专利名称：白细胞凝集素及其应用的制作方法
白细胞凝集素及其应用本发明涉及多肽即凝集素、其编码核酸序列和针对多肽的抗体，以及它们在各种医学应用中的用途。细胞免疫防御系统是在微生物和寄生虫的挑战中存活的关键。该系统对于处理癌发生中、病毒感染后和自体免疫疾病中的不正常细胞来说，也是最为相关的。细胞间识别是这些功能的核心，但是对这些现象的起源本身的了解十分贫乏。在原始有性生物群亿万年的趋异变化后，必须进化出能确保性细胞的物种特异性识别(“受精”)的基因。否则，有性物种的存活率将受到威胁。进化出了几种细胞识别分子。当在寒武纪生物群侵入陆地生境时，这种干燥的生境越来越有利于将有性受精限制于庇坊环境， 使物种混杂的机会降低。因此，用于物种特异性配子识别的基因将趋于变得多余，并因此能够在进化中自由获得新的功能。一种明显的新功能是生物体辨别其自己(自身)细胞与外来(非自身)细胞的能力。已经提出，这种机制为细胞免疫系统的起源提供了一种合理的解释，否则这种现象很难解释。这种由先天免疫提供的辨别能力(Medzhitov & Janeway, 1997, Cell, 91 (3), P295-298)对于多细胞生物体防止其被寄生虫和微生物蚕食来说是必需的。系统辨别“自身”与“非自身”的机能障碍，可能形成了某些自体免疫疾病的基础。被称为自体免疫的错误定向的免疫应答，由自身抗体或与宿主抗原反应的T淋巴细胞的存在而证实。尽管它通常是无害的并可能是脊椎动物生命的普遍现象，但自体免疫能够引起广范围的被称为自体免疫疾病的人类疾病。自体免疫作为人类疾病的原因这一概念是相对新的，并且直到20世纪50和60年代还未被医学思想的主流所接受。自体免疫疾病被定义为其中发生了从良性自体免疫到病原性自体免疫的发展的疾病。这种发展由遗传影响和环境触发物两者所决定。自体免疫疾病是对健康的重大威胁。有超过八十种疾病由自体免疫引起。它们对女性特别有威胁；约75%的患者是女性。在高达65岁的所有年龄组中，自体免疫疾病是女性中的十大死因之一。自体免疫疾病影响身体的许多不同部位，包括皮肤(例如斑秃、大疱性类天疱疮、 后天性大疱性表皮松解、落叶性天疱疮、寻常性天疱疮、白癜风，牛皮癣和痤疮)、肾脏(例如IgA肾病)、血液(例如再生障碍性贫血、自体免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜和恶性贫血)、关节(例如强直性脊柱炎)、肌肉(例如多肌炎/皮肌炎)、耳(例如自体免疫性听力丧失和美尼尔综合征)、眼(例如角膜侵蚀性溃疡，赖特综合征和Vogt-小柳-原田病)、心脏(例如自体免疫性心肌炎、Churg-Strauss综合征、巨细胞动脉炎、川崎病、结节性多动脉炎、多发性大动脉炎和韦格纳肉芽肿)、内分泌系统(例如阿狄森氏病、自体免疫性甲状旁腺机能减退、自体免疫性垂体炎、自体免疫性卵巢炎、自体免疫性睾丸炎、 格雷夫斯病、桥本甲状腺炎、1型多腺体自体免疫综合征(PAS-I)、2型多腺体自体免疫综合征(PAS-2)、3型多腺体自体免疫综合征(PAS 3)和1型糖尿病)、胃肠系统(例如自体免疫性肝炎、乳糜泻、炎症性肠病和原发性胆汁性肝硬化)、神经系统(例如慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、格林-巴利综合征、多发性硬化症和重症肌无力)，或者可能系统地影响身体(例如抗磷脂综合征、自体免疫性淋巴细胞增生、自体免疫性多内分泌病、白塞氏病、 肺出血-肾炎综合征、类风湿关节炎、结节病、硬皮病、干燥综合征和系统性红斑狼疮)。