专利名称：一种麦胚凝集素修饰的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，是一种麦胚凝集素修饰的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒制剂及其制备方法。
背景技术：
随着生活方式城市化进程的加快，哮喘患病率逐渐增高，这无疑将带来巨大的经济和社会负担。昔奈酸沙美特罗是一种长效肾上腺素受体激动剂，也是一个具有抗炎活性的支气管扩张药物，对夜间哮喘病患者具有较好的治疗作用，作为平喘、抗炎的首选药物， 它是近20多年来在哮喘治疗方面的首次重大突破，主要用于治疗哮喘病、慢性支气管炎和慢性阻塞性肺病。目前临床上常用的是一种昔奈酸沙美特罗气雾剂(昔奈酸沙美特罗气雾剂哈尔滨汇利药业有限公司)，其以吸入方式给药，药物吸入体内后，在肺部的保留与沉积量有限， 昔奈酸沙美特罗无法浓集于肺部发挥疗效，且给药间隔时间短，给药剂量大，容易产生毒副作用，对于在夜间发作或病情加重的哮喘病人非常不利。用纳米粒作药物载体，具有药物包封率高、缓释药物等优势。壳聚糖是甲壳素经脱乙酰化处理而得到的一种带正电荷的亲水性多糖，具有良好的生物相容性、可生物降解性和生物黏附特性，壳聚糖纳米粒已被广泛作为药物载体。壳聚糖纳米粒的常见制备方法有沉淀法、共价交联法、离子交联法和乳化溶剂扩散挥发法等，其中离子交联法(详见=Zheng AP, Wang JC, Lu WL,et al. Thymopentin-Ioaded pH-sensitive chitosan nanoparticles for oral administration !preparation, characterization, and pharmacodynamics. J Nanosci Nanotechnol，2006，6 (9-10) :2936-2944.)是利用无毒副作用的多聚磷酸钠对壳聚糖进行离子诱导凝胶化而制备纳米粒的一种方法，该反应条件温和，不使用任何有机溶剂。但至今未见将昔奈酸沙美特罗制备成纳米粒制剂的报道。凝集素是一种非免疫源性的糖蛋白或糖特异体，特别是源于麦胚的植物性麦胚凝集素几乎无免疫原性。凝集素可选择性识别细胞膜表面糖分子或受体样结构，从而同糖基化生物膜结合，因此，凝集素修饰的药物载体系统可经细胞黏附作用介导，有利于突破上皮生物膜屏障(详见=(I)Lis H，Sharon N. Lectins as molecules and as tools [J]. Annual Review of Biochemistry，1986，55 :35-67. (2)Ezpeleta I，Arangoa MA, Irache JM, et al. Preparation of Ulex europaeus lectin—gliadin nanoparticle conjugates and their interaction with gastrointestinal mucus[J]. Int J Pharm, 1999,191 :25-32. (3)Sharma A，Sharma S，Khuller GK.Lectin-functionalized poly(lactide-co-glycolide)nanoparticles as oral/aerosolized antitubercular drug carriers for treatment of tuberculosis[J]. J Antimicrob Chemother，2004，54 : 761-766. (4)Fei YB, Li FQ, Li L，et al. Lectin-modified transmucosal microspheres drug delivery system [J]. Pharm Care&Ites (药学服务与研究)，2010，10 :142-145.)。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有长效、控释、靶向及时辰药理调控作用的麦胚凝集素修饰的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒制剂。本发明以三聚磷酸钠为交联剂，采用离子交联法制备昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒；并利用肺泡上皮存在特异性糖受体N-乙酰葡萄糖胺的特点，将昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒进行麦胚凝集素化修饰，制成麦胚凝集素修饰的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒，以便通过麦胚凝集素同肺泡上皮的特异性糖受体N-乙酰葡萄糖胺结合，使昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒具有导向肺泡膜的靶向性。本发明制剂的制备方法如下一、组分与配比
昔奈酸沙美特罗 l~500mg壳聚糖 IOO-IOOOmg三聚磷酸钠20~300mg 麦胚凝集素 0.1~40mg优选
