抗hiv剂的评价方法

专利名称：抗hiv剂的评价方法
技术领域：
本发明涉及结合甘露糖的蛋白质(MANNOSE BINDING PROTEIN，以下简称为“MBP”)的新用途，特别涉及MBP在由人免疫缺陷病毒(HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS，以下简称为“HIV”)引起的感染症的治疗时采用的抗HIV剂中的应用。
背景技术：
MBP是被称为结合甘露聚糖的蛋白质、结合甘露聚糖的外源凝集素、结合甘露糖的外源凝集素等的物质，是分子内部具有胶原样结构及钙要求性的糖识别区域的C型外源凝集素，即属于胶原凝集素的物质[Kozutsumi，Y.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，95，pp.658-664(1980)]。
参考图4，MBP一般从其N末端侧至C末端侧(图4的左端至右端)由N末端区域(富半胱氨酸区域)、胶原样区域、颈区域及糖识别区域(CRD)这4个区域构成。通过颈区域及胶原样区域中的螺旋形结构，每根约30kDa～约33kDa的3根多肽发生分子间结合，形成1个约90kDa～约99kDa的亚单位结构(3倍体)。然后，2～6个该亚单位结构又结合成花束样，形成同型低聚物。
从关于MBP的目前为止的基础研究看，对于进入生物体内的微生物，MBP与该微生物表面的糖链结合，使补体系活化，暗示其与微生物感染的初期防御有关[Holmskov，U.等，Immunol.Today，15，pp.67-74(1994)及Turner，M.W.等，Immunol.Today，17，pp.532-540(1996)]。此外，目前有MBP缺少者容易引发感染症[Summerfield，J.A.等，Lancet，315，pp.886-889(1995)]、动脉硬化性动脉粥样硬化患者中MBP缺少者居多[Madsen，H.O.等.，Lancet，352，pp.959-960(1998)]、MBP基因变异易引发重症疟疾[Luty，A.J.等，J.Infect.Dis.，178，pp.1221-1224(1998)]，MBP基因变异使囊性纤维症中的肺感染症加重[Garred，P.等，J.Clin.Invest.，104，pp.431-437(1999)]等报道。
此外，作为对MBP的治疗药物用途的探讨，有给MBP缺少者服用MBP，使补体依赖性的调理活性正常化，从而改善易感染性的报道[Valdimarsson，H.等，Scand.J.Immunol.，48，pp.116-123(1998)]。此外，有给囊性纤维症患者服用MBP，使患者的临床症状稳定化的报道[Garred，P.等，Pediatr.Pulmonol.，33(3)，pp.201-207(2002)]。
但是，HIV感染者的数目在世界范围内每年都在持续增长，大多数发生在发展中国家，这些国家中，后天免疫缺陷综合征(AIDS)患者急剧增加。特别是被称为泰国子类群(Clade)E型的病毒(E亚型病毒)的感染性极高，世界卫生组织(WHO)预测今后世界上E亚型病毒的感染者将会最多。
在日本与欧美一样，B亚型病毒的感染者居多，但最近也有E亚型病毒感染者增加的趋势。
为了能够有效控制HIV感染症，预防新感染者的产生，即疫苗的开发成为了很紧急的课题。尤其是美国和法国等国家，对疫苗的研究正积极地进行，但现状是目前研究中的疫苗都是针对B亚型病毒的，对E亚型病毒的疫苗研究几乎没有。而且，作为D亚型病毒，已知的是主要分布于亚洲和中非的显现暴发性病症的NDK株。
如前所述，现状是B亚型病毒虽然广泛地分布于世界各地，但其疫苗还在研究中，离实用化还差得很远。此外，E亚型病毒CRF01_AE的感染力很强，预测今后其感染范围将会扩大。另外，D亚型病毒是显现暴发性病症的病毒。因此，希望开发出能够有效抑制属于这种亚型的病毒的药物。
此外，艾滋病(AIDS)疫苗中，研究了直接使用艾滋病毒的病毒颗粒的生疫苗、使用病毒颗粒的一部分的组成性疫苗、进行病毒基因重组而获得的再组合疫苗、使病毒灭活仅保留其蛋白结构的灭活疫苗等。但是，如果考虑它们的实用性，则不仅要考虑HIV感染的防御效果，即有效性(免疫性的诱导)，还必须考虑到其安全性。
现在，在艾滋病的治疗中，大多数采用多剂并用疗法(HAART)。提倡HAART疗法时它被称为跨时代的化学疗法，但现在认识到出现耐药性病毒、HIV的基因组高度变异、长期及大量服用会产生副作用等问题，所用的药物的选择及使用方法极为复杂。
HIV是具有高度的基因组多样性的病毒，其原因主要有以下2种。
首先第一，HIV基因组的复制错误导致多样性增加。通常采取从基因组RNA通过逆转录酶转变为DNA，然后被编入宿主细胞基因组的复制过程。由于逆转录酶缺乏3′→5′核酸外切酶活性，所以对被复制的碱基序列不具有校正功能。此外，由于逆转录酶的底物特异性低，所以逆转录反应时的碱基置换、缺失、插入、重复等变异的发生频率极高[Mansky，L.M.，J.Gen.Virol.，79，pp.1337-1345(1998)]。
而且，HIV在生物体内以109-10/天的比例繁殖[Perelson，A.S.等，Science，271，pp.1582-1586(1996)]，一年要重复进行300次循环的复制。因此，感染HIV的同时开始变异的蓄积，进一步造成基因组的多样性。
