专利名称：凝集素及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及化合物、其发现方法及其治疗和研究用途。具体地，本发明提供了抗病毒和抗微生物的凝集素化合物及其使用方法。
背景技术：
获得性免疫缺陷综合征或后天免疫缺陷综合征(AIDS或Aids)是由在人中的人免疫缺陷病毒(HIV)(参见例如，Marx，J. L. (1982) Science 217(4560) :618-621 ;通过引用整体并入本文)以及在其他物种中的类似病毒(SIV、FIV、等)引起的对免疫系统的特定损害所导致的症状和感染的总称。病症晚期使个体容易发生机会感染和肿瘤。尽管存在延缓病毒进展的针对AIDS和HIV的治疗，但是已知没有治愈。HIV通过粘膜或血流与含有HIV的体液直接接触而传播，所述体液例如血液、精液、阴道液、尿道球腺液和乳汁。这种传播可以通过肛交、阴道性交或口交、输血、污染的注射针头、怀孕、分娩或母乳喂养期间的母婴交换或者与上述体液之一的其他接触的形式发生。在没有抗逆转录病毒疗法时，从HIV感染发展成AIDS的中值时间是9至10年，并且发生AIDS之后的中值存活时间只有9. 2个月(参见例如，Morgan等，(2002) AIDS 16(4)597-632 ;通过引用整体并入本文)。高度活性抗逆转录病毒疗法的使用延长了发展成AIDS的中值时间和中值存活时间。目前没有针对HIV或AIDS的疫苗或治愈疗法。唯一已知的预防方法是基于避免与病毒接触，或者如果做不到这点，则在非常明显的接触之后立即进行抗逆转录病毒治疗，称为接触后预防(PEP)。PEP具有非常苛刻的四周剂量方案。它还具有非常令人厌恶的副作用，包括腹泻、不适、恶心和疲劳。需要用于治疗HIV和AIDS的改良方法。发明概述本发明涉及化合物、其发现方法及其治疗和研究用途。具体地，本发明提供了抗病毒和抗微生物的凝集素化合物及其使用方法。在一些实施方案中，本发明提供了具有降低的或低的促有丝分裂性的抗病毒凝集素化合物及其使用方法。在一些实施方案中，本发明提供了包含BanLec多肽(例如，变体BanLec多肽)(例如，以分离的或纯化的形式)的组合物，其中所述BanLec多肽表现出抗病毒活性但是表现出相对于野生型BanLec降低的促有丝分裂活性(例如，相对于野生型BanLec或其他凝集素，促有丝分裂活性降低至少10%、至少20%、至少50%、至少75%、至少85%、至少90%、至少95%等)。在一些实施方案中，例如，BanLec多肽是SEQ ID NO:1-3所描述的多肽，或者由SEQ ID NO :4-6所描述的核酸或其他适合的核酸序列编码。在一些实施方案中，BanLec多肽在位置84包含从野生型的突变。在一些实施方案中，例如，组氨酸84被突变为苏氨酸(H84T)、丝氨酸(H84S)或甲硫氨酸(H84M)。在一些实施方案中，例如，BanLec多肽是SEQ ID NO 7所描述的多肽，或者由SEQ ID NO 8所描述的核酸或其他适合的核酸序列编码。在一些实施方案中，BanLec多肽在位置83包含从野生型的突变。在一些实施方案中，例如，酪氨酸83被突变为缬氨酸(Y83V)。在一些实施方案中，BanLec多肽包含Y83V突变或H84T、H84S和H84M的一个或多个。在一些实施方案中，本发明提供了抗病毒、抗微生物和/或抗菌的组合物。在一些实施方案中，本文提供的组合物是全身的、区域的、局部的等(例如，局部抗病毒组合物)。本发明的实施方案提供了包含编码BanLec多肽的核酸的表达载体(例如，包含纯化标签)以及包含所述表达载体的宿主细胞。在一些实施方案中，本发明提供了预防病毒(例如，HIV)、细菌(例如，幽门螺杆菌(helobacter pilori))和/或寄生虫(例如，婴儿利什曼原虫(Leshmania infantum))感染的方法,包括使疑似包含病毒、细菌或寄生虫的表面与前述组合物接触。