自体免疫疾病能够攻击身体的任何部分，因此症状广泛变化，并且诊断和治疗通常是困难的。除非正确诊断和治疗，否则某些自体免疫疾病可能威胁生命。慢性自体免疫病症例如类风湿关节炎使患者变跛，并且也对患者的家庭产生重负。某些类型的眼色素层炎可能导致眼盲。疾病例如硬皮病需要巧妙、终生的治疗。其他自体免疫疾病包括格雷夫斯病和慢性甲状腺炎，如果正确诊断，可以成功地治疗，但是因为它们发病轻微而常常被错过。炎症是一种正常的过程，在该过程中身体的白细胞和化学物质保护身体抵抗感染和外来物例如细菌和病毒。然而，在某些疾病中，身体的免疫系统在没有外来物抗击时的不恰当地引发炎性响应。因此，炎症在自体免疫疾病中常见，但不是所有炎性病症都是自体免疫性应答。炎性疾病也可以由广泛的各种直接攻击身体的因子引起，例如微生物(病毒和真菌)、细菌毒素、某些药剂(抗生素和抗炎性留族化合物)以及化学试剂(胆盐、有毒家用化工产品)。与炎症有关的疾病包括关节炎(其是描述关节中炎症的通用术语)、心脏的炎症(心肌炎)、将空气运输到肺的小管的炎症(其可以引起哮喘发作)、肾脏的炎症(肾炎)和大肠的炎症(结肠炎)。胃肠炎性病症是特别重要的(例如胃部炎性疾病(例如胃溃疡、十二指肠溃疡和胃炎)和肠道炎性疾病(包括克罗恩病、炎症性肠病、热带性和非热带性口炎性腹泻、传染性肠炎、结肠炎、溃疡性结肠炎、假膜性结肠炎、憩室炎以及过敏性和放射性炎性疾病)。胃肠炎性疾病的特征是炎症，特别是出现浮肿、特征性炎性细胞(即白细胞、组织细胞和巨噬细胞)，以及在某些情况下出现表面上皮的坏死和溃疡。已知这些炎性疾病由广泛的各种因子引起，所述因子存在于胃肠道中，已知攻击其表面，产生炎性疾病响应。这些因子包括微生物(病毒和真菌)、细菌毒素、某些药剂(抗生素和抗炎性留族化合物)以及化学试剂(胆盐、有毒家用化工产品)。事实上，胃酸本身能攻击胃黏膜并产生炎性状态。目前使用的用于治疗炎症的药物包括非甾族抗炎药(NSAID，例如阿司匹林、布洛芬或萘普生)、皮质类固醇(例如强的松)、抗疟疾药物(例如羟基氯喹)和其他药物例如甲氨蝶呤、柳氮磺胺吡啶、来氟米特、抗TNF药物、环磷酰胺和霉酚酸。某些胃肠疾病、特别是胃病，可以通过抑制引起炎症的胃酸分泌，例如通过中和酸的效应(例如给药解酸剂)或通过给药有效抑制胃酸分泌的药剂，来进行治疗。受损的皮肤易受感染，并可能难看和/或引起疼痛或不适。某些伤口类型在正常生理条件下对愈合有抗性，例如慢性溃疡。任何修复受损皮肤、特别是修复伤口的药物解决方法都是非常需要的。对于适合以最小的副作用治疗自体免疫和炎性病症和疾病或皮肤损伤的治疗方法，仍存在需求。在对可能参与真核生物进化的过程进行了多年研究之后，本发明人鉴定到一种新的蛋白质(在本文中也称为白细胞凝集素(leukolectin))，其不仅存在于配子和合子中， 而且也存在于早期胚胎中(在被称为Iectocyte的特化细胞中)以及血细胞的个体发生过程中，并且最后存在于白细胞中。该蛋白最初在鱼中鉴定到并从其中纯化(参见实施例)。该蛋白具有255个氨基酸。这是凝集素的前肽形式，其包含19个氨基酸的N-端肽，这表明它靶向溶酶体以便晚些时候分泌(即进入到卵周空间中)。利用凝集素的氨基酸序列能够开发表位特异性抗体，取决于所分析的组织，其反过来使得能够鉴定到蛋白的许多个)上的同种型(图幻。已经从鲑鱼分离到至少两个mRNA (参见实施例11)，其包含少量序列差异，在多肽水平上仅产生7个改变(