此外，不同体系的病毒间的基因组重组也会增加多样性。HIV所属的逆转录病毒的基因重组通常是通过在病毒颗粒内进入具有相同性的2个RNA基因组和通过逆转录酶的模板转换(template switch)功能奏效的被称为强制复制选择(forced copy choice)[Coffin，J.M.，J.Gen.Virol.，42，pp.1-26(1979)]的机理而以高频率发生[Jetzt，A.E.等，J.Virol.，74，pp.1234-1240(2000)]。因此，有通过获得这种高度的基因组多样性，引发了HIV的准种性、亚型的分化、重组病毒的出现、耐药性变异、CTL逃逸变异等的看法。
HIV根据遗传学体系被大致分为HIV-1型(HIV-1)和HIV2型(HIV-2)这2种。HIV-1又被分为M组、O组及N组。
M组是HIV-1中最主要的组，被分为A～D、F～H、J及K亚型9种。A及F亚型又分别被分为A亚-亚型、A2及F1、F2。
E亚型目前被作为CRF01_AE分类，所以本说明书中将E亚型作为“CRF01_AE”(前述)。
HIV-2被分为A～G亚型[Charneau，P.等，Virology，205，pp.247-253(1994)；Gurtler，L.G.等，J.Virol.，68，pp.1581-1585(1994)；Simon，F.等，Nat.Med.，4，pp.1032-1037(1998)；Triques，K.等，AIDS Res.Hum.Retroviruses，16，pp.139-151(2000)；Robertoson，D.L.等，Science，288，pp.55-56(2000)；Triques，K.等，Virology，259，pp.99-109(1999)]。
作为HIV的重组病毒的分类，有报道包括重组型流行株(CRFsCRF01～CRF12)、孤立型重组病毒(URFsURFsA/C、URFsA/D、URFsB/E、URFsB/C)、归属不明的重组病毒(MAL株)、M组/O组间的重组病毒等[Carr，J.K.等，Virology，247，pp.22-31(1998)；Motomura，K.等，AIDS Res.Hum.Restroviruses，16，pp.1831-1843(2000)；Peeters，M.等，J.Virol.，73，pp.7368-7375(1999)；Takehisa，J.等，J.Virol.，73，pp.6810-6820(1999)；武部丰，日本病毒学会杂志，50(2)，pp.123-138(2001)]。
作为HIV的糖蛋白，有包膜糖蛋白gp120和膜贯通糖蛋白gp41。被称为病毒基因组状的“env”的基因编码的gp160被宿主蛋白酶切断可生成这些糖蛋白[Hallenberger，S.等，Nature，360，pp.358-361(1992)]。
由于gp120中存在24处N-结合型糖链结合部位[Leonard，C.K.等，J.Biol.Chem.，265，pp.10373-10382(1990)]，糖链占gp120分子的约一半[Allans，J.S.等，Science，228，pp.1091-1094(1985)]，所以，HIV可以说是被糖链覆盖的病毒。各种实验证明，HIV对目标细胞进行感染时gp120的糖链是必须的[Fennie，C.等，J.Virol.，63，pp.369-646(1989)；Matthews，T.J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，pp.5424-5428(1987)；Montefiori，D.C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，pp.9248-9252(1988)；Pal，R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，pp.3384-3388(1989)]。
但是，作为HIV-1颗粒感染细胞时的作用机制，考虑是首先gp120与细胞膜上的CD4结合，然后gp120的V3环与复合受体(趋化因子受体)结合，接着gp41侵入细胞膜引发膜融合这一系列的作用。目前报道了多种趋化受体，例如，报道了CCR5(巨噬细胞向性病毒的复合受体)、CXCR4(T细胞向性病毒的复合受体)、CCR1、CCR2b、CCR3、CCR4、CCR8、CCR9、CXCR2、CXCR5、CXCR6/STRL33及CX3CR1等。作为HIV的分类方法，除了前述遗传学体系的方法之外，还有基于这些趋化因子受体分类的方法。例如，作为复合受体介入CCR5的病毒被分类为CCR5(简称为R5)向性病毒、作为复合受体介入CXCR4的病毒被分类为CXCR4(简称为X4)向性病毒，同样，被分类为CCR1向性病毒和CCR2b向性病毒等。其中，R5向性病毒是巨噬细胞向性病毒，X4向性病毒被分类为T细胞向性病毒。此外，R5X4向性病毒被分类对巨噬细胞及T细胞都具有向性的病毒。