在一些实施方案中，本发明提供了治疗被诊断有病毒感染(例如，HIV)、细菌感染(例如，幽门螺杆菌)和/或寄生虫感染(例如，婴儿利什曼原虫)的 受治疗者的方法，包括向受治疗者施用前述组合物。在一些实施方案中，本发明提供了治疗或预防病毒感染的组合物和方法，所述病毒包括但不限于HIV、HCV、登革病毒、马堡病毒(Marburg virus)、依波拉病毒(Ebola virus)、西尼罗河病毒(West Nile virus)、巨细胞病毒、疱疹病毒(例如，8型)、冠状病毒(例如，SARS)和麻疹病毒。在一些实施方案中，本发明提供了治疗或预防细菌感染的组合物和方法，所述细菌包括但不限于结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、牛分支杆菌(Mycobacteriumbovis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)(例如，血清型 3 和14)、幽门螺杆菌和乳酸杆菌(Lactobacillus spp)。在一些实施方案中，本发明提供了治疗或预防寄生虫感染的组合物和方法，所述寄生虫包括但不限于婴儿利什曼原虫、皮氏利什曼原虫(Leshmania pifanoi)、墨西哥利什曼原虫(Leshmania mexicana)和曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)寄生虫。在一些实施方案中，本发明提供了治疗或预防真菌感染的组合物和方法，所述真菌包括但不限于烟曲霉(Aspergillus fumigatus)和白色念珠菌(Candida albicans)。在一些实施方案中,本发明提供了治疗或预防其表面具有甘露糖的任何微生物的感染的组合物和方法。在一些实施方案中,本发明的组合物(例如，BanLec和/或BanLec突变体)与微生物表面上的甘露结合糖。在一些实施方案中，本发明提供了治疗或预防与DC-SIGN受体相互作用的微生物的感染的组合物和方法。附图简述
图1显示了 H84T的促有丝分裂活性。图2显示了突变体H84S、H84M、H84Y和H84A的促有丝分裂活性。图3显示了天然BanLec和重组BanLec的抗HIV-1活性的比较。在HIV-1分离株YU2 (A)或90CF402(B)感染之前30分钟，向TZM_bl细胞添加从香蕉果实分离的天然BanLec或从大肠杆菌分离的重组BanLec。病毒孵育后48小时，通过测量荧光素酶活性来定量感染。(C)BanLec与其他凝集素的促有丝分裂活性比较。图4显示H84T的性质。(A)H84T与rBanLec的促有丝分裂活性比较。(B)如通过流式细胞术测量的，在BanLec或H84T BanLec存在下⑶4T细胞上活化标记⑶69的诱导。(C)通过Banlec和H84TBanlec诱导细胞因子/趋化因子。(D)H84T保留抗HIV-1活性。图5显示重组BanLec的表达。重组BanLec的纯化的考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶。凝胶泳道如下加样1 :分子量标准，2 :含有重组BanLec的裂解物，3 :柱负载穿流，4 :25mM咪唑洗涤，5 :第一次250mM咪唑洗脱，6 :第二次250mM咪唑洗脱，7 :香蕉来源的BanLec,8 :用于细胞裂解步骤的溶菌酶蛋白。图6显示BanLec抑制含有共有亚型B和亚型C包膜的HIV-1。图7显示BanLec和BanLec H84T的三维晶体结构的比较。图8显示与α -甲基D-甘露糖苷结合时，BanLec WT与Η84Τ的结构运动的差异。(Α.)未结合的BanLec (插入，WT和Η84Τ的重叠)和(B.)在α -甲基D-甘露糖苷存在下(插入，WT和Η84Τ的重叠)的1Η-15Ν HSQC光谱的峰强度相关性。
