一种鸡白痢染色凝集抗原及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽医诊断技术领域，尤其涉及一种鸡白痢染色凝集抗原及其制备方法 和应用。
【背景技术】
[0002] 鸡白痢是严重危害养鸡业健康发展的重要疾病之一，可造成雏鸡较高的发病死亡 率，以及成年鸡生产性能降低。经蛋传播是该病的主要途径，因而对种鸡及其所产的蛋有计 划地进行检测，淘汰阳性鸡，培育无白痢种鸡群，切断垂直传播途径，是控制该病的关键所 在。国内外对种鸡鸡白痢的净化方法主要采取全血或血清玻板凝集试验，发现阳性鸡及时 淘汰，直至全群的阳性率不超过0. 1%为止。虽然我国已有用于检测鸡白痢的平板染色抗 原产品如"鸡白痢、鸡伤寒多价染色平板凝集试验抗原"，但该抗原在实际应用中存在敏感 度低、诊断速度慢、凝集图像不够清晰等缺陷，导致检测后的种鸡群不能达到彻底净化的目 标，给养殖者造成了严重的经济损失。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种鸡白痢染色凝集抗原及其制备方法，该抗原由鸡白痢 沙门氏菌SP7220、SP7701、SP8441和SP9905制成，用于在鸡白痢检测试剂中的用途。
[0004] 本发明具体通过以下技术方案实现： 一种鸡白痢染色凝集抗原，该抗原由鸡白痢沙门氏菌SP7220、SP7701、SP8441和 SP9905制成。鸡白痢沙门氏菌SP7220、SP7701、SP8441和SP9905是从历年来收集、保存的 500余株自然病例所分离的鸡白痢沙门氏菌菌种中，经多年反复筛选验证后获得的4株抗 原性好、变异率低的鸡白痢沙门氏菌菌种。
[0005]鸡白痢沙门氏菌 SP7220 (Salmonella pullorum SP7220)、SP7701 (Salmonella pullorum SP7701)、SP8441(Salmonella pullorum SP8441)、SP9905(Salmonella pullorum SP9905)已于2014年10月15日在中国典型培养物保藏中心（中国.武汉.武汉大学）保 藏，名称及鉴别特征：鸡白痢沙门氏菌（Salmonella pullorum)，株号：SP7220,保藏编号： CCTCC N0.M 2014476;鸡白痢沙门氏菌（Salmonella pullorum)，株号：SP7701，保藏编号： CCTCC N0.M 2014475;鸡白痢沙门氏菌（Salmonella pullorum)，株号：SP8441，保藏编号： CCTCC N0.M 2014477;鸡白痢沙门氏菌（Salmonella pullorum)，株号：SP9905,保藏编号： CCTCC NO. M 2014478。
[0006] 本发明提供了鸡白痢染色凝集抗原的制备方法，包括如下具体步骤： 1) 种子菌液的制备：将鸡白痢沙门氏菌SP7220、SP7701、SP8441和SP9905菌种分别经 液体培养基复苏繁殖后，接种固体平板培养基，37°C培养22h，挑选典型菌落接种固体斜面 培养基，37°C培养24h后用液体培养基洗下菌苔，再接种固体扁瓶培养基，37°C培养24h后 用液体培养基洗下菌苔检验合格后作为种子菌液； 2) 细菌培养：将种子菌液按培养基体积的4. 0%接种固体扁瓶培养基，经37°C培养48h 后取出，用含有0.3%福尔马林生理盐水洗下菌苔，经灭菌纱布过滤后收集菌液，置4°C过 夜灭活； 3)抗原制备：将灭活菌液经4000r/min离心15min去上清，用0. 2%福尔马林生理盐水 重新悬浮菌泥，将4个抗原生产菌种按比浊度调整菌液浓度至每毫升1. 2 X 101(ICFU，充分混 匀，用2. 0%结晶紫溶液按体积比1 :10加入上述菌液中，间隔2h后再加一次，加入后充分 混匀，于37°C放置24h充分染色后，无菌分装制成鸡白痢染色凝集抗原。