关于MBP和HIV的关系，具有MBP的同源变异的人感染HIV的机率较高，此外，有报道认为这类人被诊断为AIDS后的生存时间较短[Garred，P.等，Lancet，349，pp.236-240(1997)]。但是，然后有报道认为相反是具有基因变异的组很难感染AIDS[Mass，J.等，Aids，12，pp.2275-2280(1998)]。也有基因变异和AIDS的预后无关的报道[McBride，M.O.等，Int.J.STD.AIDS.，9，pp.683-688(1998)]。此外，有MBP与gp120结合的报道[Larkin，M.等，AIDS，3，pp.793-798(1989)；Mizuochi，T.等，J.Biol.Chem.，264，pp.13834-13839(1989)；Saifuddin，M.等，J.Gen.Virol.，81，pp.949-955(2000)]。
但是，完全不知MBP有无抗HIV作用，且MBP有无抑制HIV增殖作用。这些虽然都是判定MBP作为抗HIV剂是否有用的最重要的因素，但目前为止表示没有任何证明。
此外，能够评价MBP的抗HIV作用的评价体系也不存在，所以利用MBP的抗HIV剂的开发目前无任何进展。
此外，药物治疗HIV时担心的耐药性病毒的出现、HIV的基因组高度变异、长期及大量服用引发的副作用等问题还未解决。另外，疫苗的开发也是极为困难的，特别是E亚型的研究现在完全没有开展。
但是，现在已经知道R5向性病毒很难由中和抗体被中和，与病症的进展有很大关系。尤其是感染初期时对R5向性病毒的治疗方法对患者的预后会产生很大的影响，所以，要求在初期感染时能够对R5向性病毒进行正确的处理。此外，感染传播的HIV大多数为CCR5向性病毒，所以CCR5作为预防治疗和抑制感染·传播的目标倍受瞩目。另一方面，随着临床治疗病症临近后期阶段，CCR5向性病毒向CXCR4向性病毒进行转变，到后期阶段，CXCR4向性病毒的存在变得非常明显为一般所知。
这种趋化因子受体的存在是最近才知道的，以这些趋化因子受体为目标的治疗药物的开发目前仅处于基础药剂阶段。对这些趋化因子受体的抑制剂的开发也在进行中，但服用CCR5抑制剂时，还有CXCR4向性病毒的出现加快，可能会加快病症的发展等令人担心的重大问题未解决。
因此，临床医生希望开发出能够避免上述这一连串的问题，而安全且与HIV病毒的亚型、趋化因子受体向性、巨噬细胞和T细胞向性等各种要素都无关的显现抗HIV作用的药物。
尤其希望开发出对B亚型病毒、CRF01_AE、D亚型病毒显现出抗病毒作用的药物，还希望开发出对CCR5向性病毒、CXCR4向性病毒、CCR5/CXCR4向性病毒显现出抗HIV作用的药物。同样也希望开发出对巨噬细胞向性病毒、T细胞向性病毒、巨噬细胞/T细胞向性病毒显现出抗HIV作用的药物。

发明内容
本发明是鉴于上述以往技术中指出的问题完成的发明，尤其是本发明者率先确立了能够定量评价MBP的抗HIV作用的体系。此外，通过利用该评价体系，第一次证明了MBP的抗HIV作用，即HIV增殖抑制作用，开辟了MBP作为抗HIV剂的用途。此外，本发明者还证明MBP不仅对E亚型HIV，对属于其它子类群(Clade)(亚型)的HIV也显现出抗HIV作用。
即，本发明的主题是以MBP为有效成分的抗HIV剂。以MBP为有效成分的本发明的抗HIV剂，由于MBP的目标是糖链，所以其优点是很难受到因HIV基因组变异而出现的MBP耐性株的影响。此外，由于MBP是生物体中常见的物质，所以具有不会产生用于以往的化学疗法的化合物所确认出现的副作用。
本发明还提供了抗HIV作用的评价方法，即提供了包括以下4个步骤的MBP显现抗HIV作用的评价方法，(1)培养使目标细胞和HIV共存而获得的感染细胞，(2)对经过培养的感染细胞进行洗涤获得洗净细胞，(3)在MBP存在下对洗净细胞进行培养，以及(4)测定来自培养上清液中的HIV的p24蛋白。
本发明还提供了另一抗HIV作用的评价方法，即提供了包括以下7个步骤的MBP显现抗HIV作用的评价方法，(a)培养HIV和MBP共存的第一混合系，(b)较好的是与第一混合系同时培养目标细胞和MBP共存的第二混合系，(c)合并第一混合系和第二混合系获得感染细胞，(d)对所得感染细胞进行培养，(e)对经过培养的感染细胞进行洗涤获得洗净细胞，(f)较好的是在MBP存在下对洗净细胞进行培养，以及(g)测定来自培养上清液中的HIV的p24蛋白。
利用这些评价方法，能够客观且容易地确认及验证MBP潜在的抗HIV作用。


图1为表示HIV感染细胞NDK/M8166中的重组型结合甘露糖的蛋白质(rMBP)和HIV活性间的关系的图表。
图2为表示HIV感染细胞LP65/M8166中的重组型结合甘露糖的蛋白质(rMBP)和HIV活性间的关系的图表。
图3为表示HIV感染细胞NDK/M8166中的天然型结合甘露糖的蛋白质(nMBP)和HIV活性间的关系的图表。
图4为表示结合甘露糖的蛋白质的结构的略图。
具体实施例方式
本发明的抗HIV剂由于利用了作为有效成分的MBP显现的HIV增殖抑制作用，例如，HIV中和作用和HIV萌芽抑制作用等，所以对艾滋病患者及HIV感染者的治疗和病症发展的抑制有用。
此外，本发明的抗HIV剂的有效成分MBP不论是天然物及合成物(包括重组体)还是其它，只要具有规定的HIV增殖抑制作用，可以是任何一种。尤其适用于本发明的MBP包括分离自人血清并精制的MBP以及动物细胞，较好的是通过基因工程方法从中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(以下简称为“CHO细胞”)分泌的MBP。
