专利名称：：一种用于分离溶菌酶的亲和层析介质及其制备方法
技术领域：
：本发明属于蛋白纯化试剂领域，具体而言，本发明涉及一种以甲壳素为原料的亲和层析介质及其制备方法。
背景技术：
：亲和层析是应用生物高分子与配基可逆结合的原理，将配基通过共价键牢固结合于载体上而制得的层析系统。这种可逆结合的作用主要是靠生物高分子对它的配基的空间结构的识别。常用的生物亲和关系有酶-底物、底物类似物、抑制剂、激活剂、辅因子，抗体-抗原，激素-受体蛋白、载体蛋白，外源凝集素-多糖、糖蛋白、细胞表面受体，核酸-互补核苷酸序列、组蛋白、核酸结合蛋白等亲和层析中配基与欲分离物吸附作用的大小主要与配基的空间结构有关，因此可以用分子间相互作用的平衡常数KD来衡量亲和作用强度。但它们的结合力仍不外乎对应的功能基团之间的氢键、静电作用、疏水作用等。所以，除了可改变配基以改变亲和层析的作用强度以外，还可以通过改变pH和离子强度的方法来改变配基与生物大分子之间的亲和力，从而达到洗脱的目的。但由于亲和层析的多样性，洗脱的条件常常需要通过实验来获得。除此以外，还可运用其它配基、抑制剂等物质与出层析剂上的配基或生物大分子产生竞争性结合，达到洗脱的目的，这种方法被称为专一性洗脱。专一性洗脱可以获得很高的分辨能力，但洗脱剂的价格较高，所以常与普通洗脱配合使用。值得注意的是，在洗脱时，会有少许配基与蛋白质一同被洗脱下来，因此常在其后加一凝胶层析以除去小分子的配基。溶菌酶的用途相当广泛。在国外，溶菌酶普遍的应用在食品的杀菌、保鲜、防腐以及微生物发酵和生物工程技术中菌体内容物如核酸、蛋白质、抗生素、酶等的提取。在医药和临床上，溶菌酶制成的各种药物具有抗菌抗病毒、消炎、消肿、增强抗菌素疗效等作用。在国内，溶菌酶尚未得到充分应用，主要是由于国内生产溶菌酶的产量低、质量差，医药、食品及科研用溶菌酶仍依赖进口。随着食品工业、微生物工业和生物工程技术的迅速发展，以及溶菌酶在医药领域上的推广应用，人们对溶菌酶的需求量与日俱增，同时，对溶菌酶质量的要求也越来越高，因此，许多研究者都在寻找新的溶菌酶分离纯化技术，以提高溶菌酶产品的纯度及活性。到目前为止，尚未有报道将甲壳素作为亲和层析介质，即配体，用于分离溶菌酶。
发明内容本发明的目的是提供一种操作简易、成本低廉并且高效的用于溶菌酶分离的亲和层析介质。本发明的另一个目的是提供上述介质的制备方法。本发明提供了一种亲和层析介质，该层析介质是碱化后的甲壳素。甲壳素即2-^乙酰氨基-2_脱氧-日-1，4-葡萄糖，是由2-N-乙酰氨基-D-葡萄糖通过P-1，4糖苷键聚合而成的直链含氮多糖，是与纤维素结构极为相似的天然高分子。本发明所用的甲壳素可以以目前各类市售产品为原料，例如，sigma公司的(C7170)，以及济南海得贝海洋生物工程有限公司，青岛海普生物技术有限公司，潍坊科海甲壳素有限公司等公司的商品。本发明中，将甲壳素在10-3(TC条件下碱化6-36小时后，静置并洗至中性，从而制成层析介质。所用碱为氢氧化钠、氢氧化钾中的一种或者几种，甲壳素与碱中0H—的质量摩尔比为25-200:1，单位为克/摩尔。较好的，可以将甲壳素碱化静置后，经过过滤再洗涤至中性备用。过滤的方法可以是脱脂纱布过滤，等等。这里洗涤至中性是指洗去吸附在甲壳素表面的碱，从而使其置于水中呈中性，即PH为7左右。更好的，可以在甲壳素碱化后，用酸处理再静置洗涤至中性备用。所用酸为可以是醋酸、柠檬酸、乙酸等弱酸。浓度为1-5M。经处理后，介质颗粒能够迅速沉淀，无絮状漂浮物，再已低浓度的醋酸洗脱空柱时，洗脱液280nm吸光值应较小。本发明中，介质溶胀(即介质得率)计算方法为将一定质量介质经碱化，过滤、洗净处理或经碱化，过滤、洗净，冰冻处理后，浸于蒸馏水，置量筒中自然沉降12h，读取介质湿体积V，介质溶胀比率=V/介质质量。