专利名称：凝集素的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及凝集素的新用途，特别是涉及凝集素在制备维持皮肤干/祖细胞处于G0/G1静息期药物中的应用。
背景技术：
皮肤覆盖在人体表面，是机体重要的保护屏障，因此皮肤健康十分重要，但是，在日常生活中，皮肤会不可避免的受到多种损伤。
迄今为止，放射治疗仍是肿瘤的主要治疗手段之一，随着放射治疗学的进展，射线对正常组织的损伤已经成为不可忽视的问题。放射性皮肤损伤不仅给患者带来痛苦，也影响肿瘤的治疗效果和预后，因此预防和治疗放射性皮肤损伤已引起了多方重视。阳光中有大量的紫外线，紫外线对人类的生活和生物的生长有很大影响。人们在阳光下曝晒不仅会引起皮肤过敏反应，甚至会引发皮肤癌。在日常生活中，电磁辐射无处不在，如计算机、电视机、手机和微波炉等家用电器在使用时就会产生大量的电磁辐射。皮肤如果长期暴露在超过安全剂量的辐射下，细胞就会被大面积杀伤或杀死，从而造成不同程度的皮肤损伤。
凝集素(Lectin)是植物体内的一类蛋白质或糖蛋白，与细胞表面蛋白或脂类复合物中的单糖或寡糖具有高度特异的结合能力，而且这种结合具有可逆性。自1988年Stillmark发现豆类种子提取物对动物红细胞具有凝集作用以来(Boyd WC.Specific agglutination and hemolysis by plant extracts.Rev Hematol.1955；10(2)428-429)，越来越多的凝集素得到开发利用，如刀豆凝集素(Concanavalin ensifomis agglutinin，ConA)、菜豆凝集素(Phaseolus vulgarisagglutinin，PHA)、美洲商陆、麦胚凝集素(Wheat germ agglut inin，WGA)、mestletoe凝集素等。研究表明，许多植物凝集素都能作为动物细胞信号转导的外源刺激因子，在各种生理反应中发挥作用。植物产生的凝集素则在分子间识别过程中起到重要作用(Moore JG，Fuchs CA，Hieklin DJ，et al.A new red kidney beanlectin called FRIL specifically stimulates proliferation of 3T3 fibroblaststransfected with the Flk2/Flt3 receptor.Blood，1997，901366a；Colucci G，Moore JG，Feldman M，Chrispeels MJ.cDNA cloning of FRIL，a lectin fromDolichos lablab，that preserves hematopoietic progenitors in suspensionculture.Proc Natl Acad Sci USA，1999，96(2)646-650；Kollet O，Moore.JG，Aviram R，et al.The plant lectin FRIL supports prolonged in vitromaintenance of quiescent human cord blood CD34(+)CD38(-/low)/SCIDrepopulating stem cells.Exp Hematol，2000，28(6)726-736)。
发明内容
本发明的目的是提供凝集素的新用途，即在制备维持皮肤干/祖细胞处于G0/G1静息期药物中的应用。
所述凝集素为植物凝集素，包括眉豆凝集素FRIL、刀豆凝集素ConA、菜豆凝集素PHA、美洲商陆和麦胚凝集素WGA等。
实验证明，植物凝集素对皮肤干/祖细胞的生长和增殖具有抑制作用，可体外维持表皮干细胞处于G0/G1静息期，因此，可以凝集素为活性成分制备成预防和/或治疗放射性皮肤损伤的药物。
需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的辅料，所述辅料包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂或稳定剂等。
该药物可以制成膏剂、乳剂、粉剂等适于外用的药物形式，其中，膏剂为优选的剂型。
上述药物在使用时可直接涂抹于皮肤受伤部位，一般1-3天换药1次，6-12天为一个疗程。
本发明提供了一种凝集素的新用途，即在制备维持皮肤干/祖细胞处于G0/G1静息期药物中的应用。实验证明，植物凝集素对皮肤干/祖细胞的生长和增殖具有抑制作用，可以体外维持表皮干细胞长期处于G0-G1期即静息期，处于静息期的细胞受辐射损伤的程度最低，因此可从根本上对表皮干细胞起到保护作用，最大程度的避免放疗损伤其受各种辐射损伤，动物实验结果也表明凝集素试验组治疗放射性皮肤损伤的显效率高达百分之百，治愈率平均也在75％以上，且安全，无任何毒、副作用，因此，可以凝集素为活性成分制备成预防和/或治疗放射性皮肤损伤的药物。本发明将在制备预防和/或治疗放射性皮肤损伤的药物及相关研究中发挥重要作用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