例如，参考国际公开公报第WO 99/37676号公报，经过以下一系列的步骤，能够制得作为本发明可使用的一种MBP的重组型人结合甘露聚糖的蛋白质(以下简称为“rhMBP”)，即，(i)在质粒pNOWl中插入对应于天然型人结合甘露聚糖的蛋白质(以下简称为“nhMBP”)的cDNA的碱基序列(序列号1)的66bp～812bp的747个连续的多核苷酸(序列号2)，构建表达载体pNOW1-hMBP；(ii)将表达载体pNOW1-hMBP导入二氢叶酸还原酶缺陷(dhfr-)的CHO细胞，获得转化体；(iii)将所得转化体在含有新霉素的培养基中进行培养，获得新霉素耐性细胞；(iv)将选择的新霉素耐性细胞在含有甲氨喋呤(MTX)的培养基中进行培养，获得甲氨喋呤耐性细胞；以及(v)从选择的甲氨喋呤耐性细胞回收rhMBP。
以下，对前述制造方法进行详细说明。
首先，进行表达载体pNOW1-hMBP的构建。关于构成nhMBP的氨基酸，Herman等已经有所分析和报道[Sastry等，“人结合甘露糖的蛋白质基因。外显子结构揭示其与人类肺表面活性物质基团的进化关系以及在10号染色体上的定位。”，J.Exp.Med.170(4)，pp.1175-1189(1989)]。构成nhMBP的氨基酸序列用序列号3表示。
根据这些序列信息，从人肝脏cDNA文库(クロ-ンラック公司制)扩增起始密码子到终止密码子的nhMBP，所得nhMBP的cDNA被限制性酶消化，获得对应于nhMBP的cDNA的66～812bp的747个连续的多核苷酸(序列号2)，将其作为插入体。然后，用限制性酶消化表达载体pMOW1，在pCMV和BGP多聚A间用DNA连结试剂盒(宝酒造制)插入前述插入体。将籍此获得的表达载体命名为质粒pNOW1-hMBP。
然后，进行表达克隆的选择。在二氢叶酸还原酶缺陷(dhfr-)的CHO细胞导入表达载体pNOW1-hMBP按照以下步骤进行。即，调制添加了胎牛血清的IMDM培养基(GIBCO公司)，在其中混合(dhfr-)DG44CHO细胞株，在37℃、5％二氧化碳气体的条件下进行24小时的培养。然后废弃培养上清液，替其将表达载体pNOW1-hMBP混入脂转染溶液中，在其中加入添加了含有预先调制的溶液的FCS的IMDM，在加入次黄嘌呤(GIBCO公司制)和胸苷(GIBCO公司制)后进行培养，进行表达载体pNOW1-hMBP向dhfr-的宿主CHO细胞的导入。然后，废弃培养上清液，加入添加了FCS、次黄嘌呤和胸苷的IMDM再进行培养。
为了获得新霉素(G418)耐性CHO细胞，在培养导入了表达载体pNOW1-hMBP的细胞后，用胰蛋白酶对其进行处理，使细胞悬浮于添加了含有新霉素(G418)的FCS的IMDM。然后，将该悬浮物接种于微型板，在37℃、5％二氧化碳(CO2)的条件下培养2周，出现新霉素耐性细胞(克隆)。
从确认了rhMBP的产生的克隆中选择数个，进行各克隆的培养。废弃各培养上清液，加入与前述同样组成的添加了FCS的IMDM，培养4天，回收该培养上清液。测定回收的培养上清液中的rhMBP的产生量。用对应于作为对照的nhMBP、胶原凝集素的糖识别区域(CRD)及颈区域的(在大肠菌显现)的抗兔子多克隆抗体及nhMBP(定量对象)，按照铃木等的方法[Y.Suzuki等，“哺乳动物细胞中表达的重组牛胶固素的特性”，Biothem.Biophys.Res.Comun.，238，pp.856-863(1997)]能够对rhMBP的产生量进行定量。
为了获得甲氨喋呤耐性的CHO细胞，对rhMBP产生的克隆进一步进行传代培养使其稳定化后，在培养基中加入低浓度的甲氨喋呤进行基因扩增。首先，在添加了加入甲氨喋呤、新霉素(G418)的10％经过透析的FCS(JRH生物科学公司制)(JRH Biosciences)的IMDM中混合选择的各细胞克隆，播种。在37℃、5％二氧化碳(CO2)的条件下，通过2周的培养，出现甲氨喋呤耐性细胞(克隆)。通过确认这些甲氨喋呤耐性的克隆的rhMBP产生性，高水准的产生水平得到确认。
从这些克隆选择任意的克隆，各自播种，培养2周。废弃培养上清液，加入与前述同样组成的添加了FCS的IMDM(加入了甲氨喋呤、新霉素(G418)的物质)，培养4天，回收培养上清液，确认rhMBP的产生水平。
为了精制rhMBP，播种所得克隆中产生效率最高的克隆，并进行培养。然后，废弃培养上清液，添加含有甲氨喋呤和新霉素(G418)的CHO-S-SFM II培养基(添加维生素C时，添加维生素C直至终浓度为100mM)，培养4天。回收该培养上清液，进行对应于TBS(由TBS粉(宝酒造社制)调制)的透析，然后，进行对应于TBSC(5mM CaCl2，TBS)的透析。接着，利用甘露聚糖-琼脂糖(SIGMA公司制)进行精制。即，将甘露聚糖-琼脂糖装入柱子(Column PD-10，空，法玛西亚公司制)中，在其中通入经过透析的培养液，用TBSC洗涤后，用TBSE(10mM EDTA，TBS)溶出。溶出后，加入1M的CaCl2，使终浓度达到15mM。然后，再次用于甘露聚糖-琼脂糖，用TBSC洗涤后，用含10mM的甘露糖的TBS溶出。接着，再次进行对应于TBSC的透析，获得rhMBP的精制品。
