专利名称：黄芪凝集素蛋白及其制备方法
技术领域：
本发明属于植物蛋白领域，更具体地说，涉及从黄芪中分离一种凝集素蛋白及其制备方法。
背景技术：
中草药主要根据所含有的活性成分入药，为了充分利用资源和探索新地活性成分，其中蛋白质成分逐渐受到关注。近年来，已有许多具有生物活性的蛋白质相继在多种中草药中被发现。分离纯化中草药中的活性蛋白质成分，以期找到一些新的具有临床应用价值的蛋白质或多肽，已经成为国内外众多研究工作者的一个重要方向。
植物凝集素(lectin)是一类结合特异糖类蛋白质，又称血细胞凝集素(haemagglutinin)或凝集素(agglutinin)，是一种非免疫起源的、非酶的糖蛋白，至少拥有两个与糖结合的位点，而且结合是可逆的。近数十年来，人们对凝集素的性质、生理功能、基因结构与表达等方面进行了深入的研究，取得了有意义的进展。凝集素有许多生物学作用，这与凝集素与糖结合的专一性密切相关。
现已发现，植物凝集素可能与植物抗虫和抗病性相关，部分具有杀虫作用。国外最近报道某些凝集素对爱滋病病毒也有抑制作用。凝集素还参与了高等动物的发育、免疫、癌变以及细胞识别与信息传递等重要过程。凝集素广泛存在于自然界中的不同生物物种中，早期的研究对象主要是植物，其中豆科植物种子的含量尤为丰富，相关研究也比较多。
根据凝集素氨基酸序列的同源性及其在进化上的关系植物凝集素被分成7个家族豆科凝集素，单子叶甘露糖结合凝集素，2型核糖体失活蛋白，木菠萝(jacalin)家族，葫芦科韧皮部凝集素和苋科凝集素(Peumans and VanDamme，Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 1998，15199-228)
黄芪具有较为广泛的药理活性，其多糖、皂甙和黄酮类等成分已有较为深入的研究。黄芪中蛋白质含量较高(15％以上)，但黄芪中活性蛋白的报道尚属空白。因此，本发明首次对黄芪中的活性蛋白进行研究，为科学认识黄芪中蛋白质的功能提供依据。分离和纯化植物体内特异的凝集素，对其进行生理生化特性、结构和功能的研究分析，在植物基因工程和植物病理学领域具有重要的理论和应用价值。
发明内容
本发明首次进行了黄芪中一种凝集素的分离、纯化和鉴定。以黄芪为原料，通过硫酸铵分级沉淀及离子交换柱层析，得到了一种黄芪凝集素蛋白。
本发明的一个目的是提供一种黄芪凝集素蛋白，其是一种糖蛋白，在天然状态下以两个亚基组成的同源二聚体的形式存在，分子量为61.1kDa，单一亚基的分子量约为29.6kDa，其N端氨基酸序列为Glu-Ser-Gly-Iie-Asn-Leu-Gln-Gly-Asp-Ala-Thr-Leu-Ala-Asn-Asn。
本发明的黄芪凝集素蛋白通过N端15个氨基酸残基的同源性比较，是一个新的凝集素蛋白，该黄芪凝集素蛋白是一种糖蛋白，糖含量约为19.6％。
该黄芪凝集素蛋白能用于血液凝集。能凝集兔和人的血红细胞，特别对不同血型的人血表现出明显的特异性。对胰蛋白酶处理后的兔血红细胞，最低凝集浓度为2.3μg/ml。
糖抑制性实验表明该黄芪凝集素蛋白属半乳糖结合型的凝集素蛋白。
该黄芪凝集素蛋白还具有明显的抗真菌活性，特别是对灰葡萄孢菌有很强的抑制能力。
本发明的另一目的还涉及黄芪凝集素蛋白的制备方法，该方法包括以下步骤
1)以黄芪为原料，粉碎成粗粉，添加磷酸缓冲液，搅拌下提取，离心收集上清液作为蛋白质粗提取液备用；
2)搅拌条件下，添加硫酸铵粉末至粗提取液中，使粗提取液中硫酸铵饱和度达15-30％，搅拌充分混合后，离心，弃去沉淀收集上清液，继续添加硫酸铵粉末至上清液达50-70％硫酸铵饱和度，搅拌混合后，离心收集沉淀，弃去上清液。用磷酸缓冲液溶解沉淀，保存备用；