图9显示了变体BanLec肽的序列。定义为了方便理解本发明，以下定义了许多术语和短语。如本文使用的，术语“受治疗者”指将通过本发明的实施方案的方法治疗的生物。此类生物优选地包括但不限于哺乳动物(例如，鼠、猴、马、牛、猪、犬、猫等)，并且最优选地包括人。在本发明上下文中，术语“受治疗者”一般指将接受或已经接受针对特征为微生物感染或者微生物感染风险的病症的治疗(例如，施用本发明的肽和任选一种或多种其他药剂)的个体。如本文使用的，术语“诊断”指通过其体征和症状(例如，抵抗传统疗法)或者遗传分析、生理分析、组织分析、诊断测定(例如，针对微生物感染)等识别疾病。如本文使用的，术语“体外”指人工环境以及发生在人工环境中的过程或反应。体外环境包括但不限于试管和细胞培养物。术语"体内"指天然环境(例如，动物或细胞)和发生在天然环境中的过程或反应。如本文使用的，术语“宿主细胞”指无论是位于体外还是体内的任何真核或原核细胞(例如，哺乳动物细胞、禽细胞、两栖动物细胞、植物细胞、鱼细胞和昆虫细胞)。如本文使用的，术语"细胞培养物"指细胞的任何体外培养物。该术语包括连续传代细胞系(例如，具有不变的表型)、原代细胞培养物、有限细胞系(例如，非转化的细胞)和体外维持的任何其他细胞群，包括卵母细胞和胚胎。如本文使用的，术语“有效量”指足以实现有益或期望结果的治疗剂(例如，本发明的肽)的量。有效量可以通过一个或多个施用、应用或剂量来施用，并且不意图限于特定的制剂或施用途径。如本文使用的，术语“联合施用”指向受治疗者施用至少两种药剂(例如，本发明的肽)或疗法。在一些实施方案中，两种或多种药剂/疗法的联合施用是共时的。在一些实施方案中，第一药剂/疗法在第二药剂/疗法之前施用。本领域技术人员理解，使用的各种药剂/疗法的制剂和/或施用途径可以变化。本领域技术人员可以容易地确定联合施用的适当剂量。在一些实施方案中，当联合施用药剂/疗法时，各药剂/疗法以低于适合它们单独施用时的剂量施用。因此，在其中药剂/疗法的联合施用降低已知潜在有害(例如，毒性)药剂的必需剂量的实施方案中特别需要联合施用。如本文使用的，术语“毒性”指与施用毒剂之前的相同细胞或组织相比，对细胞或组织的任何伤害或有害效应。如本文使用的，术语“药物组合物”指活性剂与惰性或活性载体的组合，使得组合物特别适合体内、体内或离体的诊断或治疗用途。如本文使用的，术语“药学可接受的载体”指任何标准的药物载体，例如磷酸盐缓冲的盐水溶液、水、乳状液(例如，油/水或水/油乳状液)和各种类型的润湿剂。组合物还可以包含稳定剂和防腐剂。有关载体、稳定剂和佐剂的实例(参见例如，Martin，Remington' sPharmaceutical Sciences,第 15 版，Mack Publ. Co. , Easton,PA[1975])。如本文使用的，术语“样本”以其最广泛的含义使用。样本可以包括细胞、组织或从细胞(例如，微生物)分离的液体、核酸或多肽等。如本文使用的，术语"纯化的"或"纯化"指从样本去除不想要的组分。如本文使用的，术语"基本上纯化的"指至少60%、优选75%和最优选90%或更多没有通常与之相伴的其他组分。如本文使用的，术语“调节”指化合物(例如，本发明的化合物)影响(例如，杀伤或防止生长)微生物的活性。"氨基酸序列"和诸如"多肽"或"蛋白质"的术语不意味着将氨基酸序列限于与所提蛋白质分子有关的完全天然的氨基酸序列。如本文使用的，术语"天然蛋白质"指不含由载体序列编码的氨基酸残基的蛋白质；即，天然蛋白质仅含有该蛋白质天然存在时存在的那些氨基酸。天然蛋白质可以通过重组方式产生，或者可以从天然存在的来源分离。如本文使用的，当提及蛋白质(如在"给定蛋白质的一部分"中)时，术语"蛋白质"指该蛋白质的片段。片段大小范围可以从4个氨基酸残基至完整氨基酸序列减去I个
氨基酸。