图1为PCR扩增的眉豆凝集素FRIL基因序列和氨基酸序列测序结果图2为提取并纯化的眉豆凝集素FRIL的15％SDS-PAGE检测结果图3为眉豆凝集素FRIL对表皮干细胞生长和增殖的影响的MTT法检测结果
具体实施例方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所用引物合成及序列测定工作均由上海博亚公司完成。
实施例1、眉豆凝集素FRIL提取、纯化及其编码基因的克隆与活性检测一、眉豆凝集素FRIL基因的克隆用Omega Bio2tek公司的EaZy Nucleic Acid(E.Z.N.A)植物RNA提取试剂盒提取眉豆(Dolichos lablab，购自中国农业科学院)新生豆苗的总RNA。以提取的眉豆(Dolichos lablab)总RNA为模板，用RNA PCR试剂盒(Ver.211，AMV公司)反转录合成其cDNA，再以此cDNA为模板，在引物P15’-CGTCACAGAACGCCTCTTGTAA-3’和P25’-CGCATGTTTCCCAGTAAGGTTA-3’的引导下PCR扩增眉豆凝集素FRIL(Flt 3receptor2interacting lectin)基因。50μl PCR反应体系为4μl cDNA(100ng/μl)，引物P1和P2(10μM)各1μl，4μl dNTPs(2.5mM)，1μl Ex Taq DNA聚合酶(TakaRa公司，5u/μl)，5μl 10×PCR缓冲液，38μl灭菌水。PCR反应条件为先94℃ 30s；然后59℃30s，72℃45s，共35个循环；最后72℃7min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果获得了819bp的DNA片段，回收并纯化该目的片段，将其克隆至载体pMD-18T(TakaRa公司)中，测序，测序结果表明扩增片段具有序列表中SEQ ID NO1的核苷酸序列，由819个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-816位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO2的氨基酸残基序列的蛋白质。本发明扩增的FRIL基因有3个碱基的突变，导致其编码蛋白也相应有3个氨基酸残基突变，但通过蛋白质成熟过程的剪接、修饰，其终产物可能与已有的FRIL氨基酸残基序列相一致。
二、眉豆凝集素FRIL提取、纯化眉豆凝集素FRIL可用下述方法提取并纯化称取50g眉豆(Dolichos lablab)干种子，研磨成粉，以5倍体积Tris缓冲液(50mmol/L Tris·HCl，1mmol/L MgCl2，1mmol/L CaCl2，pH8.0)匀浆，4℃平衡4小时以上，然后4℃、20000rpm离心20min，取上清，用冰醋酸调pH值至4.0，再用相同条件高速离心，取上清，用40％NaOH调pH值至8.0，相同条件高速离心取上清，上清即眉豆凝集素FRIL粗提液。利用凝集素对特定糖基高亲和力的特性对眉豆凝集素FRIL粗提液进行亲和层析纯化，具体方法为将粗提液用PEG6000(Sigma公司)浓缩至原来的1/10体积后，用Tris缓冲液平衡的亲和层析柱(用亲和层析介质(mannose-Sepharose matrix，Pharmacia公司)填充)纯化，4℃反应5小时(4小时以上)，眉豆凝集素FRIL可与亲和层析介质结合，接着用Tris缓冲液洗涤至没有蛋白流出，再用200mmol/L α-甲基α-D-甘露糖苷(Sigma公司)洗脱，得到眉豆凝集素FRIL纯溶液。对纯化的眉豆凝集素FRIL进行15％SDS-PAGE检测，结果如图2所示，在10kD-25kD范围内有5条明显的条带，正是所分离的植物凝集素的5个亚基(1个β亚基和4个α亚基)(Colucci G，MooreJ G，Feldman M，et al.cDNA cloning of FRIL，a lect in from Dolichos lablab，that preserves hematopoietic progenitors in suspension culture.Proc NatlAcad Sci USA，1999，96(2)646-650)，与预期结果相符。