本发明中，介质收縮比率计算方法为将一定体积经充分溶胀的介质装柱，用pH6.40的0.02MPBS平衡柱床后，计算柱体积Va，换用0.1M醋酸溶液平衡柱床，计算柱体积Vb，介质收縮比率=1-Vb/Va。本发明中，介质相对流速比率测定方法为在0.05MPa压力下，测定单位时间空床中O.lM醋酸溶液流速v"将相同体积各组介质装柱，使用O.1M醋酸溶液平衡柱床，在0.05MPa压力下，测定单位时间各介质流速ve。介质相对流速比率=Vp/vuo本发明中，介质吸附容量比较方法为采用静态吸附法量取lml充分溶胀各组介质，加入3ml蒸馏水及lml的浓度为10mg/ml的鸡溶菌酶(c-LYZ)，混匀，待稍沉降，取0.5ml上清液，5000rpm离心10min，取0.4ml上清液，用蒸馏水稀释至2ml，测280，吸光度，记为A1;另将原液室温，静置6h后，5000rpm离心10min，计算上清液体积V,取0.5ml上清液，5000rpm离心10min，取0.4ml上清液，用蒸馏水稀释至2ml，静置6h，湖lj280nm吸光度，记为A2，AfA,-A"介质的吸附容量Qh力「AAXVX介质溶胀比率。本发明中，甲壳素亲和介质吸水量计算方法为取真空低温冻干的甲壳素亲和介质O.05g，加入O.5ml双蒸水，室温溶胀6h后，3000rpm离心30min，计算上清液体积，并计算单位质量甲壳素亲和介质吸水量。本发明中，介质得率计算方法将一定质量介质经碱化，过滤、洗净处理后，浸于蒸馏水，置量筒中自然沉降12h，读取介质湿体积V,，介质溶胀比率-V,/介质质量；将上述介质经O.1M醋酸处理后，过滤、洗净，浸于蒸馏水，置量筒中自然沉降12h，读取介质湿体积V2，介质得率=V2/介质质量。本发明中，介质的损耗比率=1_介质得率/介质溶胀比率。本发明中，介质的吸附容量Q—yJAAXVX介质溶胀比率。另一方面，本发明提供了上述介质的制备方法，即将甲壳素在10-3(TC条件下碱化3分钟-24小时后，静置并洗至中性。本发明的制备方法中，所用碱为氢氧化钠、氢氧化钾中的一种或者几种。所用碱的浓度可以是1-IOM，用量可以是浴比1:5-20。本发明的制备方法中，碱化时间可以是6-18小时。例如，6小时，IO小时，12小时，15小时，18小时，等等。本发明的制备方法中，甲壳素与碱中0H—的质量摩尔比可以是25-200:1，单位为克/摩尔。本发明的制备方法中，甲壳素碱化静置后，经过过滤再洗涤至中性备用。本发明的制备方法中，反应温度为15-25'C。例如，15°C，18°C，20°C，25°C等等。也可以是10。C，13°C，28°C,，3(TC等。本发明的制备方法中，甲壳素碱化后，用弱酸处理再静置洗涤。所用酸可以是醋酸、柠檬酸、乙酸等弱酸。本发明的制备方法中，在酸处理时，加入甲壳素与酸中H+的质量摩尔比为25-200:1，单位为克/摩尔。本发明中，未提及的反应条件可根据具体实验情况采用常规条件进行。本发明采用甲壳素为原料，制备分离纯化溶菌酶的亲和色谱介质。本发明采用的制备方法简便易行，成本低廉；甲壳素亲和介质吸附性专一，流速较快；采用甲壳素亲和介质纯化人溶菌酶，步骤简单高效，经过一次纯化，即可从发酵液中分离到近100%的纯度的溶菌酶，纯化效率明显高于离子交换层析。因此，本研究的甲壳素亲和介质制备工艺可适用于大规模的工业生产。具体实施例方式下面结合实施例对本发明进一步说明。实施例中涉及的主要试剂有30%丙烯酰胺凝胶贮存液取丙烯酰胺29g，亚甲双丙烯酰胺lg，溶于60ml双蒸水，定容至100ml，pH小于7.0，置棕色瓶4'C保存。10%过硫酸铵取lg过硫酸铵溶于10ml双蒸水，4'C保存。1.5MTris-HC1缓冲液(pH8.8):取Tris碱18.16g，充分溶于50ml双蒸水，用浓盐酸调节pH至8.0，定容至100ml。lMTris-HC1缓冲液(pH6.8):取Tris碱12.llg，充分溶于80ml双蒸水，用浓盐酸调节pH至6.8，定容至100ml。