术语“测试化合物”指可用于治疗或预防身体功能的疾病、不健康状态、病态或疾患或者以其他方式改变样本(例如，微生物感染)的生理或细胞状态的任何化学实体、药剂、药物等。测试化合物包括已知和可能的治疗化合物。可以通过利用本发明的筛选方法来确定测试化合物是治疗性的。“已知的治疗化合物”指已经显示(例如，通过动物试验或之前施用给人的经验)在这种治疗或预防中有效的治疗化合物。发明详述本发明涉及化合物、其发现方法及其治疗和研究用途。具体地，本发明提供了抗病毒和抗微生物的凝集素化合物及其使用方法。称为BanLec的凝集素分离自香蕉(小果野蕉(Musa acuminate)品种)的成熟果实，以分子量大约30kDa的二聚体存在。它是木菠萝相关凝集素家族(jacalinrelatedlectin family)的成员，并且可以识别高甘露醇结构。该家族凝集素的特征为存在由三个希腊钥匙(Greek Key)转角基序构成的β _棱柱I结构。希腊钥匙I和2都参与结合糖类，并且含有GXXXD结合基序，而钥匙3不含有该结合基序。然而，该环可以帮助配体结合并决定凝集素特异性。BanLec具有许多使它有望发展成为杀菌剂组分的性质，包括高稳定性、广谱的抗HIV活性和在大肠杆菌中生成的能力。此外，BanLec已经被许多人经常食用，并且这可以导致口服耐受性，证据是报道的IgG4抗体对BanLec的反应(致耐受性的)。已经显示BanLec作为抗HIV治疗剂或杀菌剂(例如，阴道或直肠杀菌剂)的组分具有治疗效用。然而，存在有关凝集素的促有丝分裂活性和炎性活性的安全性顾虑。在本发明的实施方案发展期间，通过产生BanLec变体H84T而解决了这些顾虑，H84T保留了抗HIV-1活性但展示了非常明显降低的促有丝分裂活性和促炎活性。BanLec是HIV感染的有效抑制剂，其显著减少一系列HIV-1分离株的复制(Swanson等，J. Biol. Chem. 285 :8646(2010);通过引用整体并入本文)。本发明实施方案发展期间进行的实验证明了 BanLec活性。本发明的实施方案提供了改变的BanLec序列(例如，SEQ ID NO :1_6)或其活性片段。改变BanLec的氨基酸序列以降低其促有丝分裂活性，同时维持有效的抗HIV活性。通过使用可商购的定点诱变试剂盒，将突变引入含有编码BanLec的DNA序列的表达载体。通过DNA测序证实突变，并表达和纯化得到的突变体。然后测试纯化的突变体的促有丝分裂活性。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了其中促有丝分裂性已经与抗HIV性质分开的凝集素。本发明使用BanLec凝集素示例说明。然而，本发明不限于BanLec。本发明的实施方案提供了具有降低或消除的促有丝分裂性同时保留有用的治疗性质的其他凝集素(例如，来自其他物种)。本发明不限于本文描述的BanLec突变体(例如，SEQ ID NO :1_8)。导致促有丝分裂性降低或减少同时保留抗病毒性质的任何突变包括在本发明范围内。在一些实施方案中，本发明提供了表现出相对于野生型BanLec降低的促有丝分裂活性的变体BanLec多肽(例如，相对于野生型BanLec或其他凝集素，促有丝分裂活性降低至少10%、至少20%、至少50%、至少75%、至少85%、至少90%、至少95%等)。本文描述的突变体BanLec凝集素可用于多种应用。例如，在一些实施方案中，非促有丝分裂的BanLec多肽(例如，SEQ ID NO 1-3)可用于治疗病毒感染(例如，HIV)的治疗组合物。在一些实施方案中，非促有丝分裂的BanLec多肽用于与已知的HIV治疗剂组合(例如，作为治疗性混合物的部分)。本领域普通技术人员熟知如何配制这种治疗性混合物。在一些实施方案中，将BanLec组合物(例如，SEQ ID NO :1_3和7)用作局部抗病毒组合物的组分(例如，以杀伤HIV并因此预防感染)。例如，在一些实施方案中，BanLec (例如，通过SEQ ID NO :1_3和7所描述的那些)包含在制剂中用作阴道抗病毒剂(例如，与含有或疑似含有HIV的体液(例如，精液)接触之前或之后使用)。