再对纯化蛋白用491A蛋白质序列分析仪进行N端前5个氨基酸残基测序(军事医学科学院仪器中心色谱实验室完成)，测序结果如表1所示，在检测的范围内与文献(Colucci G，MooreJ G，Feldman M，et al.cDNA cloning of FRIL，a lect in from Dolichos lablab，that preserves hematopoietic progenitors in suspension culture.Proc NatlAcad Sci USA，1999，96(2)646-650)中报道的序列相同，但α2亚基还出现N端缺失一个氨基酸残基的组分。对纯化的眉豆凝集素FRIL用BECKMAN2COULTERDU640核酸&蛋白质分析仪定量，每50g干眉豆大约可获得粗提FRIL蛋白约118g，纯FRIL蛋白约27mg，用小管分装，-80℃冻存。
表1 本发明眉豆凝集素FRIL凝集素部分亚基的N端氨基酸序列
三、凝集素活性测定检测步骤二获得的经纯化的眉豆凝集素FRIL的活性，具体方法为抽取家兔耳缘静脉血，采集红细胞(采集方法参见文献孙册，朱政，莫庆汉.凝集素.北京科学出版社，1986.20)，用生理盐水配成2％红细胞悬液。在V型凝血板上，将步骤二获得的眉豆凝集素FRIL用PBS(137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，4.3mmol/LNa2HPO4·7H2O，1.4mmol/L KH2PO4，pH7.3)倍比稀释(1∶2)，每孔加25μL，再加入2％新鲜红细胞悬液25μL，振荡摇匀后，25℃放置1-2小时，肉眼观察，无凝集现象时红细胞沉积在V型孔底部呈大红点状，有凝集现象时呈网状不下沉。结果显示，纯化的眉豆凝集素FRIL在稀释到约300ng/mL仍具有凝集活性，表明步骤二提取自眉豆的蛋白确实是一种具有凝集红细胞活性的植物凝集素，并设定该浓度(300ng/mL)为一个凝血单位。
四、糖抑制试验将6种糖saecharose(蔗糖)、maltose(麦芽糖)、α-D-mannose(α-D-甘露糖)、glucose(葡萄糖)、α-methyl α-D-mannoside(α甲基α-D甘露糖苷)、3-0 α-D-mannose(3-0α-D甘露糖)配成浓度为1mol/L的溶液，在V型凝血板上用PBS按1∶10的梯度倍比稀释，每孔加25μl，再往各孔添加3个凝血单位的步骤二获得的眉豆凝集素FRIL 25μl，以及2％新鲜红细胞悬液50μl，25℃放置1-2小时，肉眼观察抑制结果，能与红细胞竞争结合眉豆凝集素FRIL的糖将导致红细胞的沉积。结果如表2所示，眉豆凝集素FRIL与α-D-甘露糖有很高的亲和性，也正是利用这一特性对其进行亲和层析纯化的。
表2 眉豆凝集素FRIL与部分糖的抑制试验结果
实施例2、检测凝集素对表皮干细胞生长和增殖的影响首先检测眉豆凝集素FRIL对表皮干细胞生长和增殖的影响，具体方法为用0.25％胰蛋白酶消化培养的人表皮干细胞(获得及培养方法参见李剑，戴育成.无血清培养条件下人表皮干细胞的生物学特性研究.中华烧伤杂志，2005，(04))，用含10％胎牛血清的DF12培养液(Sigma公司产品，Cat#D0547)配成单细胞悬液，按每孔4000个细胞比例接种于96孔培养板，每孔体积200ul，在37℃、CO2培养箱中共培养6天。每天取出6孔细胞进行MTT比色试验，其中3孔为试验组(每天加入眉豆凝集素FRIL 4ul/mL)，另外3孔为对照组(无添加物)。3天后，取出6孔细胞后，每孔加入MTT溶液(5mg/mL Amresco)20ul，37℃继续孵育4小时，终止培养，然后小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150ul DMSO，振荡10分钟，最好在酶联免疫监测仪上测定490nm波长下各孔的光吸收值，记录结果。结果如图3所示，与对照组(Control)相比，试验组曲线呈下降趋势，表明眉豆凝集素FRIL有明显的抑止表皮干细胞生长和增殖的作用。
此外，还用上述相同方法检测了其它凝集素ConA、PHA、美洲商陆、WGA、mestletoe(上述凝集素均购自Sigma公司)对表皮干细胞生长和增殖的影响，与对照组相比，凝集素试验组的细胞OD490nm值均呈下降趋势，进一步证明凝集素有明显的抑止表皮干细胞生长和增殖的作用。