图17)。截短形式的蛋白也已经从鲑鱼白细胞(参见SEQ ID NO 2)和斑马鱼中分离到，在斑马鱼中已经鉴定到分泌形式(如上所述，用sLL表示)和截短形式，所述截短形式从N-端失去前32 个氨基酸，用tLL表示(参见实施例9)。该蛋白与任何已知蛋白几乎没有相似性，显示出与任何已知蛋白的总相似性低于 50%。在小结构域中观察到与鲎凝集素(tachylolectin)的一些相似性。相关蛋白已经在各种动物中鉴定到，包括斑马鱼、鳕鱼、虹鳟鱼、异体住囊虫 (Oikopleura dioica)，还有鸡和人类。它们的cDNA被鉴定(参见实施例)，并被发现是极端保守的。在已经研究过的物种中编码的蛋白显示出低于4%的变化。这表明这些蛋白具有必不可少的功能。到目前为止还没有报道在任何生物体中有序列相似的基因。使用针对各个外显子或内含子的探针，已经确立只有一个外显子与两种已报道的其他蛋白的一部分具有少量相似性，这两种蛋白与本文描述的分子实体完全不同。重要的是，这个新基因特异性表达在人类白细胞中，尽管不能在已发表的人类基因组序列中找到该基因。该基因只有非常短的区段可以被检测到，但遍布在多个人类染色体中(参见实施例)。这个谜题的解答到目前为止还未找到。最后，已发现该分子实体被细胞分泌，其与蛋白的前肽形式同一。天然和重组形式的基因产物两者都已分离到。令人吃惊地发现，这些蛋白对特别是皮肤的自体免疫和炎性病症以及其他皮肤病症具有显著效应。尽管不希望受到理论的束缚，但据信白细胞凝集素与特异性受体结合，启动人体的正常和固有的愈合过程。从观察到的效应，我们提出白细胞凝集素参与细胞免疫的正常过程。在许多疾病状态下白细胞凝集素似乎丢失，使得将其作为药物导入触发了免疫系统在面对各种激惹出现外来细胞(微生物、寄生虫)和“自身”的改变细胞时所正常执行的其他防御性应答，这可能将白细胞凝集素与自体免疫疾病的病因相联系，即这样的病症可能由缺乏足够的白细胞凝集素引起。人类白细胞含有并表达极其保守的白细胞凝集素蛋白。到现在为止，这些蛋白在血细胞中还是未知蛋白。白细胞凝集素看来是鲎凝集素家族蛋白的新成员。在第一方面，本发明提供了多肽，其包含序列号1-8任一个中显示的氨基酸序列， 或与所述序列至少50%同一的序列，或任何所述序列的部分。“多肽”在本文中是指具有优选超过50、100、150、200或250个残基和/或少于 500、400、300、200或100个残基或从中选择的范围的分子。本文中指称的“部分”优选包含它所源自的序列的至少30、40、50、60、70、80、90、100、150、200个或以上的氨基酸。所述部
分可以从序列的中间或N-端或C-端部分获得。优选情况下，所述部分从N-末端、例如从多肽的前50、100或150个残基获得。优选情况包括所述多肽的截短，例如除去信号肽或天然存在的变体中不存在的部分。优选的截短发生在N-末端，并且长度为1至50例如1至10,20,30或40，或5至40例如10至；35个残基。优选情况下，所述序列与它所比较的序列至少55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、 97、98 或 99% 同一。可以通过例如使用SWISS-PR0T蛋白质序列数据库，使用带有可变pamfactor的 FASTA ρ印-cmp，并将间隙生成罚分(gap creation penalty)设置为12.0，间隙延伸罚分 (gap extension penalty)设置为4. 