检测谷蛋白敏感性和其区分于乳糜泻的方法和装置制造方法
【专利摘要】抗体被用作生物标记来辅助区分谷蛋白免疫反应性和敏感性、无症状乳糜泻、克罗恩氏病和其它肠相关的病理与典型的乳糜泻。在一类实施方式中，测试来自人类或其它动物的血清、唾液或其它样品的针对以下的抗体：(a)小麦抗原；(b)麦醇溶蛋白抗原；和(c)麦胚凝集素、谷吗啡、麦谷蛋白、脱去酰氨基的麦谷蛋白、强啡肽原和强啡肽中的一个或多个。测试结果被认为特别有意思，其中小麦抗原和麦醇溶蛋白抗原均选自α-麦醇溶蛋白33聚体、α-麦醇溶蛋白17聚体、γ-麦醇溶蛋白15聚体、ω-麦醇溶蛋白17聚体和麦谷蛋白21聚体。测试板和试剂盒可有利地测试α-麦醇溶蛋白、γ-麦醇溶蛋白、ω-麦醇溶蛋白、麦谷蛋白、麦胚凝集素、谷吗啡、强啡肽原、转谷氨酰胺酶-2、转谷氨酰胺酶-3、转谷氨酰胺酶-6、和结合麦醇溶蛋白的转谷氨酰胺酶中至少三、五、七个或所有的抗原。
【专利说明】检测谷蛋白敏感性和其区分于乳糜泻的方法和装置
[0001]相关申请
[0002]本申请要求2011年I月20日提交的美国临时申请号61/434，501的权益，其以其全部通过引用被并入本文。
发明领域
[0003]本发明涉及帮助诊断肠相关疾病和病理一包括至少谷蛋白免疫反应性和敏感性、无症状乳糜?写(silent celiac disease)和克罗恩氏病-的方法和试剂盒。
[0004]发明背景
[0005]小麦过敏、乳糜泻和谷蛋白敏感性是由摄入小麦醇溶蛋白而触发的三种不同的状况(1、2)。在这些状 况中，对谷蛋白的反应是由细胞和体液免疫应答介导的，导致呈现不同的疾病复合症状。例如，在小麦过敏中，麦醇溶蛋白肽的特定序列在肥大细胞和嗜碱粒细胞表面上交联两个IgE分子，触发释放介质，如组胺和白三烯类(3)。
[0006]本文讨论的这些和所有其它外源性材料以其全部通过引用被并入。当并入的参考文献中术语的定义或使用与本文提供的该术语的定义不一致或相反时，应用本文提供的该术语的定义，而不应用参考文献中该术语的定义。
[0007]乳糜湾(celiac disease,⑶)是这样的自身免疫状况,其具有已知的遗传组成和环境触发物，如麦醇溶蛋白肽。CD影响1-2%的一般人群。遍及本申请，除非上下文指示相反，本文列出的所有范围应该被解释为包含他们的端点，开放式范围应该被解释包括商业上实用的值。类似地，值的所有列表应该被认为包括中间的值，除非上下文指示相反。
[0008]用于确定诊断这种病症的标记是抗天然的、脱去酰氨基的麦醇溶蛋白肽的IgA和IgA抗组织转谷胺酰氨酶(tTg)自身抗体。与⑶相比，谷蛋白敏感性(GS)影响多达30%的人口(4)。根据Sapone et al (5、6) 2010和2011年发表的两篇文章，GS中的症状可类似与CD或小麦过敏相关的一些胃肠症状，但是强调的是对谷蛋白敏感性的客观诊断试验目前缺失(5、6)。虽然正在研究与GS相比CD中的固有免疫应答，但是研究人员发现与固有免疫相关的TLR1、TLR2和TLR4在粘膜的GS而不是在⑶中升高，而获得性免疫的生物标记如IFN-g、IL-21和IL-17A在⑶而不是GS中的粘膜组织中表达。他们认为用高侵袭性和将需要活组织检查的方法测量的toll样受体和IFN-Y、IL-21和IL-17A的结果将能够使他们区分CD和GS(5、6)。