在一些实施方案中，使用包含BanLec的抗病毒制剂来处理避孕套、性用具或可能与含有HIV或其他致病病毒的体液接触的其他物体。本发明不限于HIV的治疗或杀伤。因为BanLec通过与病毒包膜上的糖结合而抑制病毒复制，它可用于预防或治疗人、动物和植物的其他病毒感染。在一些实施方案中，本文描述的组合物不限于抗病毒应用。在一些实施方案中，组合物可用作抗微生物、抗细菌、抗寄生虫和抗真菌剂。例如，在一些实施方案中，本发明提供了治疗或预防病毒感染的组合物和方法，所述病毒包括但不限于HIV、HCV、登革病毒、马堡病毒、依波拉病毒、西尼罗河病毒、巨细胞病毒、疱疫病毒(例如，8型)、冠状病毒(例如,SARS)和麻疫病毒。在一些实施方案中，本发明提供了治疗或预防细菌感染的组合物和方法，所述细菌包括但不限于结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、牛分支杆菌、肺炎链球菌(例如，血清型3和14)、幽门螺杆菌和乳酸杆菌。在一些实施方案中，本发明提供了治疗或预防寄生虫感染的组合物和方法，所述寄生虫包括但不限于婴儿利什曼原虫、皮氏利什曼原虫、墨西哥利什曼原虫和曼氏血吸虫寄生虫。在一些实施方案中，本发明提供了治疗或预防真菌感染的组合物和方法，所述真菌包括但不限于烟曲霉和白色念珠菌。在一些实施方案中，组合物可用于治疗涉及呈递适当表面糖(例如，甘露糖)的生物的感染。在一些实施方案中，组合物不限于表面应用。在一些实施方案中，通过药物领域技术人员理解的适当递送途径(例如，静脉内、口服、局部等)施用组合物。本发明的实施方案还提供了药物组合物(例如，包含上述治疗剂的一种或多种)。本发明的药物组合物可以多种方式施 用，取决于希望局部治疗还是全身治疗以及待治疗的区域。施用可以是局部的(包括眼睛和粘膜，包括阴道和直肠递送)、肺部(例如，通过吸入或吹入粉末或气溶胶，包括通过喷雾器；气管内、鼻内、表皮和透皮)、口服或胃肠外。胃肠外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉内注射或输注；或颅内，例如，鞘内或心室内施用。用于局部施用(例如，至组织、伤口、器官等)的药物组合物和制剂可以包括透皮贴片、软膏、洗剂、乳霜、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末。常规药物载体、水性、粉末或油性基底、增稠剂等可能是必要或所需的。口服施用的组合物和制剂包括粉末或颗粒、水或非水介质中的悬浮液或溶液、胶囊、小袋或片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可能是需要的。用于胃肠外、鞘内或心室内施用的组合物和制剂可以包括无菌水溶液，其还可以含有缓冲剂、稀释剂和其他适当添加剂，例如但不限于渗透增强剂、载体化合物和其他药学上可接受的载体或赋形剂。本发明的药物组合物包括但不限于溶液、乳液和含有脂质体的制剂。这些组合物可以从多种组分产生，包括但不限于预制液体、自乳化固体和自乳化半固体。可以常规以单位剂量形式存在的本发明药物组合物可以根据制药行业熟知的常规技术制备。此类技术包括使活性成分与药物载体或赋形剂结合的步骤。一般而言，通过使活性成分与液体载体或细碎固体载体或两者均匀且紧密地结合，然后如果必要则使产物成形，来制备制剂。本发明组合物还可以包含常规存在于药物组合物中的其他佐剂组分。因此，例如，组合物可以含有其他相容的药物活性材料，例如止痒剂、止血剂、局部麻醉剂或抗炎剂，或者可以含有用于物理上配制本发明组合物的各种剂型的其他材料，例如染料、调味剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而，此类材料在添加时不应该不当地干扰本发明组合物的组分的生物活性。