0，窗口为2个氨基酸，来确定序列同一性。优选情况下所述比较在全长序列上进行，但是可以在较小的比较窗口上进行，例如少于200、100或 50个连续的氨基酸。优选情况下，这种序列同一性相关多肽与所列举的序列号中显示的多肽在功能上等价。这些功能上等价的多肽可以采用下面显示的衍生物的形式。同样，具有序列号中显示序列的多肽可以如下所述进行修饰，而不影响多肽的序列。此外，本文中描述的“部分，，可能是功能等价物。优选情况下，这些部分满足本文中提到的同一性条件(相对于可比较区域来说)。正如在本文中提到的，为了实现“功能等价”，多肽相对于亲代分子(即其所源自的分子，例如通过氨基酸取代)在执行医疗功能方面可以显示出某些降低的效能，但优选同样有效或更加有效。因此，功能等价物是指有效治疗本文中提到的疾病，即减轻患者的一种或多种症状例如炎症或后文中所述的皮肤外观的多肽。这可以通过以定性或定量方式比较衍生多肽相对于其所源自的多肽的效应，例如通过执行在实施例中提到的体内分析，来测试。当定量结果可用时，衍生物的有效性为亲代多肽的至少30、50、70或90%。可选地， 可以执行体外测试，例如通过分析与树突状细胞的结合或对体外细胞培养物的影响。与天然存在的蛋白相关或从其衍生的功能等价的蛋白，可以通过利用单个或多个氨基酸取代、添加和/或缺失(只要它们满足上面提到的序列同一性要求即可)以修饰天然氨基酸但不破坏分子的功能，来获得。优选情况下，天然序列具有少于20个取代、添加或缺失，例如少于10、5、4、3、2或1个这样的修饰。这些蛋白由通过一个或多个碱基的适当取代、添加和/或缺失所产生的“功能上等价的核酸分子”编码。优选的功能等价物是“添加”变体，其中产生了包含与亲代多肽融合的其他蛋白或多肽的氨基和/或羧基端融合蛋白或多肽。特别优选的功能等价变体是天然生物学变化形式(例如等位基因变体或物种内或可选不同属例如植物、动物或细菌中的地理变化形式)，以及使用已知技术制备的衍生物。例如，可以通过化学合成或采取重组体形式，使用已知的定点突变技术包括核酸的缺失、随机诱变或酶切割和/或连接，来生产编码功能等价蛋白的核酸分子。本发明还提供了编码所述多肽的核苷酸序列。因此，在优选情况下，本发明提供了在序列号9-15任一个中显示的核苷酸序列， 与所述序列至少50%同一的序列，或在6x SSC/50%甲酰胺和室温的非严紧结合条件下、并且在高严紧条件例如SSC、65°C下清洗时与所述序列杂交的序列，或与任何上述序列互补的序列，或其部分，其中SSC = 0. 15M NaCl,0. 015M柠檬酸钠，pH 7. 2。优选情况下，所述核酸分子编码前文中显示的多肽。“核酸分子”在本文中是指优选具有150、300、450、600或750个以上的碱基和/或少于1500、1200、900、600或300个碱基或从中选择的范围的分子。上面所指的“部分”优选包含它所源自的序列的至少90、120、150、180、210、240、270、300、450或600个核苷酸碱