对谷蛋白的速发型超敏感性是IgE介导的，而对谷蛋白的迟发型超敏感性是抗体——(IgG、IgA)和T细胞介导的反应，其被称作乳糜泻或具有肠病的谷蛋白敏感性(7)。在缺乏抗tTg的IgG和IgA的情况下，升高的抗各种小麦抗原和肽的IgG和IgA指示抗小麦肽的粘膜免疫耐受的缺失和谷蛋白敏感性的发展(7)。由于小麦抗原和人组织之间的抗原性相似性，⑶和GS均可以导致多种自身免疫状况，包括I型糖尿病、关节炎、甲状腺炎，和甚至神经自身免疫状况如谷蛋白共济失调和多发性硬化(8-10)。
[0009]应当理解，术语“患者”指在专业的卫生保健护理下的人。然而，更广义地，本文公开的新的试验方案和分析可以应用于非患者的人，和可遭受乳糜泻、谷蛋白敏感性和肠相关的自身免疫的任何其它动物。[0010]虽然GS患者，与⑶患者相似，不能耐受谷蛋白并可发展相同或相似的胃肠症状，但是在GS中，这种免疫反应没有引起小肠损害(5、6)。GS中诱导肠损害的这种缺乏和⑶与遗传标记HLA DQ2/DQ8加小肠损害的关联使CD的诊断比GS容易得多。GS中不太严重的临床现象(picture)、tTg自身抗体的缺少,和许多临床医生对升高的抗各种小麦蛋白和肽的IgG和IgA自身抗体的重要性的不考虑使GS成为非常危险的病症。这是因为血液中IgG和/或IgA抗体长时间存留，连同炎症级联的诱导物可导致成熟(全面的，full-blown)的自身免疫。如果是这种情况，那么由于产生的组织损害的严重性，即使执行无谷蛋白的饮食也不能帮助逆转由抗不同的小麦抗原和肽的IgG和IgA抗体诱导的自身免疫反应过程。
[0011]乳糜泻和谷蛋白免疫反应性/敏感性之间的比较显示在图1中。根据该模型，如果两名儿童——一名具有阴性遗传组成(HLA DQ2/DQ8_)，另一名具有阳性遗传组成(HLA
DQ2/DQ8+)-都暴露于环境因素，如轮状病毒、细菌内毒素,和一些药物或它们的协同效
应，那么结果可以是两名儿童的粘膜免疫耐受都破坏。针对麦醇溶蛋白的粘膜免疫耐受性的诱导导致抗天然的小麦蛋白和肽的IgA和/或IgG的产生，这是在两个为HLA DQ2/DQ81PHLA DQ2/DQ8+的个体中谷蛋白敏感性启动的下一个步骤。
[0012]然而，在具有阳性遗传组成的个体中，抗麦醇溶蛋白的IgG和IgA抗体连同炎症的生物标记可以激活tTg，诱导对绒毛的损伤，和导致绒毛萎缩。特定麦醇溶蛋白肽的脱酰氨导致在它和tTg之间形成复合物；抗原递呈细胞将该复合物呈现给T细胞和B细胞导致抗tTg、脱去酰氨基的麦醇溶蛋白和麦醇溶蛋白-tTg复合物的IgA或IgG的产生。这些抗体的形成和它们在血液中的检测是CD的标志，其是在1-2%的人群中检测到的这种遗传状况。如果CD未被处理，那么结果将是自身免疫和癌症。
[0013]相比较，在HLA DQ2/DQ8阴性的个体中，免疫耐受的这种破坏和伴随的抗天然小麦蛋白和肽的IgA和/或IgG的产生可以激活炎性级联。然而，在缺乏tTg激活的情况下，绒毛萎缩不发生。而且，麦醇溶蛋白肽没有经历脱酰氨，因此产生只针对天然小麦和麦醇溶蛋白肽的IgG和IgA抗体。
[0014]通过连续暴露于小麦抗原和连续的粘膜免疫耐受，小麦抗原和反应抗体形成可怕的免疫复合物联合，导致严重的谷蛋白免疫反应性和敏感性。这种免疫反应性和敏感性是在多达30%的人群中检测到非遗传状况。如果这种病症未被检查到，那么延长暴露于抗小麦抗原、肽的IgG和IgA和它们与不同组织抗原的交叉反应可导致多种自身免疫疾病。因此，即使在缺少CD的情况下，GS可仍然为攻击不同器官的其它谷蛋白相关的自身抗体提供生产性环境。