3)上述得到的蛋白用磷酸缓冲液透析后，再经以下三步离子交换柱层析来进行活性蛋白的纯化
第一步离子交换层析采用QAE Sephadex A-25离子交换柱，先洗出未结合的蛋白，然后用溶于磷酸缓冲液中的NaCl溶液洗脱；收集具有凝集活性的组分，采用醋酸钠缓冲液充分透析后保存备用；
第二步离子交换层析采用Econo-Pac CM离子交换柱，对第一步得到的粗蛋白进行层析，先洗出未结合的蛋白，然后用溶于磷酸缓冲液中的NaCl溶液洗脱，收集具有凝集活性的组分；
第三步离子交换层析采用Econo-Pac High Q离子交换柱，将上一步层析所得到的收集液，经Tris-HCl缓冲液透析后，再过第三步离子交换柱，先洗出未结合的蛋白，然后用溶于磷酸缓冲液中的NaCl溶液洗脱。收集具有凝集活性的组分，得到黄芪凝集素蛋白。
优选，本发明的黄芪凝集素蛋白是通过以下方法制备而成
1)以黄芪为原料，优选蒙古黄芪原料，粉碎成0.5-1.5mm粗粉，添加4～8倍量的50mM磷酸缓冲液，0～30℃搅拌下提取，0～30℃离心，收集上清液作为蛋白质粗提取液备用；
2)搅拌条件下，添加硫酸铵粉末至粗提取液中，使粗提取液中硫酸铵饱和度达15-25％，搅拌充分混合后，离心，弃去沉淀收集上清液，继续添加硫酸铵粉末至上清液达55-65％硫酸铵饱和度，搅拌且充分混合后，离心收集沉淀，弃去上清液。用10mM磷酸缓冲液溶解沉淀，低温保存备用；
3)上述得到的蛋白用10mM的磷酸缓冲液透析后，再经以下三步离子交换柱层析来进行活性蛋白的纯化
第一步离子交换层析采用QAE Sephadex A-25离子交换柱，先洗出未结合的蛋白，然后用溶于10mM磷酸缓冲液中的0～0.5M的NaCl溶液洗脱。收集具有凝集活性的组分，采用10mM醋酸钠缓冲液充分透析后保存备用；
第二步离子交换层析采用Econo-Pac CM离子交换柱，对第一步得到的粗蛋白进行层析，先洗出未结合的蛋白，然后用溶于10mM磷酸缓冲液中的0～0.3M的NaCl溶液洗脱，收集具有凝集活性的组分；
第三步离子交换层析采用Econo-Pac High Q离子交换柱。将上一步层析所得到的收集液，经10mM Tris-HCl缓冲液透析后，再过第三步离子交换柱，先洗出未结合的蛋白，然后用溶于10mM磷酸缓冲液中的0～0.3M的NaCl溶液洗脱，收集具有凝集活性的组分，得到黄芪凝集素蛋白。
本发明是根据目标黄芪凝集素蛋白的特性，通过不同饱和度的硫酸铵沉淀得到粗蛋白，然后将不同的离子交换柱结合应用，通过多步的离子交换层析获得一种黄芪凝集素蛋白。经凝胶过滤分析和SDS-PAGE电泳分析，其分子量为61.1kDa，单一亚基的分子量约为29.6kDa.。在天然状态下为两个亚基组成的同源二聚体。
氨基酸组分分析表明，该凝集素蛋白富含甘氨酸(Gly，16.0％)、丝氨酸(Ser，11.0％)、天冬氨酸(Asp，9.9％)和亮氨酸(Leu，9.6％)，而半胱氨酸、组氨酸和甲硫氨酸没有检出。采用Edman降解法，在Applied BiosystemsProcise-PROCISE上进行N端氨基酸残基组成的测定。N端氨基酸序列为ESGINLQGDATLANN(谷-丝-甘-异亮-天冬酰胺-亮-谷酰胺-甘-天冬-丙-苏-亮-丙-天冬酰胺-天冬酰胺，Glu-Ser-Gly-Iie-Asn-Leu-Gln-Gly-Asp-Ala-Thr-Leu-Ala-Asn-Asn)。以这15个氨基酸为基础，通过同源性比较发现，它与蛋白质数据库(GenBank CD translation，PDB，SwissProt，NCBI，EBI和PIR)中已经报道的蛋白质没有相同的序列，与花生(Arachis hypogaea)半乳糖结合凝集素和其前体具有53.3％的同源性，说明它是一种新的凝集素蛋白。