昔奈酸沙美特罗 10~200mg壳聚糖200~500mg 三聚磷酸钠 40-150mg麦胚凝集素 4~20mg二、制备步骤1)制备壳聚糖溶液按配比将壳聚糖分散于适量0.05 (ν/ν)稀醋酸水溶液(优选0. 1 0.5% (ν/ν)稀醋酸水溶液)中，隔夜溶胀，制成壳聚糖溶液；2)制备三聚磷酸钠溶液按配比将三聚磷酸钠溶于适量蒸馏水中，混勻即得三聚磷酸钠溶液；3)制备昔奈酸沙美特罗溶液在40°C左右加热的条件下，按配比将昔奈酸沙美特罗溶于适量乙醇中，得到昔奈酸沙美特罗溶液；4)按配比将幻中的昔奈酸沙美特罗溶液分散于2、中的三聚磷酸钠溶液中，制成含昔奈酸沙美特罗的三聚磷酸钠溶液；或者，按配比将幻中的昔奈酸沙美特罗溶液分散于1)中的壳聚糖溶液中，制成含昔奈酸沙美特罗的壳聚糖溶液；5)制备昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒胶体液
在持续磁力搅拌下，按配比将幻中的三聚磷酸钠溶液缓慢滴加于4)中的含昔奈酸沙美特罗的壳聚糖溶液中，反应10分钟，即得昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒胶体液；或者，在持续磁力搅拌下，按配比将4)中的含昔奈酸沙美特罗的三聚磷酸钠溶液缓慢滴加于1)中的壳聚糖溶液中，反应10分钟，即得昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒胶体液；上述制得的为昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒制剂(其未经麦胚凝集素修饰)；6)活化昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒的表面氨基按配比向幻中的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒胶体液中加入适量0. 1 (ν/ ν)戊二醛水溶液(优选0. 2 0. 5% (ν/ν)戊二醛水溶液)，混合振摇使昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒的表面氨基活化，用磷酸盐缓冲液(ρΗ 7.4)分离未反应的戊二醛，高速离心后弃去上清液中多余的戊二醛(以防止其交联凝集素)，得表面氨基已活化的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒胶体液；7)制备麦胚凝集素溶液按配比将麦胚凝集素溶于适量磷酸盐缓冲液(ρΗ 7. 4)中，得到麦胚凝集素溶液；8)制备麦胚凝集素修饰的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒制剂将7)中的麦胚凝集素溶液加入到6)中的表面氨基已活化的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒胶体液中，漩涡混勻，在室温下共孵育M小时，高速离心后弃去上清液中未结合的麦胚凝集素，即得麦胚凝集素修饰的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒制剂。本方法还可以用于其他药物的麦胚凝集素修饰的壳聚糖纳米粒制剂的制备。经激光粒度分析仪检测，本发明制备的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒粒径范围为 200 300nm，透射电镜结果显示纳米粒外观圆整规则。体外糖结合试验结果表明，本发明制得的麦胚凝集素修饰的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒具有导向肺泡膜的优势，从而可减少给药剂量，降低毒副作用；药物的缓释使药物在肺部维持的有效浓度时间长，增强治疗效果。本发明制剂可用于制备治疗哮喘病、慢性支气管炎或慢性阻塞性肺病的药物。
具体实施例方式现结合实施例，对本发明作详细描述实施例1制备麦胚凝集素修饰的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒制剂1)将壳聚糖150mg溶于IOOmL 0. 2%的稀醋酸水溶液中，得壳聚糖溶液；2)在40°C加热的条件下，将5mg昔奈酸沙美特罗(武汉易泰科技有限公司，下同) 溶于Iml无水乙醇中，得昔奈酸沙美特罗的乙醇溶液；3)将25mg三聚磷酸钠溶于15ml蒸馏水中，并向其中加入昔奈酸沙美特罗的乙醇溶液，得含昔奈酸沙美特罗的三聚磷酸钠溶液；4)在600转/分钟的持续磁力搅拌下，将含昔奈酸沙美特罗的三聚磷酸钠溶液缓慢滴加于壳聚糖溶液中，持续搅拌10分钟，即得昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒胶体液；5)向昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒胶体液中加入:3ml 0. 1% (ν/ν)的戊二醛水溶液，振摇混合6小时，以活化壳聚糖纳米粒表面的氨基，然后用磷酸盐缓冲液(ρΗ 7. 4，下同)分离未反应的戊二醛，高速离心(10000rpm，30分钟，下同)并弃去上清液中多余的戊