[0015]而且，不含谷蛋白的饮食通常只推荐给符合CD诊断标准，而不是谷蛋白免疫反应性和敏感性诊断标准的那些人。不幸的是，其使许多谷蛋白敏感的人们不必要地遭受置他们于并发症的危险中的非常严重的症状、可用无谷蛋白饮食解决的状况，如果他们才知道的话。
[0016]因此，需要新的范例用于在各种肠相关的疾病——包括谷蛋白反应性和敏感性、无症状乳糜泻、乳糜泻和肠相关的自身免疫一之间辅助诊断和区分。
[0017]发明简述
[0018]本发明的发明主题提供仪器、系统和方法，其中抗体用作生物标记来辅助诊断谷蛋白免疫反应性和敏感性、无症状乳糜泻、克罗恩氏病和其它肠相关病理。[0019]在本发明的某些方面中，检测来自人或其它动物的全血、血清、唾液或其它样品中针对以下抗原的抗体:(a)小麦抗原；(b)麦醇溶蛋白抗原；和(C)麦胚凝集素、谷吗啡(gluteomorphin)、麦谷蛋白、脱去酰氨基的麦谷蛋白、强啡肽原和强啡肽中的一种或多种。
[0020]检测结果可以有利地用来帮助区分来自乳糜泻的谷蛋白免疫反应性或敏感性，特别是小麦抗原被脱酰氨，麦醇溶蛋白抗原选自α -麦醇溶蛋白33聚体、α -麦醇溶蛋白-17聚体、Y-麦醇溶蛋白15聚体、ω-麦醇溶蛋白17聚体和麦谷蛋白21聚体。
[0021]本发明的某些方面，检测来自人或其它动物的全血、血清、唾液或其它样品中针对以下抗原的一个或多个的抗体:Y-麦醇溶蛋白或其肽如Y-麦醇溶蛋白15聚体、ω-麦醇溶蛋白或其肽如ω-麦醇溶蛋白-17聚体、麦胚凝集素、谷吗啡、麦谷蛋白或其肽如麦谷蛋白21聚体、脱去酰氨基的麦谷蛋白或其肽、强啡肽原和强啡肽。
[0022]本发明的某些方面，针对抗体进行检测和/或分析检测结果，该抗体辅助区分相对于显著症状的(典型的)乳糜泻、克罗恩氏病和慢性免疫激活的谷蛋白免疫反应性和/或敏感性、无症状或非典型乳糜泻。特定目的测试的测试板和试剂盒检测针对以下抗原中至少对3、5、7个或所有的抗体:α-麦醇溶蛋白、Y-麦醇溶蛋白、ω-麦醇溶蛋白、麦谷蛋白、麦胚凝集素、谷吗啡、强啡肽原、转谷胺酰氨酶和结合麦醇溶蛋白的转谷胺酰氨酶(麦醇溶蛋白-转谷胺酰氨酶复合物)。
[0023]本发明的某些方面，特定目的的试验和试验试剂盒允许检测针对以下抗原中的IgA和/或IgG抗体:一种或多种小麦抗原、α -麦醇溶蛋白或一个或多个其肽如α -麦醇溶蛋白33聚体和/或α-麦醇溶蛋白17聚体、Y-麦醇溶蛋白或一个或多个其肽如Y-麦醇溶蛋白15聚体、ω-麦醇溶蛋白或一个或多个其肽如ω-麦醇溶蛋白17聚体、麦胚凝集素、阿片样肽如谷吗啡、强啡肽原和/或强啡肽中的一个或多个、麦谷蛋白或一个或多个其肽如麦谷蛋白21聚体、脱去酰氨基的麦谷蛋白或一个或多个其肽、麦醇溶蛋白-转谷胺酰氨酶复合物、或其组合。
[0024]本发明的某些方面，抗体的检测可以用免疫测定完成，包括但不限于，ELISA测定、RIA测定、胶乳凝集反应、珠测定、蛋白质组学测定和本领域普通技术人员已知的其它免疫测定。
[0025]本发明的发明主题的各种目的、特征、方面和优点从以下优选实施方式连同附图——其中同样的数字表示同样的组分——的详细描述将变的更明显。