制剂可以被灭菌，并且如果需要可以与不会有害地与制剂的活性剂相互作用的辅助剂混合，所述辅助剂例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、香料和/或芳香物质等。给药取决于待治疗的疾病状态或病症的严重程度和响应性，疗程持续数天至数月，或者直至实现治愈或者实现疾病状态的减轻。在一些实施方案中，以一个或多个疗程施用治疗，其中每个疗程包括每天一个或多个剂量，持续数天(例如，1、2、3、4、5、6)或数周(例如，1、2或3周等)。在一些实施方案中，疗程被相继施用(例如，疗程间没有间隔)，而在其他实施方案中，疗程之间提供了 I或多日、周或月的间隔。在一些实施方案中，在进行或维持基础上提供治疗(例如，提供多个疗程，有或没有不定时段的间隔)。最佳给药方案可以从患者体内药物累积的测量值来计算。主治医师可以容易地确定最佳剂量、给药方法和重复率。在一些实施方案中，剂量从O. 01 μ g至IOOg每kg体重，并且可以每天、每周、每月或每年给予一次或多次。治疗医师可以基于药物在体液或组织中测量的停留时间和浓度来估计给药的重复率。实验提供以下实施例以证明和进一步示例说明本发明的某些优选实施方案和方面，并且不应被解释为限制其范围。
实施例1为了确定BanLec的抗HIV活性，将不同浓度的凝集素在与各种HIV-1分离株感染之前与TZM-bl指示细胞孵育。考察了 BanLec抑制几种不同的HIV-1分离株的能力。病毒克隆81A-4和NL(AD8)都是NL4-3的衍生物，其中一部分包膜与分别来自R5 HIV-1分离株BaL或ADA的包膜区交换。81A-4和NL(AD8)利用CCR5作为细胞共受体(R5嗜性)，而NL4-3利用CXCR4作为细胞共受体(X4嗜性)。这些分离株允许评估不同HIV-1包膜对BanLec的敏感性，同时保持NL4-3病毒组分的其余部分不变。还评估了双嗜性分离株89. 6对BanLec的易感性。观察到针对不同嗜性的病毒分离株以低纳摩尔范围内计算的IC5tl值的剂量依赖性的病毒感染抑制。还使用HIV-1指示细胞系MAG1-CCR5进一步证实了 BanLec的抗HIV活性。利用该细胞系，测定了 BanLec抑制实验室适应的分离株BaL(R5)和Bru(X4)以及原代分离株ASM44 (R5X4)和ASM 54 (R5X4)感染的能力，并且确定全部受BanLec抑制。R5嗜性病毒是性传播HIV-1中发现的主要形式。为了确定BanLec是否能够抑制来自不同进化枝的其他原代分离株，测试了 BanLec对具有源自亚型B和C的原代分离株的包膜的假型HIV-1的抑制。这些亚型常见于北美洲和中美洲(亚型B)和非洲和印度的部分(亚型C)。观察到BanLec对病毒复制的有效的亚纳摩尔浓度抑制。噬菌体易感于HIV-1感染并且可以变成不能被高活性抗逆转录病毒疗法清除的病毒贮库。阴道噬菌体在HIV-1致病中的作用还没有被完全表征，但最近证据指示，这些细胞容许HIV-1感染。测定了 BanLec抑制MDM的HIV-1感染的能力。经15天的时段，纳摩尔浓度的BanLec抑制了 MDM中的HIV复制。而且，如通过在第15天进行的MTT测定所测定的，BanLec对细胞活力无影响；因此，该影响不是由于细胞毒性。当BanLec在培养上清液中保持7天而没有改变培养基或添加额外凝集素时，BanLec对HIV-1复制抑制的IC5tl值是9. 72nM，证明37°C下BanLec在长期培养体系中保持为有效且稳定的抑制剂。测试了 BanLec阻止PBL中的HIV-1细胞进入的能力。预计BanLec与HIV-1包膜上存在的高甘露糖结构结合，防止进入并由此防止感染。如果是这样，当细胞在BanLec存在下接触HIV-1时，应该检测到很少或没有早期HIV-1逆转录的强终止DNA产物。在不同浓度BanLec存在下将PBL与HIV-1 Bru分离株孵育。作为阳性对照和用于比较，平行进行了使用凝集素GNA的类似实验。使用实时PCR检测强终止DNA，强终止DNA是可以在病毒进入之后、在病毒脱壳发生之前早期检测的逆转录产物。