基。优选情况下，所述部分编码前文中所述的N-端、中段或C-端肽。正如上面涉及多肽时所讨论的，在优选情况下考虑到导致从所列举多肽的N-末端除去残基的截短。在编码核苷酸序列中，相对于本文提出的序列，所述截短的长度优选为1至150、例如1至30、60、90或 120，或13至120例如28至105个碱基。优选情况下，所述序列与它所比较的序列至少55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、 97、98 或 99% 同一。可以通过例如使用GCG软件包的FASTA搜索，使用缺省值和可变pamfactor，并将间隙生成罚分(gap creation penalty)设置为12.0，间隙延伸罚分(gap extension penalty)设置为4. 0，窗口为6个核苷酸，来确定序列同一性。优选情况下，这些序列同一性相关或杂交核酸分子与所列举的序列号中显示的核酸分子在功能上等价。这些功能等价的核酸分子可以采取下面显示的衍生物的形式，并且如果它们编码的多肽根据上文中描述的测试被认为是功能等价的，则所述衍生物被认为是功能等价的。优选的功能等价物是编码上面提出的优选多肽的等价物，例如编码在不同于本文提到的特定分子的属或种中所发现的多肽的核酸分子。此外，本文中描述的“部分”可能是功能等价物。优选情况下，这些部分满足本文中提到的同一性(相对于可比较区域来说)或杂交条件。本发明的核酸分子可以是单链或双链DNA、cDNA或RNA，优选为DNA，并包括如上所述的简并的、基本上同一的和杂交的序列。然而，理想情况下分子是DNA或cDNA。如上所述的多肽包括通过例如不影响多肽序列的化学修饰、包括去糖基化或糖基化进行修饰的多肽。这样的多肽可以通过不影响功能性的多肽的合成/分离后修饰，例如特定残基的某种糖基化、甲基化等，来制备。本发明的多肽可以采取肽模拟物的形式，其可以被看作其中多肽的功能特点被保留、但是存在于不同背景例如非肽结构中的衍生物。这样的肽模拟物已被成功开发，并用于其它特定医学应用中。肽模拟物、特别是非肽类分子，可以通过各种方法来产生，所述方法包括基于构象的药物设计、筛选、集中文库设计和经典药物化学。不仅可以使用非天然氨基酸或其他有机结构单元的寡聚体，而且可以通过本技术领域已知的方法使用糖类、杂环或大环化合物以及包含提供分子静电表面的结构性元件和构象、模拟肽的三维构象的相同性质的任何有机分子。因此，肽模拟物可以具有与肽骨架非常少的或没有相似性。肽模拟物可以包含全合成的非肽形式(例如基于具有适合取代基的糖骨架)，或者可以保留它所基于的肽的一个或多个元件，例如通过衍生一个或多个氨基酸或用可选非肽组分代替一个或多个氨基酸。类似肽的模板包括假肽和环肽。可以将被认为对于肽的功能来说多余的结构元件最小化以便只保留支架功能，或者在适合时将所述结构元件移除。当肽模拟物保留一个或多个肽元件、即一个以上氨基酸时，这些氨基酸可以用非标准氨基酸或其结构类似物代替。也可以将保留在序列中的氨基酸进行衍生或修饰(例如标记、糖基化或甲基化)，只要本发明的多肽的功能性质得到保留即可。肽模拟物被称为 “可衍生自”某个多肽序列。此时，它意味着肽模拟物参照所确定的多肽序列设计，使得它保留了多肽对于其功能来说必需的结构特征。这可以是多肽的特定侧链或结构的氢键形成潜力。这些特征可以由非肽组分或一个或多个氨基酸残基提供，或者连接多肽的所述氨基酸残基的键可以被修饰，以便改进多肽的某些功能例如稳定性或蛋白酶抗性，同时保留多肽对于其功能来说必需的结构特征。可以使用的非标准或结构类似氨基酸的实例有D-氨基酸、酰胺电子等排体(例如 N-甲基酰胺、tetro-inverse酰胺、硫代酰胺、硫酯、膦酸酯、酮亚甲基、羟基亚甲基、氟代乙烯基、(E)-乙烯基、亚甲基氨基、亚甲基硫代或烷烃)、L-N_甲基氨基酸、D-α -甲基氨基酸、 D-N-甲基氨基酸。非常规氨基酸的实例列于表1中。表 权利要求