[0026]附图简述
[0027]图1是显示乳糜泻(右手列出)和谷蛋白免疫反应性/敏感性(左手列出)之间区别的示意图，如本文所考虑的。
[0028]图2是显示具有12种不同抗原和肽的12个不同排的样品微孔板布局的图示。
[0029]图3是显示样品排微孔板布局的图示，通过该微孔板测量针对来自小麦和相关组织抗原的12种不同抗原或肽(抗原或肽段是透明的)的IgG和IgA。
[0030]图4是显示样品排微孔板布局的图示，通过该微孔板利用用于质量控制目的的每周一次的阴性和阳性对照(抗原或肽段是透明的)测量IgG和IgA。
[0031]图5是根据现有技术(17)使用tTg和各种抗原针对乳糜泻的抗体检测方案的图
/Jn ο
[0032]图6是根据现有技术(17)使用脱去酰氨基的麦醇溶蛋白肽针对对乳糜泻的检测方案的图示。
[0033]图7是根据本发明某些方面使用小麦抗原和肽的所有组成部分针对乳糜泻、谷蛋白免疫反应性/敏感性和自身免疫的建议检测方案的图示。
[0034]发明详述
[0035]根据本发明的某些方面，抗体用作生物标记来辅助诊断和区分如与抵抗许多小麦抗原和肽的典型乳糜泻相反的谷蛋白免疫反应性和敏感性、无症状乳糜泻、克罗恩氏病和其它肠相关的病理。
[0036]在本发明的某些方面，检测体液的针对以下抗原中的一种或多种的免疫球蛋白G (IgG)和/或免疫球蛋白A (IgA)抗体:全麦抗原；α-麦醇溶蛋白或一个或多个其肽；Y -麦醇溶蛋白蛋白或一个或多个其肽；ω-麦醇溶蛋白或一个或多个其肽；麦谷蛋白或一个或多个其肽；一个或多个阿片样肽；麦醇溶蛋白-转谷氨酰胺酶复合物(麦醇溶蛋白结合到转谷氨酰胺酶)；转谷氨酰胺酶；麦胚凝集素；和其组合。
[0037]在本发明的某些方面，全麦抗原是脱去酰氨基的和可通过组合水溶性和醇溶性全麦蛋白来制备。α-麦醇溶蛋白或一个或多个其肽包括α-麦醇溶蛋白33聚体和/或α -麦醇溶蛋白-17聚体，考虑其它的α-麦醇溶蛋白肽。Y-麦醇溶蛋白或一个或多个其肽包括Y-麦醇溶蛋白15聚体，考虑其它的Y-麦醇溶蛋白肽。ω-麦醇溶蛋白或一个或多个其肽包括ω-麦醇溶蛋白17聚体，考虑其它的ω-麦醇溶蛋白肽。麦谷蛋白或一个或多个其肽包括麦谷蛋白21聚体，考虑其它的麦谷蛋白肽。一个或多个阿片样肽包括外啡肽(exorphin)——包括谷吗啡、强啡肽原和/或强啡肽，考虑其它的外啡肽。
[0038]在本发明的某些方面，检测来自人或其它动物的全血、血清、唾液或其它体液样品的针对以下抗原的抗体:a)小麦抗原；b)麦醇溶蛋白抗原；和(C)麦胚凝集素、谷吗啡、麦谷蛋白、脱去酰氨基的麦谷蛋白、强啡肽原和强啡肽中的一个或多个。检测结果被认为特别有趣，其中小麦抗原被脱去酰氨基，麦醇溶蛋白抗原选自α-麦醇溶蛋白33聚体、α-麦醇溶蛋白17聚体、Y-麦醇溶蛋白15聚体、ω-麦醇溶蛋白17聚体和麦谷蛋白21聚体。测试板和试剂盒可有利地检测α-麦醇溶蛋白、Y-麦醇溶蛋白、ω-麦醇溶蛋白、麦谷蛋白、麦胚凝集素、谷吗啡、强啡肽原、转谷氨酰胺酶、和结合麦醇溶蛋白的转谷氨酰胺酶中的至少
3、5、7种或所有抗原。