该凝集素能凝集兔和人的血红细胞，特别对不同血型的人血表现出明显的特异性。对胰蛋白酶处理后的兔血红细胞，最低凝集浓度为2.3μg/ml。糖抑制性实验表明该凝集素属半乳糖结合型的凝集素。此外，该凝集素还具有明显的抗真菌活性，特别是对灰葡萄孢菌有很强的抑制能力。
附图1纯黄芪凝集素蛋白的SDS-PAGE图及糖蛋白的鉴定图。
图中M标准蛋白P纯化的黄芪凝集素蛋白Q糖蛋白鉴定
如附图1所示，经SDS-PAGE电泳后采用高碘酸-Schiff(PAS)试剂法鉴定，在相应位置上呈现明显的粉红色条带，表明该黄芪凝集素蛋白是一种糖蛋白。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细说明，但是不以任何方式限制本发明的范围。
实施例黄芪凝集素蛋白的制备
1).粗蛋白的提取将5g黄芪原料粉碎成1mm左右粗粉，添加6倍量的50mM磷酸缓冲液，15℃搅拌下提取16小时，15℃离心(1000×g)10分钟，收集上清液作为蛋白质粗提液备用；
2).在搅拌条件下，缓慢添加硫酸铵粉末至粗提液中，使粗提液中硫酸铵饱和度达20％，在冰水浴中缓慢搅拌充分混合后，离心(10000×g)10分钟，弃去沉淀收集上清液。继续添加硫酸铵粉末至上清液达60％硫酸铵饱和度，缓慢搅拌且充分混合后，离心(10000×g)10分钟收集沉淀，弃去上清液，用10mM磷酸缓冲液溶解沉淀，保存备用；
3).上述得到的蛋白用10mM的磷酸缓冲液透析后，再经以下三步离子交换柱层析来进行活性蛋白的纯化
第一步离子交换层析采用QAE Sephadex A-25离子交换柱，先洗出未结合的蛋白，然后用溶于10mM磷酸缓冲液的0～0.3M的NaCl溶液梯度洗脱。收集具有凝集活性的组分，采用10mM醋酸钠缓冲液透析后保存备用。
第二步离子交换层析采用Econo-Pac CM离子交换柱，对第一步得到的粗蛋白进行层析，先洗出未结合的蛋白，然后用溶于10mM磷酸缓冲液中的0～0.3M的NaCl溶液梯度洗脱，收集具有凝集活性的组分。
第三步离子交换层析采用Econo-Pac High Q离子交换柱。将上一步层析所得的收集液，经10mM Tris-HCl缓冲液透析后，再过第三步离子交换柱。先洗出未结合的蛋白，然后用溶于10mM磷酸缓冲液中0～0.3M的NaCl溶液梯度洗脱。收集具有凝集活性的组分，得到黄芪凝集素蛋白。
实施例1制备的黄芪凝集素蛋白的分子特征
经凝胶过滤分析和SDS-PAGE电泳分析，其分子量为61.1kDa，单一亚基的分子量为29.6kDa，天然状态下为两个亚基组成的同源二聚体，如附图1所示。经SDS-PAGE电泳后采用高碘酸-Schiff(PAS)试剂法鉴定，在相应位置上呈现明显的粉红色条带，表明该凝集素蛋白是一种糖蛋白。
氨基酸组成分析表明，该蛋白富含甘氨酸(Gly，16.0％)、丝氨酸(Ser，11.0％)、天冬氨酸(Asp，9.9％)和亮氨酸(Leu，9.6％)，而半胱氨酸、组氨酸和甲硫氨酸没有检出。采用Edman降解法，在Applied Biosystems Procise-PROCISE上进行N端氨基酸残基组成的测定。N-端氨基酸序列为ESGINLQGDATLANN(谷-丝-甘-异亮-天冬酰胺-亮-谷酰胺-甘-天冬-丙-苏-亮-丙-天冬酰胺-天冬酰胺，Glu-Ser-Gly-Iie-Asn-Leu-Gln-Gly-Asp-Ala-Thr-Leu-Ala-Asn-Asn)。以这15个氨基酸为基础，通过同源性比较发现，它与蛋白质数据库(GenBank CD translation，PDB，SwissProt，NCBI，EBI和PIR)中已经报道的蛋白质没有相同的序列，与花生(Arachis hypogaea)半乳糖结合凝集素和其前体具有53.3％的同源性，说明它是一种新的凝集素蛋白。