以上获得的精制的rhMBP用凝胶过滤色谱法进行处理时的280nm的吸光度在1000～1300kDa的分子量，特别是1150kDa的分子量显现出特定峰。此外，在200～400kDa的分子量，特别是300kDa的分子量显现出特定峰。再者rhMBP的凝胶渗透色谱分析在使用20mM Tris-HCl(pH8.0)、0.15mM NaCl、5mM EDTA，以0.5ml/分钟的流速，超级玫瑰(Superrose)6HR10/30(φ10mm×长300mm，法玛西亚株式会社制)的条件下进行。40μg的rnMBP通过该柱子，在280nm的吸光度下进行测定。
按照国际公开公报第WO 99/37676号记载的方法合成的rhMBP作为本发明的抗HIV剂的有效成分使用时，最好采用前述精制的rhMBP。也可采用该精制rhMBP再次通过凝胶过滤色谱法而获得的、利用280nm的吸光度测定在1000～1300kDa的分子量出现的级分、在200～400kDa的分子量出现的级分或含有上述两种级分的精制rhMBP。
本发明的抗HIV剂对任一类型的HIV株都有效，从后述的实施例的记载可知，除了对属于HIV-1的M组的B亚型的HIV显示出明显的抗HIV作用之外，还对属于HIV-1的M组的D亚型的HIV、重组型流行株，特别是CRF01_AE株显现出明显的抗HIV作用。
本发明的抗HIV剂还对CCR5向性病毒、CXCR4向性病毒及CCR5/CXCR4向性病毒显现出明显的抗HIV作用。此外，本发明的抗HIV剂对巨噬细胞向性病毒、T细胞向性病毒及巨噬细胞/T细胞向性病毒同样显现出明显的抗HIV作用。
本发明的抗HIV剂作为艾滋病治疗剂或HIV感染的病症发展抑制剂使用时，最好选择蛋白质容易与生物体结合的合适的剂型及给药途径(静脉内给药等)。例如，作为本发明的医药组合物的给药方法，除了静脉内给药外，还可适当选择经粘膜给药、经皮给药、肌肉内给药、皮下给药、直肠内给药、经口给药等。而根据给药方法，可采用各种形态的制剂。以下所述为静脉给药制剂，但本发明所用的剂型并不仅限于这些，可利用医药制剂领域内常用的各种制剂。
研究日本人(479例)的MBP的基因变异及血中MBP浓度后有报道，仅有密码子54(GGC→GAC)的突变导致MBP的基因变异，各基因型的比例是野生型/野生型为70.8％、野生型/突变型为22.5％、突变型/突变型为6.7％。此外，有报道认为血中的MBP浓度是野生型/野生型为0.18～4.35μg/ml(平均1.26μg/ml)、野生型/突变型为0.00～0.80μg/ml(平均0.23μg/ml)、突变型/突变型为0.00～0.20μg/ml(平均0.04μg/ml)[芥子宏行等，医学的进展，194(12)，pp.957-958(2000)]。
本发明的抗HIV剂作为艾滋病治疗剂或HIV感染后的病症进展抑制剂使用时，由于健康常人的血中MBP浓度为约1μg/ml～约1.5μg/ml，利用ELISA等的方法测定血中MBP浓度后，因丙型肝炎等肝病症的影响MBP的产量下降，或因基因变异血中浓度较低时，最好按血中MBP浓度达到约1μg/ml～约1.5μg/ml的标准也可以决定本发明的抗HIV剂的静脉内给药量。此外，必须定期对HIV-RNA量及CD4阳性细胞数进行监控，掌握监控结果和MBP给药量的关系后再决定有效的血中MBP浓度值。血中MBP浓度如果为正常值，也可以慢慢提高血中浓度(例如，约1.5μg/ml～约5.0μg/ml)，定期对HIV-RNA量及CD4阳性细胞进行定期监控，在掌握监控结果和MBP给药量的关系后再决定有效的血中MBP浓度值。
MBP的有效血中浓度由于受个人天生的血中MBP浓度的左右，所以并不是一定的，较好设定为约1.0μg/ml～约50μg/ml，更好设定为约1.5μg/ml～约10μg/ml，给药前或给药后的血中浓度可在此范围外。由于基因变异也会导致血中MBP浓度下降，所以决定MBP给药量时也需考虑到基因变异的因素。
此外，根据其剂型(口服剂、注射剂、栓剂等公知的剂型)，作为制剂原料可加入溶剂、赋形剂、覆膜剂、基剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、溶解助剂、悬浮剂、粘稠剂、乳化剂、稳定剂、缓冲剂、等张剂、无痛化剂、保存剂、矫味剂、芳香剂和着色剂等添加剂。
这些添加剂的具体例子如下所述，但并不仅限于此。
溶剂精制水、注射用水、生理盐水、花生油、乙醇、甘油。
赋形剂淀粉类、乳糖、葡萄糖、白糖、结晶纤维素、硫酸钙、碳酸钙、滑石粉、二氧化钛、海藻糖、木糖醇。
覆膜剂白糖、明胶、乙酸邻苯二甲酸纤维素及上述高分子赋形剂。
基剂凡士林、植物油、聚乙二醇、水包油型乳剂性基剂、油包水型乳剂性基剂。
粘合剂淀粉及其衍生物、纤维素及其衍生物、明胶、褐藻酸钠、西黄耆胶、阿拉伯胶等天然高分子化合物、聚乙烯吡咯烷酮等合成高分子化合物、糊精、羟丙基淀粉。
润滑剂硬酯酸及其盐类、滑石粉、蜡类、小麦淀粉、聚乙二醇、加氢植物油、蔗糖脂肪酸酯、聚乙二醇。
崩解剂淀粉及其衍生物、琼脂、明胶末、碳酸氢钠、纤维素及其衍生物、羧甲基纤维素钙、羟丙基淀粉、羧甲基纤维素及其盐类及其交联体、低取代型羟丙基纤维素。
溶解助剂环糊精、乙醇、丙二醇、聚乙二醇。
悬浮剂阿拉伯胶、西黄耆胶、褐藻酸钠、单硬酯酸铝、柠檬酸、各种表面活性剂。
粘稠剂羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇、西黄耆胶、阿拉伯胶、褐藻酸钠。
乳化剂阿拉伯胶、胆固醇、西黄耆胶、甲基纤维素、各种表面活性剂、卵磷脂。