实施例3、检测凝集素对表皮干细胞细胞周期的影响检测眉豆凝集素FRIL对表皮干细胞细胞周期的影响，具体方法为用含10％胎牛血清的DF12培养液培养人表皮干细胞，并将相同条件下培养的细胞分为试验组和对照组，试验组为眉豆凝集素FRIL组(每天加入眉豆凝集素FRIL 4ul/mL)，对照组(无添加物)，培养3天后用0.25％胰蛋白酶消化细胞，1200rpm离心5min收集待测定细胞，用PBS洗一次，再用含3％胎牛血清的70％乙醇(PSB配制)重悬细胞，-20℃固定24小时后，1200rpm离心5min沉淀细胞，用PBS洗一次，弃上清，向细胞沉淀中加入10μl 10mg/mL RNase A，用PBS补充体积至100μl，37℃消化30min，用PBS补充体积至450μl，加入50μl 500μg/mL PI(购自北京宝赛生物技术有限公司)，4℃避光标记30min，最后进行流式细胞仪检测。结果如表3所示，与对照组相比，眉豆凝集素FRIL的G0/G1期细胞比例均高于对照组，表明眉豆凝集素FRIL能够维持更高比例的表皮干细胞处于G0/G1期，表明眉豆凝集素FRIL具有维持表皮干细胞处于G0/G1静息期的作用。
表3 眉豆凝集素对表皮干细胞细胞周期影响的流式细胞仪检测结果
此外，还用上述相同方法检测了其它凝集素ConA、PHA、美洲商陆、WGA、mestletoe等对表皮干细胞细胞周期的影响，与对照组相比，凝集素试验组处于G0/G1期的细胞比例更高，进一步证明凝集素具有维持表皮干细胞处于G0/G1静息期的作用，可制备成预防和/或治疗放射性皮肤损伤的药物。
实施例4、疗效实验以眉豆凝集素FRIL为例，检测凝集素对放射性皮肤损伤的疗效，具体方法为采用小鼠放射损伤模型，Balb/c小鼠(购自军事医学科学院，80只，体重16-18g，8-12周，分为空白对照组(20只)及实验组(60只)，实验组小鼠再分成3个小组(每组20只)，剂量6.0Gy/只，剂量率0.68Gy/min，60Co射线对3个小组小鼠分别照射3.0Gy(轻度损伤组)、6.0Gy(中度损伤组)、12Gy(重度损伤组)至不同程度的皮肤损伤，对照组大鼠也用相同的剂量照射，对实验组大鼠的照射损伤部位进行清洁后，涂抹浓度2.5mg/mL的眉豆凝集素FRIL，每天一次，对照组不给药，对给药部位进行观察，并对治疗效果进行统计。统计结果如表4和表5所示，表明用眉豆凝集素FRIL治疗放射性皮肤损伤的显效率高达百分之百，治愈率也在80％以上，而对照组皮肤损伤程度则愈发严重，且用药安全，无任何毒、副作用，可用于制备预防和/或治疗放射性皮肤损伤的药物。
表4 显效率及治愈率统计结果
表5 治愈时间统计结果
此外，还用上述相同方法检测了其它凝集素ConA、PHA、美洲商陆、WGA、mestletoe等对预防和/或治疗放射性皮肤损伤的疗效，与对照组相比，凝集素试验组治疗放射性皮肤损伤的显效率高达百分之百，治愈率平均也在75％以上，且用药安全，无任何毒、副作用，可用于制备预防和/或治疗放射性皮肤损伤的药物。
序列表<160>2<210>1<211>819<212>DNA<213>扁豆属扁豆种(Dolichos lablab L.[Lablab vulgaris Savi])<400>1atgtttccca gtaaggttaa gtcagcacag tcattgtcat ttagtttcac caagtttgat 60cctaaccaag aggatcttat cttccaaggt catgccactt ctacaaacaa tgtcttacaa120ctcaccaagt tagacagtgc aggaaaccct gtgagttcta gtgcgggaag agtgttatat180tctgcaccat tgcgcctttg ggaagactct gcggtattga caagctttga caccattatc240aactttgaaa tctcaacacc ttacacttct cgtatagctg atggcttggc cttcttcatt300gcaccacctg actctgtcat cagttatcat ggtggttttc ttggactctt tcccaacgca360aacactctca acaactcttc cacctctgaa aaccaaacca ccactaaggc tgcatcaagc420aacgttgttg ctgttgaatt tgacacctat cttaatcccg attatggtga tccaaactac480atacacatcg gaattgacgt caactctatt agatccaagg taactgctaa gtgggactgg540caaaatggga aaatagccac tgcacacatt agctataact ctgtctctaa aagactatct600gttactactt attatcctgg gagtaaacct gcgactctct cctatgatat tgagttacat660acagtgcttc ctgaatgggt cagagtaggg ttatctgctt caactggaca agataaagaa720agaaataccg ttcactcatg gtctttcact tcaagcttgt ggaccaatgt ggcgaagaag780gagaatgaaa acaagtatat tacaagaggc gttctgtga 819<210>2<211>272<212>PRT<213>扁豆属扁豆种(Dolichos lablabL.[Lablab vulgaris Savi])<400>2