6)取麦胚凝集素(wheat germ agglutinin，Medicago，下同)2mg，溶于 ImL磷酸盐缓冲液(PH 7. 4，下同)中，将该麦胚凝集素溶液加入到上述表面氨基活化后的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒胶体液中，漩涡混勻，于室温条件下孵育M小时，高速离心(lOOOOrpm， 30分钟，下同)后弃去上清液中未结合的麦胚凝集素，收集下层的胶体液，即得麦胚凝集素修饰的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒制剂。实施例2制备麦胚凝集素修饰的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒制剂1)将壳聚糖500mg溶于IOOmL 0. 5%的稀醋酸水溶液中，得壳聚糖溶液；2)在40°C加热的条件下，将50mg昔奈酸沙美特罗溶于2ml无水乙醇中，得昔奈酸沙美特罗的乙醇溶液，并将其加入壳聚糖溶液中，得含昔奈酸沙美特罗的壳聚糖溶液；3)将IOOmg三聚磷酸钠溶于15ml蒸馏水中，得三聚磷酸钠溶液；4)在600转/分钟的持续磁力搅拌下，将三聚磷酸钠溶液缓慢滴加于含昔奈酸沙美特罗的壳聚糖溶液中，持续搅拌10分钟，即得昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒胶体液；5)向昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒胶体液中加入:3ml 0.3% (ν/ν)的戊二醛水溶液，振摇混合6小时，以活化壳聚糖纳米粒表面的氨基，然后用磷酸盐缓冲液分离未反应的戊二醛，高速离心并弃去上清液中多余的戊二醛；6)取麦胚凝集素10mg，溶于2mL磷酸盐缓冲液中，将该麦胚凝集素溶液加入到上述表面氨基活化后的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒胶体液中，漩涡混勻，于室温条件下孵育M小时，高速离心后弃去上清液中未结合的麦胚凝集素，收集下层的胶体液，即得麦胚凝集素修饰的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒制剂。实施例3制备麦胚凝集素修饰的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒制剂1)将壳聚糖900mg溶于IOOmL 0. 8%的稀醋酸水溶液中，得壳聚糖溶液；2)在40°C加热的条件下，将300mg昔奈酸沙美特罗溶于20ml无水乙醇中，得昔奈酸沙美特罗的乙醇溶液；3)将200mg三聚磷酸钠溶于15ml蒸馏水中，并向其中加入昔奈酸沙美特罗的乙醇溶液，得含昔奈酸沙美特罗的三聚磷酸钠溶液；4)在600转/分钟的持续磁力搅拌下，将含昔奈酸沙美特罗的三聚磷酸钠溶液缓慢滴加于壳聚糖溶液中，持续搅拌10分钟，即得昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒胶体液；5)向昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒胶体液中加入:3ml 0.6% (ν/ν)的戊二醛水溶液，振摇混合6小时，以活化壳聚糖纳米粒表面的氨基，然后用磷酸盐缓冲液分离未反应的戊二醛，高速离心并弃去上清液中多余的戊二醛；6)取麦胚凝集素30mg，溶于3mL磷酸盐缓冲液中，将该麦胚凝集素溶液加入到上述表面氨基活化后的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒胶体液中，漩涡混勻，于室温条件下孵育M小时，高速离心后弃去上清液中未结合的麦胚凝集素，收集下层的胶体液，即得麦胚凝集素修饰的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒制剂。体外释药试验将实施例2制备的麦胚凝集素修饰的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒制剂与昔奈酸沙美特罗原药进行体外释药时间的对比实验，实验过程如下1)将一定量的麦胚凝集素修饰的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒制剂和昔奈酸沙美特罗原药分别于透析袋中，两端扎紧，分别置于两个具塞广口瓶中；
2)向上述两个具塞广口瓶中分别加入IOOml 0. 5%十二烷基硫酸钠溶液(w/v)作为释放介质，于37°C恒温摇床上振荡，转速为120r · mirT1 ；3)分别于511^11、151^11、301^11、111、211、411、611、811、1011、1211和 18h 定时取样，每次取样1ml，补加同体积上述释放介质；4)将各取样液分别经0. 22 μ m微孔滤膜过滤，取续滤液高效液相色谱进样，由标准曲线计算昔奈酸沙美特罗浓度，得到药物累计释放度。体外释药试验结果昔奈酸沙美特罗原药4h的体外累计释药百分数为72. 62%， 12h时达到94. 31%，有效作用时间为12h ；而本发明制得的麦胚凝集素修饰的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒4h的体外累计释药百分数为51. 05%,18h时达到89. 16%，有效作用时间可达到18h以上。表明本发明制得的麦胚凝集素修饰的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒具有明显的缓释效果。实施例1和3制备的纳米粒制剂实验方法同上，结果基本相一致。