[0039]在本发明的某些方面，特定目的的测定和测定试剂盒允许检测针对以下抗原的IgA和/或IgG抗体:一种或多种小麦抗原、α -麦醇溶蛋白或一个或多个其肽例如α -麦醇溶蛋白33聚体和/或α-麦醇溶蛋白17聚体、Y-麦醇溶蛋白或一个或多个其肽例如Y-麦醇溶蛋白15聚体、ω-麦醇溶蛋白或一个或多个其肽如ω-麦醇溶蛋白17聚体、麦胚凝集素、阿片样肽如以下的一个或多个:谷吗啡，强啡肽原和/或强啡肽、麦谷蛋白或一个或多个其肽如麦谷蛋白21聚体、脱去酰氨基的麦谷蛋白或一个或多个其肽、麦醇溶蛋白-转谷氨酰胺酶复合物、或其组合。
[0040]本发明的某些方面，抗体的检测可以用免疫测定完成，包括但不限于，ELISA测定、RIA测定、胶乳凝集反应、珠测定、蛋白质组学测定和本领域普通技术人员已知的其它免疫测定。
[0041]下面是测定、它们的应用和关于一些测试患者的分析的示例性描述。虽然与本文描述的那些相似或相等的其它材料和方法可用于本发明的实施或测试，但是现在在测定的示例性描述中描述优选的方法和材料以进一步说明本发明。
[0042]实施例1
[0043]ELISA测定(酶联免疫吸附测定)
[0044]A.材料和方法——板和样品制备:
[0045]小麦抗原和肽。全麦抗原通过混合水溶性和醇溶性蛋白来制备。不同的麦醇溶蛋白肽——包括α-麦醇溶蛋白33聚体、17聚体、Y-麦醇溶蛋白15聚体、ω-麦醇溶蛋白17聚体、谷吗啡、强啡肽原、转谷氨酰胺酶、和结合到转谷氨酰胺酶的麦醇溶蛋白、谷氨酸脱羧酶(GAD-65)高压液相色谱级,通过Bio-Synthesis Inc (Lewisville, TX)来合成。麦胚凝集素(WGA)购自 Sigma/Aldrich (Saint Louis, MO)。
[0046]将抗原和肽以1.0mg/mL的浓度溶解于甲醇，然后在0.1M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液pH9.5中1:100稀释，向聚苯乙烯平底ELISA板的每孔中加入50 μ I。
[0047]将ELISA板于4°C温育过夜，然后用200 μ I含有0.05%吐温20 (ρΗ7.4)的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水(Tris-buffered saline, TBS)洗三次。通过加入200mL2%牛血清蛋白(BSA)的TBS防止免疫球蛋白的非特异性结合，并于4°C温育过夜。洗平板并在质量控制后保存在4°C直到使用。
[0048]酶结合物包括:亲和纯化的抗体磷酸酶标记的羊抗人IgG (JacksonImmunoResearch, Cat#109-055_008)、亲和纯化的抗体憐酸酶标记的羊抗人IgA (Jackson ImmunoResearch, Cat#109-055-011)。
[0049]如本文进一步描述的包括在方法中的其它另外的试剂和材料包括:磷酸盐缓冲盐水粉末(Sigma, Cat#P3813-10PAK)、牛血清白蛋白(Biocell, Cat#3203_00)、叠氮化钠(Sigma, Cat#S-2002)、吐温 20 (Sigma, Cat#P1379_1000ML)、甘油(Sigma, Cat#G5516-500ML)、氢氧化钠(Sigma, Cat#S_5881)、氯化镁(Sigma, Cat#8266)、二乙醇胺(Sigma, Cat#D-8885)、1.0N 盐酸溶液(Sigma, Cat#H3162)、5mg 底物片剂:p_NPP(对硝基苯磷酸盐)(Sigma, Cat#S-0942)和蒸馏水(D.H2O)。