分析方法
蛋白和糖含量测定方法
蛋白的精确定量采用Lowry方法(Lowry等，1951)以牛血清蛋白为标准。糖含量测定采用苯酚-硫酸法(Dubois，1956)，以葡萄糖作为标准。
凝集活性的测定方法
在96孔U型凝血板上，每孔加入50μl的样品溶液和2％新鲜血球悬液50μl(或经1mg/ml胰蛋白酶处理1h后)，混匀后，放置1h，肉眼观察结果，以能使红细胞凝集的最大样品稀释度为1个血凝单位(HU)。相对凝集活性为凝集活性与蛋白含量的比值。
该黄芪凝集素蛋白对天然或胰蛋白酶处理后的兔、人等血液具有较强的凝集活性，凝集兔血最低蛋白浓度为4.6μg/ml(天然)和2.3μg/ml(胰蛋白酶处理后)。凝集活性的最适pH范围为4.5～7.5，在65℃以下稳定。
表1 凝集素对兔和人血的凝集活性
a蛋白浓度184μg/ml下凝集活性没有检出
糖抑制试验
选取不同的糖(乳糖、半乳糖、棉子糖、鼠李糖、纤维二糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖)分别配成0.5M的糖溶液。将糖溶液用PBS溶液倍比稀释，每孔25μl糖液，再在每孔中加入25μl样品溶液(实验采用4个血凝单位，即凝集活性为4HU)，混匀，室温下让其反应30min后，每孔加入50μl的2％的经胰蛋白酶处理的兔血红细胞，混匀，静置，待其凝集(大约1小时左右)后观察结果。
表2 凝集素活性对糖的特异性
a4HU的凝集素所对应的最低抑制浓度
bNI，糖浓度达125mM时仍无抑制作用
对糖的特异性的试验结果如表所示。半乳糖和乳糖能强烈抑制该凝集素的凝集活性，最低抑制浓度分别达7.8mM和3.1mM。D-棉子糖、L-鼠李糖和纤维二糖也能较强地抑制该凝集素对兔血的凝集活性。D-葡萄糖、D-木糖和L-阿拉伯糖为该凝集素的中等程度凝集活性抑制剂。但D-半乳糖醛酸、D-果糖、麦芽糖、D-甘露糖、D-核糖、L-山梨糖和蔗糖在浓度高达125mM情况下未见对兔血凝集活性的抑制。糖的特异性结果表明，该凝集素是一种半乳糖结合型的凝集素。
抗真菌活性
灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)，黄瓜镰刀孢菌(Fusarium oxysporum)，Colletorichum sp.，Drechslera turcia，Mycosphaerella arachidicola和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)购自中科院微生物所菌种保藏中心。
将指示真菌接种在培养皿中心，置25℃培养，待菌丝向外蔓延的圆面直径约2～3cm时，在离菌丝生长边缘约1cm处放置灭菌的滤纸圆片，在滤纸片上分别滴加10～15μl待测蛋白，置25～28℃培养72h，观察并记录菌丝生长被抑制的情况。
表3黄芪凝集素蛋白对六种真菌的抑制情况
“+++”在蛋白量为20μg即有较强抑制能力；“+”在蛋白量为100μg即有一定抑制能力；“-”当蛋白的量为200μg时，仍无抑制能力。
权利要求
1.一种黄芪凝集素蛋白，其特征在于，
N-端氨基酸序列为Glu-Ser-Gly-Iie-Asn-Leu-Gln-Gly-Asp-Ala-Thr-Leu-Ala-Asn-Asn
天然状态下为两个亚基组成的同源二聚体，分子量约61.1kDa，单一亚基的分子量为约29.6kDa；
2.根据权利要求1所述的凝集素蛋白在血液凝集中的应用。