1.一种多肽，所述多肽包含序列号1-8任一个中显示的氨基酸序列，或与所述序列有至少50%同一性的序列，或任一所述序列的一部分。
2.—种核酸分子，所述核酸分子包含序列号9-15任一个中显示的核苷酸序列，与所述序列有至少50%同一性的序列，或在室温和6xSSC/50%甲酰胺的非严紧结合条件下、并且在高严紧条件例如^ SSC和65°C下清洗时与所述序列杂交的序列，或与任一上述序列互补的序列，或其一部分，其中SSC = 0. 15M NaCl，0. 015M柠檬酸钠，pH 7.2。
3.一种载体，优选为表达载体，所述载体包含权利要求2中限定的核酸分子。
4.一种用于制备权利要求3的重组核酸分子的方法，所述方法包含将权利要求2中限定的核酸分子插入到载体核酸中。
5.一种用于制备权利要求1中的多肽的方法，所述方法包含将含有权利要求2中限定的核酸分子的宿主细胞在使所述多肽表达的条件下培养，并回收由此产生的所述分子。
6.一种多肽，所述多肽从权利要求5的方法获得。
7.一种宿主细胞，所述宿主细胞含有权利要求1的多肽或权利要求2的核酸分子。
8.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与权利要求1的多肽特异性结合。
9.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1中限定的多肽、权利要求2中限定的核酸分子或权利要求8中限定的抗体，以及一种或多种可药用赋形剂和/或稀释剂。
10.权利要求9的组合物，其用于治疗中。
11.一种用于治疗或预防动物自体免疫病症、炎性病症或受损皮肤的方法，其中向所述动物给药一项或多项前述权利要求中描述的多肽、核酸分子、抗体或药物组合物。
12.—项或多项前述权利要求的多肽、核酸分子、抗体或药物组合物在制备治疗或预防动物自体免疫病症、炎性病症或受损皮肤的药物中的应用。
13.—项或多项前述权利要求的多肽、核酸分子、抗体或药物组合物，用于治疗或预防动物的自体免疫病症、炎性病症或受损皮肤。
14.权利要求11至13任一项的方法、应用、多肽、核酸分子、抗体或药物组合物，其中所述待治疗或预防的病症是皮肤的自体免疫或炎性病症或受损皮肤，其中所述多肽、核酸分子、抗体或组合物优选局部给药于皮肤。
15.权利要求14的方法、应用、多肽、核酸分子、抗体或药物组合物，其中所述待治疗或预防的病症是疮、溃疡、湿疹、痤疮、牛皮癣、胃肠炎症(优选为克罗恩病、溃疡性结肠炎和其他慢性炎症)、牙龈炎、口腔和食管的炎症或受损皮肤。
16.权利要求15的方法、应用、多肽、核酸分子、抗体或药物组合物，其中所述受损皮肤过敏或红肿、冻裂、晒伤、被辐射、热损伤或者是创伤。
17.—种产品，所述产品包含在一项或多项前述权利要求中限定的一种或多种多肽、核酸分子或抗体和一种或多种其他活性成分作为复合制剂，用于同时、分别或相继使用在人类或动物的治疗中。
18.权利要求11至17任一项的方法、应用、多肽、核酸分子、抗体、药物组合物或产品， 其中所述动物是哺乳动物，优选为人类。
全文摘要
本发明涉及一种被描述为凝集素的多肽、其编码核酸序列和针对多肽的抗体以及它们在各种医学应用中的用途，特别是在动物中治疗或预防自体免疫病症、炎性病症或受损皮肤。
文档编号C07K14/47GK102203127SQ200980143206
公开日2011年9月28日 申请日期2009年10月29日 优先权日2008年10月29日
发明者米卢舍·米夫塔里, 贝恩特·斯·沃瑟尔 申请人:卢科莱特公司