蛋白电泳上样缓冲液取0.5mol/LTrisCI(pH6.8)5ml，SDSlg，0-巯基乙醇0.6ml,5(F。甘油8ml，0.05M溴酚蓝lml，双蒸水4.4ml混合。电泳缓冲液取Tris3.03g，甘氨酸14.41g，双蒸水定容至lml,加SDSlg，搅拌溶解。实施例中涉及的主要仪器有:蛋白凝胶电泳系统凝胶成像分析系统752紫外可见光分光光度计美国Bio-Rad公司美国UVP公司上海精密科学仪器有限公司Agilentseries1100型HPLC分析仪美国Hewlett-Packard公司PHSJ-4A型pH计上海精密科学仪器有限公司恒温摇床上海市离心机械研究所磁力搅拌器上海精密科学仪器有限公司净化工作台苏州安泰空气技术有限公司透析袋华美生物工程公司实施例1碱化对介质性能的影响Al，取5g甲壳素，溶于100ml的蒸馏水中，室温磁力搅拌6h，静置6h，备用；A2，取5g甲壳素，溶于100ml的蒸馏水中，室温磁力搅拌6h，用二层脱脂纱布过滤、洗净，重新用100ml蒸馏水浸润，静置，备用；A3,取5g甲壳素，溶于100ml的10MNaOH溶液中，室温磁力搅拌，碱化6h后，过滤、洗至中性，浸于蒸馏水中，静置，备用。结果具体见表l。表l碱化对介质性能的影响组别形态颜色介质得率(ml/g)收縮比率相对流比QrhyzAl粒状米黄10.518.7%7.7%15.6A2粒状米黄6.734.7%7.8%5.9A3粒状乳黄6.825.6%10.8%8.6实施例2稀酸处理对介质性能的影响取5g甲壳素4份，溶于100ml的10顯aOH溶液中，室温磁力搅拌，碱化6h后，过滤、洗至中性，Cl，处理方法同步骤A3;C2，经步骤A3处理后，向介质溶液中加入等量pH6.40的0.04MPBS,搅拌5min后，过滤、洗至中性，浸于蒸馏水中，静置，备用；C3，经步骤A3处理后，向介质溶液中加入等量0.2M醋酸，搅拌5min后，过滤、洗至中性，浸于蒸馏水中，静置，备用。结果具体见表2。表2醋酸处理对介质性能的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例3NaOH浓度对介质性能的影响取5g甲壳素3份，El，处理方法同D12(见实施例5);E2，采用5MNaOH溶液碱化，其他处理方法同D12;E3，采用2.5MNaOH溶液碱化，其他处理方法同D12。检测各项指标同上。结果具体见表3。表3NaOH浓度对介质性能的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>取5g甲壳素三份，Fl，溶于50ml的2.5MNaOH溶液中，其他处理方法同E3;F2，溶于100ml的2.5顧aOH溶液中，其他处理方法同E3;F3，溶于200ml的2.5顧aOH溶液中，其他处理方法同E3。检测各项指标同上。结果具体见表4。表4浴比对介质性能的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例5碱化时间对介质性能的影响取5g甲壳素4份，溶于100ml的10MNaOH溶液中，Dll，处理方法同步骤C2，D12，室温磁力搅拌，碱化12h，其他处理方法同C2;D13，室温磁力搅拌，碱化18h，其他处理方法同C2;D14，室温磁力搅拌，碱化24h，其他处理方法同C2。检测各项指标同上。具体结果见表5。表5碱化时间对介质性能的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例6甲壳素亲和介质吸附容量取甲壳素介质16ml，加入发酵液上清250ml，室温磁力搅拌吸附0.5h，沉淀10min，倾去上清液，加入500ml双蒸水，搅拌洗涤后沉淀10min，重复洗漆一次，倾去上清液。将甲壳素亲和介质装10mmX20cm色谱柱，用pH6.24的0.02MPBS洗柱，待流出液OD，m值降至O.OlO以下后，换用pH3.27的0.05M醋酸溶液解离，收集洗脱液，洗脱液0D28。