体夕卜释药实验方法详见:Lin AH, Liu YM, Ping QN. Free amino groups on the surface of chitosan nanoparticles and its characteristics[J]. Acta Pharm Sin( 学学报)，2007,42 :323-328o体外糖结合试验将实施例2制备的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒制剂与麦胚凝集素修饰的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒制剂进行体外糖结合的对比实验，牛颂下腺粘蛋白可以与凝集素结合，以牛颂下腺粘蛋白为底物，在昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒制剂和麦胚凝集素修饰的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒制剂分别与底物牛颂下腺粘蛋白共孵育一定时间后，分别测定其对牛颂下腺粘蛋白的结合率；再加入竞争抑制剂N-乙酰葡萄糖胺，共孵育一定时间后，再次分别测定两种制剂与牛颂下腺粘蛋白的结合率，通过加入N-乙酰葡萄糖胺前后麦胚凝集素修饰的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒制剂与底物牛颂下腺粘蛋白结合率的变化来说明麦胚凝集素修饰的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒制剂具有与N-乙酰葡萄糖胺结合的特异性。实验过程如下1)分别将昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒制剂5ml和麦胚凝集素修饰的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒制剂5ml，与含200 μ g的牛颂下腺粘蛋白的磷酸盐缓冲液Iml室温共孵育3h，离心(lOOOOrpm, 15min)后取上清液；2)采用凝胶色谱分析法(详见Usui S, Mizuno Τ, Okazaki Μ, et al. Evaluation of a gel-permeation high-performance liquid chromatography for determining triglyceride levels in serum major lipoproteins, compared with the u 1 tracentrifugation/precipitation method [J]. Clin Biochem, 2009,42 :114-117.) 贝Ij 定上清液中未结合的牛颂下腺粘蛋白量，根据测定值和加入总量的差值，计算上述两份制剂对牛颂下腺粘蛋白的结合率，结果昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒同牛颂下腺粘蛋白的结合率为55%，麦胚凝集素修饰后的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒同牛颂下腺粘蛋白的结合率为88. 32% ；3)再向上述两份制剂中各加入10 μ mol N-乙酰葡萄糖胺，经漩涡混勻，放置汕使结合反应达平衡；4)离心(lOOOOrpm，15min)后，采用凝胶色谱分析法再次测定上清液中未结合的牛颂下腺粘蛋白量，根据测定值和加入总量的差值，计算上述两份制剂对牛颂下腺粘蛋白的结合率，结果昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒同牛颂下腺粘蛋白的结合率为M%，麦胚凝集素修饰后的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒同牛颂下腺粘蛋白的结合率为63. 86%。实验结果表明加入N-乙酰葡萄糖胺后，昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒同牛颂下腺粘蛋白的结合率与不加N-乙酰葡萄糖胺时同牛颂下腺粘蛋白的结合率相比几乎没有变化，而麦胚凝集素修饰后的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒同牛颂下腺粘蛋白的结合率较不加N-乙酰葡萄糖胺时同牛颂下腺粘蛋白的结合率显著下降，由88. 32%降至63. 86%，说明麦胚凝集素修饰后的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒可以与加入的N-乙酰葡萄糖胺结合， 表明麦胚凝集素同牛颂下腺粘蛋白的结合作用可以被N-乙酰葡萄糖胺竞争抑制，反映出麦胚凝集素修饰后的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒对N-乙酰葡萄糖胺的糖结合特异性， 所以麦胚凝集素修饰后的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒可富集于肺泡膜，从而达到靶向肺部的效果。实施例1和3制备的纳米粒制剂实验方法同上，结果基本相一致。本发明制备工艺简单，经麦胚凝集素修饰后的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒制剂可以与肺泡上皮特异性糖受体N-乙酰葡萄糖胺结合，促进药物在肺泡膜的聚集，从而达到靶向肺部的效果，提高药物生物利用度，减少给药剂量，降低毒副作用。