[0007] 本发明所述的液体培养基组成为：牛肉汤500ml、猪胃消化液500ml、甘油12. 0ml、 硫代硫酸钠5. 0g、柠檬酸钠3. 0g、硫酸锰0. 5g、硫酸镁0. 4g、硫酸亚铁0. lg、磷酸氢二钾 3. 5g、海藻糖12. 0g、水解乳蛋白5. 0g。所述的固体培养基通过液体培养基中加入1. 5%的 纯化琼脂粉制成。
[0008] 本发明方法所述的鸡白痢染色凝集抗原含有的细菌浓度为每毫升1.OX101(ICFU， 其中含有鸡白痢沙门氏菌SP7220、SP7701、SP8441和SP9905的细菌数量分别为40 %、25 %、 20% 和 15%。
[0009] 本发明还提供了上述鸡白痢染色凝集抗原在鸡白痢检测试剂中的用途。
[0010] 本发明还要求保护上述鸡白痢沙门氏菌SP7220、SP7701、SP8441和SP9905。
[0011] 本发明的有益效果为：本发明工艺方法简单合理、科学、生产稳定，成本低廉，选用 的鸡白痢染色凝集抗原生产菌种抗原性好、变异率低，制成的鸡白痢染色凝集抗原产品具 有敏感性高、特异性强、诊断快速、凝集图像清晰的优点。
【具体实施方式】
[0012] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施 例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示 的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明 的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
[0013] 实施例1。
[0014] 1)分离纯化与染色镜检 鸡白痢沙门氏菌SP9905株于1999年5月从江苏省扬州市某鸡场的11月龄狼山鸡盲 肠内容物中分离所得。其具体分离方法为：无菌采集盲肠内容物加入亚硒酸盐胱氨酸增菌 液中37 °C过夜培养，再接种麦康凯琼脂37 °C培养24小时，挑取直径为0. 5mm-l. 0mm、灰白色 透明、表面光滑的菌落，接种于马丁琼脂培养基，37°C培养24小时。将纯培养后的细菌进行 革兰氏染色镜检，然后用光学显微镜观察，呈两端稍圆的细长杆菌。
[0015] 鸡白痢沙门氏菌SP8441株于1984年12月从北京市某鸡场的6月龄白来航蛋鸡 输卵管中分离所得。其具体分离方法为：无菌剪取输卵管一小段加入营养肉汤中37°C过夜 培养，再接种于马丁琼脂培养基，37°C培养24小时。挑取直径为1. Omm-2. 0_、灰白色透明、 表面光滑的菌落，接种于马丁琼脂培养基，37°C培养24小时。将纯培养后的细菌进行革兰 氏染色镜检，然后用光学显微镜观察，呈两端稍圆的细长杆菌。
[0016] 鸡白痢沙门氏菌SP7701株于1977年2月从江苏省扬州市某鸡场死亡的白洛克雏 鸡肝脏中分离所得。其具体分离方法为：无菌采集死亡雏鸡的肝脏置营养肉汤中37°C过夜 培养后，再接种于马丁琼脂培养基，37°C培养24小时。挑取直径为1. Omm-2. 0_、灰白色透 明、表面光滑的菌落，接种于马丁琼脂培养基，37°C培养24小时。将纯培养后的细菌进行革 兰氏染色镜检，然后用光学显微镜观察，呈两端稍圆的细长杆菌。
[0017]鸡白痢沙门氏菌SP7220株于1972年11月从山东省青岛市某鸡场死亡的白来航 雏鸡肝脏中分离所得。其具体分离方法为：无菌采集死亡雏鸡的肝脏置营养肉汤中37°C过 夜培养后，再接种于马丁琼脂培养基，37°C培养24小时。挑取直径为1. Omm-2. 0_、灰白色 透明、表面光滑的菌落，接种于马丁琼脂培养基，37°C培养24小时。将纯培养后的细菌进行 革兰氏染色镜检，然后用光学显微镜观察，呈两端稍圆的细长杆菌。
[0018] 2)生化鉴定 从马丁琼脂平板上挑取菌落，进行生化鉴定试验。微量生化鉴定管购自杭州微生物试 剂有限公司，按照说明书进行操作。结果菌株的各项生化指标（见表1)均符合鸡白痢沙门 氏菌生化特性。
[0019] 表1鸡白痢沙门氏菌生化鉴定结果
【主权项】