[0050]制备微孔板并用期望数目的小麦相关抗原和/或肽包被。在下面的实例中，将12种不同的小麦相关抗原和肽包被在微孔板上。将校准物、阳性对照和稀释的患者样本加入到孔中，并且识别不同的小麦抗原的自身抗体在第一温育期间结合。清洗孔以去除所有未结合的蛋白质之后，纯化的碱性磷酸酶标记的兔抗人IgG/IgA未结合的结合物通过进一步的清洗步骤而去除。
[0051]用对硝基苯磷酸盐(PNPP)底物使结合的结合物可见，该底物产生黄色反应产物，其强度与样品中自身抗体浓度成比例。每孔加入氢氧化钠来终止反应。在405nm读取颜色强度。
[0052]纯红色盖(plain red top)或红黄盖(red tiger top) (SST管)用于样品采集，虽然在某些方面，考虑针对该测定的其它样品采集装置。
[0053]利用无菌静脉穿刺技术采集血液样品，并且利用标准程序获得血清。在某些方面，优选最少约50 μ I血清用于测定，其因此对应约0.5ml或更多血液。
[0054]B.试骀测定稈序
[0055]现在讨论辅助诊断和检测谷蛋白免疫反应性和敏感性、无症状乳糜泻、克罗恩氏病和其它肠相关的病理的IgG和/或IgA抗体阵列的分析程序。在一些方面，允许所有试剂在试验测定开始前达到室温。试验测定程序包括用预望数目和类型的小麦相关抗原和/或肽制备期望数目的包被的孔或板。一旦微量滴定孔制备好，就利用多道移液器将约100 μ 11:100稀释的对照校准物加入到如图3所示的A排和B排微孔板中。将约100 μ 11:100稀释的患者测试样品，在这里是血清，加到针对临床样本I的C排和D排、针对临床样品2的E排和F排、针对临床样品3的G排和H排的复孔中。
[0056]在单独的板上，以双份进行与临床样本相似定期的阴性和阳性对照，如图4所示。
[0057]然后将平板在室温温育60分钟。温育后，将孔排空并利用ELISA清洗器用PBS洗4次。将约100 μ I最佳稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗人IgA加入到IgA板或以最佳稀释将约100 μ I酶标记的IgG加入到IgG板中。
[0058]然后将各自平板于室温温育30-60分钟。结合温育结束前约10分钟，通过用5ml底物缓冲液混合5mg对硝基苯基磷酸盐片剂，充分混合直到片剂完全溶解而制备底物溶液。重复利用ELISA清洗器用PBS洗4次。然后，将约100 μ I底物溶液加到每孔中。然后将平板于室温温育30分钟，避免任何的直接阳光暴露。通过加入约50 μ I的3Ν NaOH来终止反应。使用微孔板读数器以空白孔为背景，在405nm读取孔的颜色强度，记录校准物、对照和未知样品的吸光度。
[0059]C.结果的计算
[0060]板在405nm读数获得光密度值(0D405)之后，将阴性对照的平均OD、阳性对照的平均OD和每个临床样本的平均OD除以A排和B排上校准物的平均OD以获得各自的指数值(IV)0
[0061]通过将每个双份样品的平均OD除以校准物对照值的平均OD(例如，将孔Cl和Dl的平均OD除以孔Al和BI的平均0D，将孔C2和D2的平均OD除以孔A2和B2的平均0D，将孔C3和D3的平均OD除以孔A3和B3的平均OD等等)来计算针对12种不同抗原的每种抗体的指数值(IV)。