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权利要求
1. 一种麦胚凝集素修饰的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒制剂，组分与配比如下
2.按权利要求1所述的麦胚凝集素修饰的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒制剂，其特征在于组分与配比如下
3.权利要求1或2所述麦胚凝集素修饰的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒制剂的制备方法，步骤如下1)制备壳聚糖溶液按配比将壳聚糖分散于0.05 (ν/ν)稀醋酸水溶液中，隔夜溶胀，制成壳聚糖溶液；2)制备三聚磷酸钠溶液按配比将三聚磷酸钠溶于适量蒸馏水中，混勻即得三聚磷酸钠溶液；3)制备昔奈酸沙美特罗溶液在加热的条件下，按配比将昔奈酸沙美特罗溶于适量乙醇中，得到昔奈酸沙美特罗溶液；4)按配比将昔奈酸沙美特罗溶液分散于幻中，制成含昔奈酸沙美特罗的多聚磷酸钠溶液；或者，按配比将昔奈酸沙美特罗溶液分散于1)中，制成含昔奈酸沙美特罗的壳聚糖溶液；5)制备昔奈酸沙美特罗的壳聚糖纳米粒胶体液在持续磁力搅拌下，按配比将幻溶液缓慢滴加于4)中的含昔奈酸沙美特罗的壳聚糖溶液中，反应10分钟，即得昔奈酸沙美特罗的壳聚糖纳米粒胶体液；或者，在持续磁力搅拌下，按配比将4)中的含昔奈酸沙美特罗的多聚磷酸钠溶液滴加入1)液中，反应10分钟，即得昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒胶体液；6)活化昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒的表面氨基按配比向幻中制得纳米粒胶体液中加入适量0. 1 (ν/ν)戊二醛水溶液，混合振摇使壳聚糖纳米粒的表面氨基活化，用磷酸盐缓冲液分离未反应的戊二醛，高速离心后弃去上清液中多余的戊二醛，得表面氨基已活化的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒胶体液；7)制备麦胚凝集素溶液昔奈酸沙美特罗壳聚糖三聚磷酸钠麦胚凝集素20~300mg 0.1~40mgl~500mg IOO-IOOOmg昔奈酸沙美特罗壳聚糖三聚磷酸钠麦胚凝集素10~200mg 200~500mg 40-150mg 4~20mg按配比将麦胚凝集素溶于磷酸盐缓冲液中，得到麦胚凝集素溶液； 8)制备麦胚凝集素修饰的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒制剂将麦胚凝集素溶液加入上述表面氨基已活化的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒胶体液中，漩涡混勻，在室温下共孵育M小时，高速离心后弃去上清液中未结合的凝集素，即得麦胚凝集素修饰的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒制剂。
4.按权利要求3所述的麦胚凝集素修饰的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒制剂的制备方法，其特征在于制备壳聚糖溶液时将壳聚糖分散于0. 1 0. 5% (ν/ν)稀醋酸水溶液中， 活化昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒的表面氨基时，戊二醛水溶液的浓度为0. 2 0. 5% (ν/ν) O
5.权利要求1或2所述麦胚凝集素修饰的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒制剂在制备治疗哮喘病、慢性支气管炎或慢性阻塞性肺病药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及医药技术领域，是一种麦胚凝集素修饰的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒制剂及其制备方法。本发明采用离子交联法制备昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒；并利用肺泡上皮存在特异性糖受体N-乙酰葡萄糖胺的特点，制成麦胚凝集素修饰的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒，以便通过麦胚凝集素同肺泡上皮的特异性糖受体N-乙酰葡萄糖胺结合，使昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒具有导向肺泡膜的靶向性。体外糖结合试验结果表明，麦胚凝集素修饰的昔奈酸沙美特罗壳聚糖纳米粒具有导向肺泡膜的优势，从而可减少给药剂量，降低毒副作用；药物的缓释使药物在肺部维持的有效浓度时间长，增强治疗效果。本发明制剂可用于制备治疗哮喘病、慢性支气管炎或慢性阻塞性肺病的药物。
文档编号A61K47/48GK102406615SQ20111036176
公开日2012年4月11日 申请日期2011年11月15日 优先权日2011年11月15日
发明者李凤前, 李慧, 毕娟, 钱之光 申请人:上海市第八人民医院