通过用DNA酶I处理来去除病毒原液中可能已经存在的强终止DNA，以消除逆转录产物的假检测。以低凝集素浓度的BanLec处理导致强终止DNA的明显减少，指示BanLec除了抑制MDM中的病毒复制外，还阻止PBL中的HIV-1感染。而且，这种抑制在早期复制事件之前的步骤、在病毒进入的水平上发生。已知BanLec与甘露糖结合，并且 因此假设BanLec结合糖基化gpl20包膜蛋白上存在的高甘露糖结构并且阻止HIV-1进入细胞。使用基于BanLec的ELISA来测量糖基化HIV-1 gpl20与BanLec的结合。观察到BanLec以浓度依赖性方式与gpl20结合。而且，已知的BanLec配体甲基- a -D甘露吡喃糖苷以浓度依赖性方式抑制这种结合。因为HIV-1包膜蛋白上高密度的糖类残基，高浓度的甲基- a -D甘露吡喃糖配体是竞争与gpl20结合所需的。使用基于ELISA的测定来测定BanLec阻止单克隆抗体2G12结合的能力。2G12识别对于抗体识别而言关键的位置Asn-295、-332和-392 (位置编号具有HXB2参考序列)处的N连接糖基化结构簇。发现，用BanLec预处理gpl20以剂量依赖方式抑制了 2G12的识别，指示BanLec能够与由高甘露糖结构组成的该抗体表位结合。为了进一步考察BanLec在病毒生命周期的哪个阶段抑制HIV-1感染，测试了BanLec抑制附着后的HIV-1感染的能力。为此，测试了 BanLec是否能够抑制已经与细胞结合但由于温度限制而未能完成融合的HIV-1。在附着后测定中观察到HIV-1附着抑制剂CD4-1gG2的抑制活性的大大减少，而结合的病毒依然对融合抑制剂T-20基本上完全易感。这证明在16°C发生病毒附着而非融合。CCR5结合抑制剂maraviroc和BanLec都主要是通过抑制HIV-1附着而阻止病毒复制，但是各自对病毒融合具有适度影响。改变BanLec的氨基酸序列以降低其促有丝分裂活性，同时维持有效的抗HIV活性。通过使用可商购的定点诱变试剂盒而将突变引入含有编码BanLec的DNA序列的表达载体。通过DNA测序证实了突变，并且表达并纯化得到的突变体。然后测试纯化的突变体的促有丝分裂活性。还测试了突变体的抗HIV活性并与野生型形式的活性比较。在用含有共有的亚型C包膜的假型HIV-1感染之前，用不同浓度的野生型或突变体形式的BanLec预处理TZM_bl细胞。通过测量响应感染而产生的报告基因活性来定量感染。通过非线性回归测定突变体和野生型序列的IC5tl值。用突变体的IC5tl值除以野生型BanLec蛋白的IC5tl，测定了突变体的抗HIV活性的倍减。通过将BanLec的位置84的氨基酸组氨酸突变为氨基酸苏氨酸(H84T)、丝氨酸(H84S)或甲硫氨酸(H84M)而实现了促有丝分裂活性的降低(图1&2)。并非所有突变导致该表型；用丙氨酸(H84A)或酪氨酸(H84Y)取代组氨酸84不导致促有丝分裂活性的减少。突变体H84T、H84S和H84M的抗HIV活性减少，但是他们保持纳摩尔范围内的有效的IC5tl值。此外，抗HIV活性的倍减明显小于促有丝分裂活性的减少(表I)。图1显示了 H84T的促有丝分裂活性。通过测量外周血淋巴细胞(PBL)的增殖来评估促有丝分裂活性。从健康供体分离PBL。将细胞与不同浓度的凝集素或作为对照的PBS孵育。细胞被孵育3天，并且然后向培养物添加BrdU。增殖细胞加入BrdU，并且然后通过抗BrdU ELISA定量。对于定量，将促有丝分裂活性表示为刺激指数。这是治疗样本除以PBS治疗对照的值。通常，如果刺激指数大于3 (下虚线)则认为凝集素是促有丝分裂的。然而，观察到了 griffithsin超过3的值。因为已经报道了这是非促有丝分裂的，10被用作截止值，因为griffithsin在除一例以外的所有情况下未超过该阈值。rBanLec代表克隆的野生型BanLec，而H84T代表其中组氨酸84已变为苏氨酸的克隆的BanLec。