[0062]然后将结果与建立的参考范围进行比较。
【权利要求】
1.测试来自动物的样品的方法，包括: 测量源自所述样品的第一部分与小麦抗原结合的第一信号； 测量源自所述样品的第二部分与麦醇溶蛋白抗原结合的第二信号；和 测量源自所述样品的第三部分与选自以下的抗原结合的第三信号:(I)麦胚凝集素；(2)谷吗啡；(3)麦谷蛋白；(4)脱去酰氨基的麦谷蛋白；(5)强啡肽原；和(6)强啡肽。
2.权利要求1所述的方法，其中所述样品包括血清。
3.权利要求1所述的方法，其中所述样品包括唾液。
4.权利要求1所述的方法，其中所述小麦抗原选自α-麦醇溶蛋白33聚体、α-麦醇溶蛋白17聚体、Y-麦醇溶蛋白15聚体、ω-麦醇溶蛋白17聚体和麦谷蛋白21聚体。
5.权利要求4所述的方法，其中所述小麦抗原中的至少一种是脱去酰氨基的。
6.权利要求1所述的方法，其中所述动物是人。
7.利用从分析获自人的样品获得的试验结果，进行辅助区分乳糜泻与(a)谷蛋白免疫反应性和敏感性和(b)与谷蛋白免疫反应性/敏感性和自身免疫相关的诊断的确定的方法，包括: 测试或得到所测试样品的抗脱去酰氨基的α -麦醇溶蛋白33聚体或转谷氨酰胺酶-2的IgA ;和 测试或得到所测试样品的抗脱去酰氨基的麦谷蛋白21聚体的IgA。
8.权利要求7所述的方法，进一步包括测试或得到所测试样品指示无症状乳糜泻的血清学模式，其中: 抗α -麦醇溶蛋白33聚体、脱去酰氨基的α -麦醇溶蛋白33聚体、α -麦醇溶蛋白25聚体、α-麦醇溶蛋白18聚体、α-麦醇溶蛋白17聚体、Y-麦醇溶蛋白15聚体、ω-麦醇溶蛋白17聚体、麦谷蛋白、脱去酰氨基的麦谷蛋白、谷吗啡、强啡肽原和麦胚凝集素的至少一种阳性的IgA和IgG试验至少之一；和 抗转谷氨酰胺酶-2阴性的IgA和IgG试验，和抗转谷氨酰胺酶-3和转谷氨酰胺酶-6的至少一种阳性的IgA和IgG试验至少之一。
9.权利要求7所述的方法，进一步包括测试或获得所测试样品指示谷蛋白免疫反应性和敏感性的血清学模式，其中: 抗α-麦醇溶蛋白、Y-麦醇溶蛋白、ω-麦醇溶蛋白、麦谷蛋白、脱去酰氨基的麦谷蛋白、谷吗啡和麦胚凝集素至少一种阳性的IgA和IgG试验至少之一；和 抗脱去酰氨基的α-麦醇溶蛋白、脱去酰氨基的麦谷蛋白或转谷氨酰胺酶-2阴性的IgA和IgG试验。
10.权利要求7所述的方法，进一步包括测试或获得所测试样品指示与谷蛋白免疫反应性/敏感性和自身免疫相关的诊断的血清学模式，其中: 抗天然α-麦醇溶蛋白、Y-麦醇溶蛋白、ω-麦醇溶蛋白、麦谷蛋白、脱去酰氨基的麦谷蛋白、谷吗啡和麦胚凝集素的至少一种阳性的IgA和IgG试验至少之一； 对谷氨酸脱羧酶和小脑组织的至少一种阳性的IgG、IgA和IgM试验至少之一；和 抗脱去酰氨基的α-麦醇溶蛋白、脱去酰氨基的麦谷蛋白或转谷氨酰胺酶阴性的IgA试验。
11.筛选患者中IgG和IgA抗体的至少一种存在的方法，包括:获得来自测量第一、第二和第三信号的试验结果，其中所述第一信号来自所述样品的第一部分与小麦抗原的结合，所述第二信号来自所述样品的第二部分与麦醇溶蛋白抗原的结合；和所述第三信号来自所述样品的第三部分与选自以下的抗原的结合:(I)麦胚凝集素；⑵谷吗啡；⑶麦谷蛋白；⑷脱去酰氨基的麦谷蛋白；(5)强啡肽原；和(6)强啡肽；和 利用权利要求1所述的试验结果来查明所述患者是否具有所述抗体。