1. 一种鸡白痢染色凝集抗原，其特征在于：由鸡白痢沙门氏菌SP7220、SP7701、SP8441 和SP9905制成，所述的鸡白痢沙门氏菌SP7220、SP7701、SP8441和SP9905均已于2014年 10月15日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号分别为：CCTCCNO.M2014476、CCTCC NO.M2014475、CCTCCNO.M2014477、CCTCCNO.M2014478。
2. 根据权利要求1所述的一种鸡白痢染色凝集抗原，其特征在于：所述的鸡白痢染 色凝集抗原含有的细菌浓度为每毫升I.OXIOltlCFU,其中含有鸡白痢沙门氏菌SP7220、 SP7701、SP8441 和SP9905 的细菌数量分别为 40%、25%、20% 和 15%。
3. -种鸡白痢染色凝集抗原的制备方法，其特征在于包括如下具体步骤： 1) 种子菌液的制备：将鸡白痢沙门氏菌SP7220、SP7701、SP8441和SP9905菌种分别经 液体培养基复苏繁殖后，接种固体平板培养基，37°C培养22h，挑选典型菌落接种固体斜面 培养基，37°C培养24h后用液体培养基洗下菌苔，再接种固体扁瓶培养基，37°C培养24h后 用液体培养基洗下菌苔检验合格后作为种子菌液； 2) 细菌培养：将种子菌液按培养基体积的4. 0%接种固体扁瓶培养基，经37°C培养48h 后取出，用含有0. 3%福尔马林生理盐水洗下菌苔，经灭菌纱布过滤后收集菌液，置4°C过夜 灭活； 抗原制备：将灭活菌液经4000r/min离心15min去上清，用0. 2%福尔马林生理盐水重 新悬浮菌泥，将4个抗原生产菌种按比浊度调整菌液浓度至每毫升I. 2XIOltlCFU的菌液浓 度后充分混匀，用2. 0%结晶紫溶液按体积比I: 10加入上述菌液中，间隔2h后再加一次，加 入后充分混匀，于37°C放置24h充分染色后，无菌分装制成鸡白痢染色凝集抗原。
4. 根据权利要求3所述的一种鸡白痢染色凝集抗原的制备方法，其特征在于： 所述的液体培养基组成为：牛肉汤500ml、猪胃消化液500ml、甘油12. 0ml、硫代硫酸钠
5. 〇g、柠檬酸钠3. 0g、硫酸锰0. 5g、硫酸镁0. 4g、硫酸亚铁0.lg、磷酸氢二钾3. 5g、海藻糖 12. 0g、水解乳蛋白5.Og;所述的固体培养基通过液体培养基中加入1. 5%的纯化琼脂粉制 成。
5. 权利要求1所述的鸡白痢染色凝集抗原在鸡白痢检测试剂中的应用。
6. 权利要求1所述的鸡白痢沙门氏菌SP7220。
7. 权利要求1所述的鸡白痢沙门氏菌SP7701。
8. 权利要求1所述的鸡白痢沙门氏菌SP8441。
9. 权利要求1所述的鸡白痢沙门氏菌SP9905。
【专利摘要】本发明公开了一种鸡白痢染色凝集抗原及其制备方法和应用，属于兽医诊断技术领域。该抗原是将鸡白痢沙门氏菌菌种SP7220、SP7701、SP8441和SP9905分别复苏传代后制成种子菌液，再将种子菌液接种固体培养基增殖，经福尔马林灭活后，通过比浊法调整菌液浓度，最后加入结晶紫溶液染色后充分混匀分装即制成鸡白痢凝集抗原。本发明工艺方法简单合理、科学、生产稳定，成本低廉，选用的鸡白痢染色凝集抗原生产菌种抗原性好、变异率低，制成的鸡白痢染色凝集抗原产品具有敏感性高、特异性强、诊断快速、凝集图像清晰的优点，是一种较为理想的检测鸡白痢的染色凝集抗原。CCTCC NO:M201447820141015CCTCC NO:M201447720141015CCTCC NO:M201447620141015CCTCC NO:M201447520141015
【IPC分类】G01N33-569, C12N1-20, C12R1-42
【公开号】CN104789500
【申请号】CN201510158394
【发明人】龚建森, 许明, 苗晋锋, 张笛, 顾蓓蓓, 朱春红, 窦新红, 刘学贤, 徐步, 童海兵, 邹剑敏
【申请人】江苏省家禽科学研究所
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年4月3日