稳定剂亚硫酸氢钠、天冬氨酸、维生素E、螯和剂、惰性气体、还原性物质。
缓冲剂磷酸氢钠、乙酸钠、硼酸。
等张剂氯化钠、葡萄糖。
无痛化剂盐酸普鲁卡因、利多卡因、苯甲醇。
保存剂苯甲酸及其盐类、对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、逆性肥皂、苯甲醇、苯酚、乙汞智利水杨酸钠。
矫味剂白糖、糖精、肝精、山梨糖醇、木糖醇、甘油。
芳香剂苦橙皮酊、玫瑰油。
着色剂水溶性食用色素、色淀染料。
本发明的抗HIV剂除了上述成分之外，还可含有制药上允许的盐。制药上允许的盐(类)例如包括与无机碱、有机碱等碱形成的盐，与无机酸、有机酸、碱性或酸性氨基酸等的酸加成盐。这些盐(类)的具体例子如下所示，但并不仅限于此。
无机碱钠、钙等碱金属，钙、镁等碱土金属，铝和铵等。
有机碱乙醇胺等伯胺，二乙胺、二乙醇胺、二环己胺、N，N′-二苯甲基乙二胺等仲胺，三甲胺、三乙胺、吡啶、甲基吡啶、三乙醇胺等叔胺。
无机酸盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸。
有机酸甲酸、乙酸、乳酸、三氟乙酸、富马酸、草酸、酒石酸、马来酸、苯甲酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸。
碱性氨基酸精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸。
酸性氨基酸天冬氨酸、谷氨酸。
实施例以下，通过实施例对本发明进行具体说明，这些实施例的揭示，并不是对本发明进行限定性的解释。
以下实施例中被确证的抗HIV作用的用语不仅包括对HIV的中和作用，还包括对HIV的萌芽抑制作用，但为了方便起见简称为“中和作用”。
实施例1及2所用的HIV株的详细情况示于表1。
表1

实施例1本实施例对MBP的抗HIV活性进行研究。
首先，作为HIV株准备HIV-NDK实验株(D亚型，以下简称为“NDK”)和重组型流行株CRF01_AE(临床分离株，以下简称为“LP65”)。
然后，用这些HIV株使通过植物凝集素胚细胞化的人外周血单核细胞(人PBMC，以下简称为“PBMC”)和T细胞系的株化细胞M8166(以下简称为“M8166”)分别感染。
NDK和M8166都是能从美国国立卫生研究所(NIH)的AIDS Research and ReferenceRegent Program获得的菌株。
但是，MBP采用从人血液精制的nhMBP和通过国际公开公报第WO 99/37676号记载的方法合成的rhMBP。
在PBMC及M8166中分别添加暴发症型病毒NDK，在37℃对它们培养1小时使它们感染，所得感染株分别被称为NDK/PBMC及NDK/M8166。此外，分别在PBMC及M8166中添加LP65，在37℃对它们培养1小时使它们感染HIV。然后，在5×106个/ml的细胞中同时添加相当于100TCID50的病毒的量的NDK及LP65。所得感染细胞分别被称为“LP65/PBMC”及“LP65/M8166”。
然后，用PBS对感染细胞洗涤2次。以1～100μg/ml的浓度(图1)或1～30μg/ml的浓度(图2～3)在4种病毒感染细胞(NDK/PBMC、NDK/M8166、LP65/PBMC、LP65/M8166)中添加nhMBP或rhMBP。此时的细胞浓度每200μl为1×106个/ml(即，2×105个/200μ1)。即，1/5规模的200μl体系内放置了MBP1～100μg/1×106个/ml或1～30μg/1×106个/ml浓度的细胞，在添加了人血清的培养基中，在37℃、5％二氧化碳存在下对这些细胞培养1周。作为培养后的病毒量的变化指标，用全自动化学发光酶免疫测定系统(LUMIPULSE F富士REBIO株式会社制)，对培养上清液中的来自HIV的p24抗原量进行ELISA测定，与未添加MBP的组进行比较。
其结果是，如图3所示，确认了添加nhMBP的组对HIV量的抑制(HIV增殖抑制)。此外，如图1所示，确认NDK/M8166在rhMBP浓度为10μg/ml～30μg/ml的情况下，培养上清液中的p24抗原量在培养后迅速被抑制为未添加rhMBP的组的约50％。此外，从图2可明显看出，对于临床分离株LP65(HIV-1的重组型流行株CRF01_AE)，rhMBP在依赖浓度中和LP65的IC50约为10μg/ml时显现出抗HIV效果(HIV增殖抑制效果)，即，其抗HIV作用(中和作用)与亚型无关。
此外，在所用的MBP浓度范围内确认nhMBP及rhMBP都对细胞没有明显的增殖抑制作用和细胞毒性。本实验体系中，也暗示HIV的萌芽抑制作用，即从感染细胞释放HIV的抑制作用。
如上所述，本发明的抗HIV剂对E亚型HIV及D亚型HIV都显现出抗HIV作用。同样，本发明的抗HIV剂对CCR5/CXCR4向性病毒、巨噬细胞/T细胞向性病毒也显现出抗HIV作用。
实施例2作为HIV株准备92Th014实验株(B亚型)和JRCSF实验株(B亚型)。这些实验株都可从美国国立卫生研究所的AIDS Research and Reference Regent Program获得。此外，PBMC、nhMBP及rhMBP与实施例1所用相同。