图2显示了突变体H84S、H84M、H84Y和H84A的促有丝分裂活性。如图1所述，评价了促有丝分裂活性。rBanLec代表克隆的野生型BanLec，而H84S、H84M、H84Y和H84A分别代表其中组氨酸84已变为丝氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸或丙氨酸的克隆的BanLec。表I提供示例性BanLec突变体的抗病毒活性和促有丝分裂活性的总结。表I =BanLec突变体的抗HIV活性和促有丝分裂活性的总结
权利要求
1.一种包含变体BanLec多肽的组合物，其中所述变体BanLec多肽表现出抗病毒或抗微生物活性，并且其中所述BanLec多肽表现出相对于野生型BanLec多肽降低的促有丝分裂活性。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述变体BanLec多肽选自由SEQID N0:l_3组成的组。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述变体BanLec多肽由选自由SEQID NO :4_6组成的组的核酸编码。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述变体BanLec多肽具有SEQID NO 7的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述变体BanLec多肽由SEQID NO :8的核酸编码。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是抗病毒、抗微生物、抗真菌和/或抗寄生虫的药物组合物。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物治疗或预防呈递表面甘露糖的微生物的感染。
8.一种治疗和/或预防微生物感染的方法，所述方法包括施用根据权利要求1所述的组合物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述组合物是局部施用的。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述组合物全身地治疗和/或预防所述感染。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述感染由包含表面甘露糖的微生物引起。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述微生物是病毒、细菌、寄生虫或真菌。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述病毒是HIV。
14.根据权利要求11所述的方法，其中将所述组合物施用给被诊断有感染的受治疗者。
15.根据权利要求11所述的方法，其中将所述组合物施用给处于感染风险的受治疗者。
16.根据权利要求11所述的方法，其中将所述组合物施用给疑似有感染的受治疗者。
17.—种表达载体，其包含编码根据权利要求1所述的组合物的核酸。
18.根据权利要求17所述的表达载体，其中所述表达载体还包含蛋白质纯化标签。
19.一种宿主细胞,其包含根据权利要求18所述的表达载体。
全文摘要
本发明涉及化合物、其发现方法及其治疗和研究用途。具体地，本发明提供了从香蕉分离的抗病毒和抗微生物的凝集素化合物(BanLec)。这些化合物具有低的促有丝分裂性和促炎活性同时保持抗HIV-1活性。
文档编号C07K14/47GK103025756SQ201180029440
公开日2013年4月3日 申请日期2011年4月11日 优先权日2010年4月14日
发明者D.马科维奇, M.斯万森, I.戈德斯坦, H.温特 申请人:密执安大学评议会