3.根据权利要求1所述的凝集素蛋白用于抗真菌。
4.一种黄芪凝集素蛋白的制备方法，其特征在于，它包含下述步骤
1)以黄芪为原料，粉碎成粗粉，添加磷酸缓冲液，搅拌下提取，离心收集上清液作为蛋白质粗提取液备用；
2)搅拌条件下，添加硫酸铵粉末至粗提取液中，使粗提取液中硫酸铵饱和度达15-30％，搅拌充分混合后，离心，弃去沉淀收集上清液，继续添加硫酸铵粉末至上清液达50-70％硫酸铵饱和度，搅拌混合后，离心收集沉淀，弃去上清液，用磷酸缓冲液溶解沉淀，保存备用；
3)上述蛋白用磷酸缓冲液透析后，再经以下三步离子交换柱层析来进行活性蛋白的纯化
第一步离子交换层析采用QAE Sephadex A-25离子交换柱，先洗出未结合的蛋白，然后用溶于磷酸缓冲液中的NaCl溶液洗脱；收集具有凝集活性的组分，采用醋酸钠缓冲液充分透析后保存备用；
第二步离子交换层析采用Econo-Pac CM离子交换柱，对第一步得到的粗蛋白进行层析，先洗出未结合的蛋白，然后用溶于磷酸缓冲液中的NaCl溶液洗脱，收集具有凝集活性的组分，
第三步离子交换层析采用Econo-Pac High Q离子交换柱，将上一步层析所得到的收集液，经Tris-HCl缓冲液透析后，再过第三步离子交换柱，先洗出未结合的蛋白，然后用溶于磷酸缓冲液中的NaCl溶液洗脱，收集具有凝集活性的组分，得到黄芪凝集素蛋白。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，它包含以下步骤
1)以蒙古黄芪为原料，粉碎成0.5-1.5mm粗粉，添加4～8倍量的50mM磷酸缓冲液，0～30℃搅拌下提取，0～30℃离心，收集上清液作为蛋白质粗提取液备用；
2)搅拌条件下，添加硫酸铵粉末至粗提取液中，使粗提取液中硫酸铵饱和度达15-25％，搅拌充分混合后，离心，弃去沉淀收集上清液，继续添加硫酸铵粉末至上清液达50-65％硫酸铵饱和度，搅拌且充分混合后，离心收集沉淀，弃去上清液，用10mM磷酸缓冲液溶解沉淀，保存备用；
3)上述得到的蛋白用10mM磷酸缓冲液透析后，再经以下三步离子交换柱层析来进行活性蛋白的纯化
第一步离子交换层析采用QAE Sephadex A-25离子交换柱，先洗出未结合的蛋白，然后用溶于10mM磷酸缓冲液中的0～0.5M NaCl溶液洗脱；收集具有凝集活性的组分，采用10mM醋酸钠缓冲液充分透析后保存备用；
第二步离子交换层析采用Econo-Pac CM离子交换柱，对第一步得到的粗蛋白进行层析，先洗出未结合的蛋白，然后用溶于10mM磷酸缓冲液中的0～0.3M的NaCl溶液洗脱，收集具有凝集活性的组分，
第三步离子交换层析采用Econo-Pac High Q离子交换柱，将上一步层析所得到的收集液，经10mM Tris-HCl缓冲液透析后，再过第三步离子交换柱，先洗出未结合的蛋白，然后用溶于10mM磷酸缓冲液中的0～0.3M的NaCl溶液洗脱，收集具有凝集活性的组分，得到黄芪凝集素蛋白。
6根据权利要求4或5所述的制备方法所获得的黄芪凝集素蛋白。
全文摘要
本发明提供从植物黄芪中分离纯化后得到的凝集素蛋白及其制备方法，具体说，以黄芪为原料，通过不同饱和度的硫酸铵分级沉淀及多步的离子交换柱层析，得到的一种黄芪凝集素蛋白。该凝集素蛋白属半乳糖结合型的凝集素蛋白，在天然状态下为两个亚基组成的同源二聚体，通过N端15个氨基酸残基的同源性比较，是一个新的凝集素蛋白，用于血液凝集，并具有明显的抗真菌作用。
文档编号C07K7/08GK1687115SQ200510011480
公开日2005年10月26日 申请日期2005年3月25日 优先权日2005年3月25日
发明者闫巧娟, 韩鲁加, 江正强, 杨绍青, 邓伟 申请人:中国农业大学