首先，混合相当于100 TCID50的效价的病毒溶液50μl和终浓度为2、6、20、60μg/ml的nhMBP或rhMBP溶液50μl。然后，在37℃、5％二氧化碳气体存在下，对该混合溶液培养1小时，调制出nhMBP或rhMBP的终浓度为1、3、10、30μg/ml的第一混合系。
与此同时，将PBMC的浓度调整为2×105个/50μl，在其中混合终浓度为2、6、20、60μg/ml的nhMBP或rhMBP溶液50μl。然后，在37℃、5％二氧化碳气体存在下，对该混合溶液培养1小时，调制出nhMBP或rhMBP的终浓度为1、3、10、30μg/ml的第二混合系。
接着，合并MBP浓度(终浓度)被调整为1、3、10、30μg/ml的任何一个的第一混合系和第二混合系，于37℃培养一昼夜后，洗涤除去未反应的MBP和病毒。洗涤后，为了与洗涤前的MBP终浓度相等，添加新鲜的nhMBP或rhMBP，在含有10％的FCS的RPMI培养基(含有20单位/ml的白细胞介素2、50单位/ml的青霉素、50单位/ml的链霉素)中培养7天。作为培养后的病毒量变化指标，用全自动化学发光酶免疫测定系统(LUMIPULSE F富士REBIO株式会社制)，对培养上清液中的来自HIV的p24抗原量进行ELISA测定，与未添加MBP的组进行比较。
其结果是，对作为野生株病毒的JRCSF及92Th014都具有明显的抗HIV活性(HIV增殖抑制活性)。使p24抗原量减半所必须的MBP量(50％抑制浓度)在用于JRCSF时，nhMBP为0.19μg，rhMBP在2.74μg以下。同样，在用于92Th014时，nhMBP为7μg，rhMBP在1.57μg以下。从这些事实可说明，MBP对野生型B亚型病毒株也具有很好的抗HIV活性(中和活性)。
此外，从本实施例的结果可看出，本发明的抗HIV剂对CCR5向性病毒、巨噬细胞向性病毒也显现出抗HIV作用。本实施例中，直接证明了MBP对CCR5向性病毒显现出的抗HIV作用，所以MBP不仅可用于HIV感染初期的治疗，还可有效用于预防治疗和对感染·传播的抑制。另外，本实施例中直接证明了本发明的抗HIV剂对CCR5/CXCR4向性病毒也具有抗HIV作用，所以不仅对HIV感染的感染初期有效，对临床发展病症(即，不仅对HIV感染者对HIV患者)也有效。
从实施例1及实施例2获得结果可看出，因为对CCR5/CXCR4向性病毒显现出抗HIV作用的MBP对CCR5向性病毒显现出同样的抗HIV作用，所以认为MBP对CXCR4向性病毒也应显现出抗HIV作用。同样，因为对巨噬细胞/T细胞向性病毒显现出抗HIV作用的MBP对巨噬细胞向性病毒显现出同样的抗HIV作用，所以认为MBP对T细胞向性病毒也应显现出抗HIV作用。
从实施例1及实施例2的实验结果可看出，本发明的抗HIV剂对CCR5向性病毒、CXCR4向性病毒及CCR5/CXCR4向性病毒都显现出抗HIV作用。此外，本发明的抗HIV剂对巨噬细胞向性病毒、T细胞向性病毒及巨噬细胞/T细胞向性病毒都显现出抗HIV作用。
产业上利用的可能性以MBP为有效成分的本发明的抗HIV剂对包含活性中和最困难的重组型流行株CRF01_AE病毒的多种HIV株显现出中和活性。即，本发明的抗HIV剂与病毒的亚型、趋化因子受体向性、巨噬细胞/T细胞向性的种类和程度无关，尤其是对目前最不确定的B亚型HIV、D亚型HIV及CRF01_AE显现出规定的抗HIV作用。
此外，本发明的抗HIV剂也对CCR5向性病毒、CXCR4向性病毒及CCR5/CXCR4向性病毒都显现出抗HIV作用。另外，本发明的抗HIV剂还对巨噬细胞向性病毒、T细胞向性病毒及巨噬细胞/T细胞向性病毒显现出抗HIV作用。
本发明的抗HIV剂由于以糖链为目标，所以因HIV基因组变异而出现MBP耐性株的可能性很小。而且，由于MBP本身存在于生物体内，所以没有以往的HIV治疗中所用的化合物所产生的副作用。
因此，本发明的抗HIV剂能够应对多种因HIV而导致的感染症，对其治疗极为有用。
序列表<110>扶桑药品工业株式会社(FUSO PHARMACEUTICAL INDUSTRIES，LTD.)<120>抗HIV剂(Anti-HIV Agent)<130>03P451WO<150>JP 2002-189534<151>2002-06-28<160>3<210>1<211>3605<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1ggtaaatatg tgttcattaa ctgagattaa ccttccctga gttttctcac accaaggtga 60ggaccatgtc cctgtttcca tcactccctc tccttctcct gagtatggtg gcagcgtctt120actcagaaac tgtgacctgt gaggatgccc aaaagacctg ccctgcagtg attgcctgta180gctctccagg catcaacggc ttcccaggca aagatgggcg tgatggcacc aagggagaaa240agggggaacc aggccaaggg ctcagaggct tacagggccc ccctggaaag ttggggcctc300caggaaatcc agggccttct gggtcaccag gaccaaaggg