Met Phe Pro Ser Lys Val Lys Ser Ala Gln Ser Leu Ser Phe Ser Phe1 5 10 15Thr Lys Phe Asp Pro Asn Gln Glu Asp Leu Ile Phe Gln Gly His Ala20 25 30Thr Ser Thr Asn Asn Val Leu Gln Leu Thr Lys Leu Asp Ser Ala Gly35 40 45Asn Pro Val Ser Ser Ser Ala Gly Arg Val Leu Tyr Ser Ala Pro Leu50 55 60Arg Leu Trp Glu Asp Ser Ala Val Leu Thr Ser Phe Asp Thr Ile Ile65 70 75 80Asn Phe Glu Ile Ser Thr Pro Tyr Thr Ser Arg Ile Ala Asp Gly Leu85 90 95Ala Phe Phe Ile Ala Pro Pro Asp Ser Val Ile Ser Tyr His Gly Gly100 105 110Phe Leu Gly Leu Phe Pro Asn Ala Asn Thr Leu Asn Asn Ser Ser Thr115 120 125Ser Glu Asn Gln Thr Thr Thr Lys Ala Ala Ser Ser Asn Val Val Ala130 135 140Val Glu Phe Asp Thr Tyr Leu Asn Pro Asp Tyr Gly Asp Pro Asn Tyr145 150 155 160Ile His Ile Gly Ile Asp Val Asn Ser Ile Arg Ser Lys Val Thr Ala165 170 175Lys Trp Asp Trp Gln Asn Gly Lys Ile Ala Thr Ala His Ile Ser Tyr180 185 190Asn Ser Val Ser Lys Arg Leu Ser Val Thr Thr Tyr Tyr Pro Gly Ser195 200 205Lys Pro Ala Thr Leu Ser Tyr Asp Ile Glu Leu His Thr Val Leu Pro210 215 220Glu Trp Val Arg Val Gly Leu Ser Ala Ser Thr Gly Gln Asp Lys Glu225 230 235 240Arg Asn Thr Val His Ser Trp Ser Phe Thr Ser Ser Leu Trp Thr Asn245 250 255
Val Ala Lys Lys Glu Asn Glu Asn Lys Tyr Ile Thr Arg Gly Val Leu260 265 270
权利要求
1.凝集素在制备维持皮肤干/祖细胞处于G0/G1静息期药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述凝集素为植物凝集素。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述植物凝集素为眉豆凝集素FRIL、刀豆凝集素ConA、菜豆凝集素PHA、美洲商陆或麦胚凝集素WGA。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述植物凝集素为眉豆凝集素FRIL。
5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于所述药物为预防和/或治疗放射性皮肤损伤的药物。
全文摘要
本发明公开了一种凝集素的新用途，即在制备维持皮肤干/祖细胞处于G0/G1静息期药物中的应用。实验证明，植物凝集素对皮肤干/祖细胞的生长和增殖具有抑制作用，可体外维持表皮干细胞处于G0/G1静息期，因此，可以凝集素为活性成分制备成预防和/或治疗放射性皮肤损伤的药物。本发明将在制备预防和/或治疗放射性皮肤损伤的药物及相关研究中发挥重要作用，应用前景广阔。
文档编号A61P17/00GK101020045SQ20071006492
公开日2007年8月22日 申请日期2007年3月29日 优先权日2007年3月29日
发明者裴雪涛, 师伟, 陈琳, 吕洋王, 王韫芳, 白慈贤, 南雪, 施双双, 管利东 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所