12.权利要求11所述的方法，其中所述抗体结合小麦和麦醇溶蛋白肽。
13.权利要求11所述的方法，其中所述抗体结合小麦的醇溶性和/或水溶性组分，和所述麦醇溶蛋白抗原选自α -麦醇溶蛋白33聚体、α -麦醇溶蛋白17聚体、Y-麦醇溶蛋白15聚体、O-麦醇溶蛋白17聚体、和麦谷蛋白21聚体。
14.权利要求11所述的方法，进一步包括利用所述试验结果辅助查明是否所述患者是否具有乳糜泻。
15.权利要求14所述的方法，进一步包括从测试所述样品针对α-麦醇溶蛋白、Y-麦醇溶蛋白、ω-麦醇溶蛋白、麦谷蛋白、麦胚凝集素、谷吗啡、强啡肽原、转谷氨酰胺酶和结合麦醇溶蛋白的转谷氨酰胺酶的至少五种抗体获得结果。
16.权利要求11所述的方法，进一步包括利用所述试验结果来辅助区分所述患者是否具有与明显症状的乳糜泻相反的无症状或非典型的乳糜泻。
17.权利要求16所述的方法，进一步包括从测试所述样品针对α-麦醇溶蛋白、Y-麦醇溶蛋白、ω-麦醇溶蛋白、麦谷蛋白、麦胚凝集素、谷吗啡、强啡肽原、转谷氨酰胺酶、和结合麦醇溶蛋白的转谷氨酰胺酶的至少五种抗体获得结果。
18.权利要求1所 述的方法，进一步包括利用所述试验结果来辅助查明所述患者是否具有谷蛋白免疫反应性和敏感性和自身免疫的至少一种。
19.权利要求18所述的方法，进一步包括从测试所述样品针对α-麦醇溶蛋白、Y-麦醇溶蛋白、ω-麦醇溶蛋白、麦谷蛋白、麦胚凝集素、谷吗啡、强啡肽原、转谷氨酰胺酶、和结合麦醇溶蛋白的转谷氨酰胺酶的至少五种抗体获得结果。
20.权利要求1所述的方法，进一步包括利用所述结果来辅助查明所述患者是否具有克罗恩氏病和慢性免疫激活的至少一种。
21.权利要求20所述的方法，进一步包括从测试所述样品针对α-麦醇溶蛋白、Y-麦醇溶蛋白、ω-麦醇溶蛋白、麦谷蛋白、麦胚凝集素、谷吗啡、强啡肽原、转谷氨酰胺酶、和结合麦醇溶蛋白的转谷氨酰胺酶的至少五种抗体获得结果。
22.筛选患者中IgG和/或IgA抗体存在的方法，包括提供或获得来自测量信号的试验结果，所述信号来自患者的抗体与以下的结合:(a) α -麦醇溶蛋白和转谷氨酰胺酶的至少一种,和(b)小麦的水溶性和醇溶性组分、麦胚凝集素、ω-麦醇溶蛋白和Y-麦醇溶蛋白、麦谷蛋白、谷吗啡、和结合麦醇溶蛋白的转谷氨酰胺酶的至少一种；和利用权利要求1所述的试验结果来查明所述患者是否具有所述抗体。
23.测试板，其含有至少三种结合的测试物质,所述测试物质选自由小麦的水溶性和醇溶性组分、α-麦醇溶蛋白33聚体、α-麦醇溶蛋白17聚体、Y -麦醇溶蛋白15聚体、ω-麦醇溶蛋白17聚体、麦谷蛋白21聚体、谷吗啡16聚体、强啡肽原、结合麦醇溶蛋白的转谷氨酰胺酶、和麦胚凝集素组成的清单。
24.权利要求23所述的测试板，其含有所述结合的测试物质的至少五种。
25.权利要求23所述的测试板，其含有所述结合的测试物质的至少七种。
26.权利要求23所述的测试板，其含有所述结合的测试物质的每一种。
27.测试试剂盒，其包括权利要求23所述的测试板，和利用所述测试板来测量IgG和/或IgA抗体的说 明书。
【文档编号】G01N33/53GK103430025SQ201280014219
【公开日】2013年12月4日 申请日期:2012年1月19日 优先权日:2011年1月20日
【发明者】A·沃佳达尼 申请人:免疫科学实验室公司