ccaaaaagga gaccctggaa360aaagtccgga tggtgatagt agcctggctg cctcagaaag aaaagctctg caaacagaaa420tggcacgtat caaaaagtgg ctgaccttct ctctgggcaa acaagttggg aacaagttct480tcctgaccaa tggtgaaata atgacctttg aaaaagtgaa ggccttgtgt gtcaagttcc540aggcctctgt ggccaccccc aggaatgctg cagagaatgg agccattcag aatctcatca600aggaggaagc cttcctgggc atcactgatg agaagacaga agggcagttt gtggatctga660caggaaatag actgacctac acaaactgga acgagggtga acccaacaat gctggttctg720atgaagattg tgtattgcta ctgaaaaatg gccagtggaa tgacgtcccc tgctccacct780cccatctggc cgtctgtgag ttccctatct gaagggtcat atcactcagg ccctccttgt840ctttttactg caacccacag gcccacagta tgcttgaaaa gataaattat atcaatttcc900
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210 215 220Leu Leu Lys Asn Gly Gln Trp Asn Asp Val Pro Cys Ser Thr Ser His225 230 235 240Leu Ala Val Cys Glu Phe Pro Ile24权利要求
1.MBP的抗HIV作用的评价方法，其特征在于，包括以下步骤(1)培养使目标细胞和HIV共存而获得的感染细胞，(2)对经过培养的感染细胞进行洗涤获得洗净细胞，(3)在MBP存在下对洗净细胞进行培养，以及(4)测定来自培养上清液中的HIV的p24蛋白。
2.MBP的抗HIV作用的评价方法，其特征在于，包括以下步骤(a)培养HIV和MBP共存的第一混合系，(b)培养目标细胞和MBP共存的第二混合系，(c)合并第一混合系和第二混合系获得感染细胞，(d)对所得感染细胞进行培养，(e)对经过培养的感染细胞进行洗涤获得洗净细胞，(f)对洗净细胞进行培养，以及(g)测定来自培养上清液中的HIV的p24蛋白。
3.如权利要求2所述的评价方法，其特征在于，前述步骤(a)及(b)同时进行。
4.如权利要求2或3所述的评价方法，其特征在于，前述步骤(f)是在MBP存在下对洗净细胞进行培养。
5.如权利要求1或2所述的评价方法，其特征在于，前述抗HIV作用为HIV增殖抑制作用。
6.如权利要求5所述的评价方法，其特征在于，前述增殖抑制作用为HIV中和作用。
7.如权利要求5所述的评价方法，其特征在于，前述增殖抑制作用为HIV萌芽抑制作用。
8.如权利要求1或2所述的评价方法，其特征在于，前述MBP分离自人血清并被精制。
9.如权利要求1或2所述的评价方法，其特征在于，前述MBP通过基因工程方法从动物细胞分泌。
10.如权利要求9所述的评价方法，其特征在于，前述动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞。
11.如权利要求1或2所述的评价方法，其特征在于，前述HIV是属于HIV-1型的M组的B亚型的H IV株。
12.如权利要求1或2所述的评价方法，其特征在于，前述HIV是属于HIV-1型的M组的D亚型的HIV株。
13.如权利要求1或2所述的评价方法，其特征在于，前述HIV是重组型流行株。
14.如权利要求13所述的评价方法，其特征在于，前述重组型流行株为CRF01-AE。
15.如权利要求1或2所述的评价方法，其特征在于，前述HIV是具有CCR5向性的病毒。
16.如权利要求1或2所述的评价方法，其特征在于，前述HIV是具有CXCR4向性的病毒。
17.如权利要求1或2所述的评价方法，其特征在于，前述HIV是同时具有CCR5向性及CXCR4向性的病毒。
18.如权利要求1或2所述的评价方法，其特征在于，前述HIV是具有巨噬细胞向性的病毒。
19.如权利要求1或2所述的评价方法，其特征在于，前述HIV是具有T细胞向性的病毒。
20.如权利要求1或2所述的评价方法，其特征在于，前述HIV是同时具有巨噬细胞及T细胞向性的病毒。
21.MBP，其特征在于，具有权利要求1或2所述的评价方法确定的抗HIV作用。
全文摘要
结合甘露糖的蛋白质(MBP)的抗HIV作用的评价方法，其特征在于，包括以下步骤(1)培养使目标细胞和HIV共存而获得的感染细胞，(2)对经过培养的感染细胞进行洗涤获得洗净细胞，(3)在MBP存在下对洗净细胞进行培养，以及(4)测定来自培养上清液中的HIV的p24蛋白。
文档编号G01N33/68GK1876833SQ20061007926
公开日2006年12月13日 申请日期2003年6月30日 优先权日2002年6月28日
发明者若宫伸隆, 大谷克城, 坂本隆志, 芥子宏行, 岸雄一郎 申请人:扶桑药品工业株式会社