^降至0.010以下后停止收集。用1M碳酸盐缓冲液调节洗脱液pH至8.0，进行DEAE-S印hadexA-25阴离子交换色谱，收集洗脱液，用1M醋酸调节洗脱液pH至6.24。将酶液装入适当长度的截流范围40006000的透析带，4'C下用IO倍体积双蒸水透析12h，中间换水34次。将酶液分装，进行真空冷冻干燥，计算产品质量及甲壳素亲和介质吸附容量。结果表明，使用16ml甲壳素亲和介质，可从250ml发酵液上清中纯化到6.5mg的rh-LYZ，因此，在此吸附条件下，每ml甲壳素亲和介质的吸附容量约为0.4mg。实施例7甲壳素亲和层析介质的制备方法将一定目数甲壳素(通常为60目)用2MNaOH溶液，以1:IO浴比，在搅拌下室温碱化12h—二层脱脂棉纱布过滤，用50倍体积蒸馏水洗涤3次，复浸于一定体积蒸馏水中一加入等体积0.2M乙酸溶液，室温磁力搅拌5min—二层脱脂棉纱布过滤，用蒸馏水洗至中性，复浸于一定体积蒸馏水中，加入无水乙醇至20%浓度，4'C保存，备用。实施例8鸡溶菌酶(c-LYZ)的纯化取甲壳素介质15ml，加入发酵液上清，室温磁力搅拌吸附0.5h，沉淀10min后，倾去上清液，将介质装lcmX20cm色谱柱，用pH6.4的0.02MPBS洗柱床，洗脱液OD^值降至0.010以下后，换用pH3.27的0.05M醋酸溶液解离，收集洗脱液，洗脱液0028。降至0.010以下后停止收集。换用pH5.42的0.2M醋酸钠缓冲液解离，收集洗脱液，待洗脱液0D28^降至0.010以下后停止收集；再用pH3.27的0.05M醋酸溶液解离，以1.5ml为单位收集洗脱液，洗脱液OD，^降至0.010以下后停止收集。一步洗脱法纯化的c-LYZ粗产品SDS-PAGE，使用BandScanV4.30软件分析。结晶中蛋白含量(按分子量大小)分别为24.5%，28.1%,47.4%，上清中c-LYZ纯度为100%。权利要求1.一种用于分离溶菌酶的亲和层析介质，其特征在于，该层析介质是碱化后的甲壳素。2.如权利要求l所述介质的制备方法，其特征在于，将甲壳素在7-30'C条件下碱化6-36小时后，静置并洗至中性，即可。3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所用碱为氢氧化钠、氢氧化钾中的一种或者几种。4.如权利要求2所述的制备方法，5.如权利要求2所述的制备方法，尔比为8-200:1，单位为克/摩尔。6.如权利要求2所述的制备方法，尔比为25-150:l，单位为克/摩尔。7.如权利要求2所述的制备方法，过滤再洗涤至中性备用。8.如权利要求2所述的制备方法，9.如权利要求2所述的制备方法，者柠檬酸处理至中性再静置洗涤。10.如权利要求9所述的制备方法,其特征在于，碱化时间为8-24小时。其特征在于，甲壳素与碱中OH—的质量摩其特征在于，甲壳素与碱中0H—的质量摩其特征在于，甲壳素碱化静置后，经过其特征在于，反应温度为15-25'C。其特征在于，甲壳素碱化后，用醋酸或其特征在于，酸处理时，加入甲壳素与酸中H+的质量摩尔比为25-200:1，单位为克/摩尔<全文摘要本发明属于蛋白纯化试剂领域，具体而言，本发明涉及一种以甲壳素为原料的亲和层析介质及其制备方法。本发明采用甲壳素为原料，制备分离纯化溶菌酶的亲和色谱介质。本发明采用的制备方法简便易行，成本低廉；甲壳素亲和介质吸附性专一，流速较快；采用甲壳素亲和介质纯化人溶菌酶，步骤简单高效，经过一次纯化，即可从发酵液中分离到近100％的纯度的溶菌酶，纯化效率明显高于离子交换层析。因此，本研究的甲壳素亲和介质制备工艺可适用于大规模的工业生产。文档编号B01J20/281GK101352673SQ20071004425公开日2009年1月28日申请日期2007年7月26日优先权日2007年7月26日发明者龙余,唐丽莎,李宗林,鹏黄申请人:复旦大学