肽是突变蛋白质时，相应的已知多肽可以是相应的非突变蛋 白质，例如野生型蛋白质。用ESI确定飞摩尔量样品的分子量是4艮精确的， 因为存在多个离子峰，其全部可以用于质量计算。例如已经使用ESI MS (Valaskovic等人，Science 273: 1199-1202 (1996 ))和MALDI MS ( Li 等人，J. Am. Chem. Soc, 118: 1662-1663 (1996 ))检测了阿托摩尔水平的 蛋白质。
^W勿邀^席吸,i:d/)将对537位受试者的3-4年研究的逸艮为阿尔茨海默病数据用于 调查两种LRRK2常见多态性对可能进展为AD的影响。使用艾斯能 (InDDex)延迟,皮诊断为阿尔茨海默病的研究是安慰剂对照的、4年纵向 研究以评价Exelon⑥在轻度认知损害(MCI)的个体中的效力。对患有轻 度认知损害并给予多种剂量的Exelon ( rivastigmine )或给予安慰剂的患 者进行临床试验以及对于他们随后转变成阿尔茨海默病(AD)的患者进行 临床试验。FeldmanH等人，Neurology 62: 1199-1201 (2004)。该试验具 有任选的DNA收集组分。为了证实这些发现，进一步在6个月的时间内，于参加IDEAL 研究的178名安慰剂处理的AD患者中检测这一常见LRRK2多态性和认 知能力间的相关性。在IDEAL (AD )研究中，LRRK2多态性T1602S显 示与在MCI研究中观察到的相关性相同的倾向。具有T1602S TT基因型 的阿尔茨海默病患者在6个月中其认知能力趋于更快速衰退，尤其是在 BuChE-K变体存在时。此外，在InDDeX研究中，T2352的CC基因型(或Thr/Thr) 显示出与从轻度认知损害转变成阿尔茨海默病的较高比例的相关性倾向。 (表2)
表2、从MCI转变为AD的比例与T2352M基因型相关 LRRK2基因型(T2352M)
Thr/Thr (n=188)
21.81 78.19
女Cox比例风险。模型包括作为共变量的年龄、性别和教育年限。 **对转变时间的Log-rank检验。在具有重新测序确认结果的患者篩选中发现对于帕金森病 (PD) : 483位患者中有6位携带G2019S突变(1.24%)。对于有痴呆 的帕金森病(PDD) , 391位患者中有1位携带G2019S突变(0.26%)。 对于阿尔茨海默病(AD) : 373位患者中没有一位携带G2019S突变。对 于轻度认知损害(MCI) : 448位患者中没有一位携带G2019S突变。对 于肌萎缩性侧索硬化症(ALS); 483位患者中没有一位携带G2019S突变。结论是大约1.24%|^迟发性病例携带突变，其与文献中报道 的频率类似。只有约0.26%的PDD病例携带G2019S突变。这一突变在 AD、 MCI和ALS中并不常见。突变可能与运动功能的较快衰退相关。
等同方案本发明的一或多个实施方式的细节在上面所附的说明书中列出。
发明，但现在描述了优选的方法和材料。本发明的其它特征、目的和优点 将从说明书和权利要求中显而易见。在说明书和所附权利要求中，除非上 下文明确另行规定，否则单数形式包括复数对象。除非另有限定，本文使
本文引用的所有参考通过整体引用在此作为参考，并且为了所有的目的以 相同的程度在此引入，就如同每一单个出版物、专利或专利申请为了所有 目的具体及单独地指示为以其整体引入作为参考一样。 [138]本发明不限于这一申请中所述的具体实施方式
，这些实施方式仅作为本发明个别方面的举例说明。如本领域技术人员显而易见的是，可以对这 一发明进行许多修改和改变而不背离其精神和范围。根据前面的说明，除 了本文列举的那些以外，本发明范围内的功能性等效方法和工具对于本领 域技术人员而言也是显而易见的。该修改和改变旨在落入所附权利要求的 范围内。本发明只被所附权利要求的用语，以及与该权利要求所主张的全 部范围等同体所限定。
3权利要求
1. LRRK2调节剂在制备用于治疗阿尔茨海默病选定患者群体的药物中的用途，其中基于富含亮氨酸重复序列激酶2(LRK2)基因的多态性选择患者群体，该LRK2基因的多态性是从轻度认知损害(MCI)进展为阿尔茨海默病的指示。
2. 权利要求l的用途，其中该LRRK2调节剂是杂环化合物。
3. 权利要求l的用途，其中阿尔茨海默病的治疗减緩了患者从轻度认 知损害(MCI)到阿尔茨海默病的选艮。
4. 权利要求l的用途，其中阿尔茨海默病的治疗减緩了患者从中度阿 尔茨海默病到重度阿尔茨海默病的 。
5. 权利要求1的用途，其中LRRK2基因的多态性选自T1602S和 T2352。
6. 权利要求5的用途，其中患者的T1602S基因座具有TT( Thr/Thr)基因型。
7. 权利要求5的用途，其中患者的T2352基因座具有CC (Thr/Thr) 基因型。
8. —种预测受试者阿尔茨海默病选艮的方法，包括步骤a) 从受试者获得组织样品；b) 测定样品中指示受试者从轻度i/v知损害(MCI)进展为阿尔茨海 默病的遗传多态性的存在；其中受试者中存在的指示受试者从轻度认知损 害逸艮为阿尔茨海默病的遗传多态性预示该受试者处于从轻度认知损害向 阿尔茨海默病*的增加的风险中。
9. 权利要求8的方法，其中组织样品是血样。
10. 权利要求8的方法，其中该遗传多态性选自T1602S和T2352。
11. 权利要求8的方法，还包括步骤c )如果预测到该受试者具有指示受试者从轻度i人知损害i^艮为阿尔茨 海默病的遗传多态性，则向该受试者施用LRRK2调节剂以减緩从轻度^人知损害向阿尔茨海默病的进展或从中度阿尔茨海默病向重度阿尔茨海默病 的錄。
全文摘要
遗传多态性LRRK2(富含亮氨酸重复序列激酶2)-T1602S与轻度认知损害(MCI)转变为阿尔茨海默病(AD)显著相关，同时TT基因型的患者进展为阿尔茨海默病的风险较大。LRRK2-T2352也显示了转变为阿尔茨海默病的趋势，同时CC基因型的患者有进展为阿尔茨海默病的趋势。类似于APOE-E4等位基因，在BuChE-K变体存在时，LRRK2-T1602S与LRRK2-T2352显示出与从轻度认知损害转变为阿尔茨海默病的比例更大的相关性。在另一项对安慰剂处理的阿尔茨海默患者的研究中，LRRK2-T1602S与LRRK2-T2352显示出相关性相同的趋势。LRRK2-T1602S的TT基因型阿尔茨海默病患者或LRRK2-T2352的CC基因型患者认知能力在6个多月里下降更迅速，尤其在BuChE-K变体存在时。这两种常见的LRRK2多态性与阿尔茨海默病进展的相关性显示出LRRK2可能在阿尔茨海默病发病，尤其是疾病进展中发挥作用，并显示出LRRK2多态性可用作这一进展的生物标记。
文档编号C12Q1/68GK101473044SQ200780022902
公开日2009年7月1日 申请日期2007年6月18日 优先权日2006年6月20日
发明者B·戈麦斯-曼西利亚, G·比尔贝, G·罗夫利, J·迈耶, R·R·库恩, Y·何 申请人:诺瓦提斯公司