专利名称：利用超临界萃取-结晶技术提取分离千层塔及其毛状根中石杉碱甲的方法
技术领域：
本发明涉及利用超临界萃取-结晶技术提取分离千层塔及其毛状根中石杉碱甲的方法。
背景技术：
千层塔是蕨类植物石杉科石杉属蛇足石杉的全草，民间应用于散疲化血、消肿止疼、除湿、清热解毒。其所含生物碱石杉碱甲和石杉碱乙具有很强的抑制胆碱脂酶活性，临床实验证实石杉碱甲对治疗早老性痴呆有显著疗效。从千层塔中提取的石杉碱甲，是中国独创的一种世界级新药。属于可逆性胆碱酷酶抑制剂，是目前治疗良险记忆障碍和早老性痴呆症最为安全有效的药物之一。
现已有文献报道提取制备石杉碱甲的方法。沈生荣等(石杉碱甲提取工艺研究，浙江大学学报(农业与生命科学版)2002，28 (6)，591-595)系统研究了石杉碱甲的提取工艺。系用有机酸浸提、萃取、反萃取、脱色和重结晶等化学分离技术从千层塔中提取、纯化石杉碱甲。可得到纯度大于99%的高纯度石杉碱甲。杨明等(HPLC法制备石杉碱甲，解放军药学学报2003，19 (5)，352-354)建立了用制备型HPLC制备石杉碱甲的方法。用常规的方法提取出石杉总生物碱，总生物碱经HPLC直接进样，以氯仿一甲醇一氨水(840 24 1.2)为流动相，可得到纯度大于90%的石杉碱甲。刘建廷等(石杉碱甲提取工艺研究，天然产物研究与开发2006，18 =298-301)研究了以蛇足石杉为原料，采用生物碱分离的传统方法，通过盐酸浸提，氯仿萃取来制取纯化石杉碱甲。陈建华等(高速逆流色谱技术制备石杉碱甲单体，中国现代应用药学杂志2006，23(4)，295-297)运用高速逆流色谱技术，以 n-Hexane/n-Bu0H/H20(4 I 5，V/V/V)为两相溶剂体系，在优化的工艺参数条件下，获得了单体纯度为98. 6% (HPLC)的石杉碱甲单体。近年来也出现了一些有关制备石杉碱甲的专利文献。《一种从千层塔中提取分离石杉碱甲的方法》(中国专利，CN01134743A)用有机溶剂提取，调酸；阳离子交换树脂色谱分离，洗脱，浓缩成浸膏；经硅胶搅拌，上硅胶柱色谱，混合洗脱剂洗脱，浓缩，结晶，可得纯度达98 %的石杉碱甲。《一种高纯度石杉碱甲的制备方法》(中国专利，CN1587260A)用正构烷烃一脂肪醇一水作为溶剂体系，用高速逆流色谱法从石杉属植物千层塔中分离高纯度石杉碱甲。《从中草药千层塔中提取石杉碱甲的方法》(中国专利CN1448390A)应用以下工艺步骤制备石杉碱甲原料粉碎一浸溃一浓缩一萃取(反复)一柱层析一结晶一高效液相色谱选段一浓缩干燥一成品，纯度达到98%以上。
《一种分析与分离制备石杉碱甲和石杉碱乙的方法》(中国专利，CN1704405A)采用原料粉碎浸泡一大孔吸附树脂富集浓缩一反相柱层析一非烷基键合相硅胶介质柱层析一浓缩结晶的工艺制备分离，最后可获得纯度> 98%的石杉碱甲和石杉碱乙。《从植物中提取石杉碱甲的工艺》(中国专利，CN1861580A)采用石筋草为原料和原料粉碎一酸液浸泡一浓缩一活性炭脱色一调节PH值一氯仿萃取一减压回收一硅胶拌样挥发一乙醇氯仿溶液洗脱一减压回收一结晶一干燥的工艺，提取石杉碱甲。《一种从千层塔中提取分离高纯度石杉碱甲的新方法》(中国专利，CN101693689A)采用制备提取液一大孔树脂预分离一高效逆流色谱纯化工艺，制得纯度在98%以上的石杉碱甲。上述各种方法或得到的产品纯度较低，或收率较低，或操作比较麻烦，有的生产成 本较高，生产规模较小，不能满足市场需求。
发明内容
一
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种操作简便、分离量大，综合成本低，生产周期短的快速制备高纯度石杉碱甲的方法。本发明是一种从千层塔中提取纯化石杉碱甲的方法，其技术方案包括如下步骤①备料取阴干的、含量较高的千层塔植物或其毛状根粉碎成40 100目的干粉、1%盐酸或1%酒石酸、二氧化碳流体、乙醇、丙酮及氯仿，其中二氧化碳流量与干粉中石杉碱甲含量的重量比为100 200 1，二氧化碳与乙酸的重量比为100 2 10 ;②原料浸润、微波辐射取千层塔植物或其毛状根干粉，置带微波装置的萃取釜中，加酸液浸润过夜，开启微波进行辐射，辐射频率为2300 2600MHz，功率为3000 6000W，辐射时间120 240S(以水温不超过60°C为限)；③萃取在萃取釜内压力为15 45MPa、温度为34 60°C条件下，按上述重量比通入携带有夹带剂乙醇的超临界态的二氧化碳进行一级萃取，时间为40 80min,萃取液通入一级分离器，在压力为15 45MPa，温度为30 40°C条件下分离出膏状物溶液和废渣，将该膏状物溶液通入二级萃取釜，在压力为15 45MPa，温度为30 40°C条件下进行二级萃取，时间为lt，将二级萃取物通入二级分离器，在压力为5 15MPa、温度为30 50°C条件下，从二级分离器中分离出膏状物、乙醇及二氧化碳，该二氧化碳经冷凝压缩后再次携带夹带剂乙醇进入一级萃取釜进行下一轮萃取，完成一个循环所用时间为3 5h ;④梯度结晶将二级分离器中的膏状物直接加入微粉硅胶，搅拌均匀，挤压过100目以上筛网，混合均匀。分别使用甲醇、乙醇、丙酮、氯仿为夹带剂，温度分别为32 38°C、42 48°C、52 58°C、62 68°C，压力分别为 11 13MPa、15 17MPa、19 21MPa、23 25MPaMPa，进行超临界梯度萃取结晶，分别得到五种生物碱；⑤结构鉴定将分离出的各化合物进行结构鉴定，紫外分析仪用ZF-I型(上海顾村中实仪器厂)，红外光谱用Tensor 27型红外光谱仪(Btaker公司生产)，KB r压片；质谱用VarianMat — 711质谱仪,核磁共振谱用Bmker DRX 一 500核磁共振仪，TMS为内标，化学位移(S )值的单位用ppm，偶合常数J的单位为Hz ；⑥纯度测定将分离出的各个化合物用高效液相色谱法，采用面积归一化法测定各化合物的纯度，结果分离出的各化合物纯度均达到99%以上。
二、本发明的创造点、新颖性及与传统工艺相比具有的优势常用的提取方法(如煎煮法、回流法、浸溃法、渗漉法等)在保留有效成分，去除无效成分方面，存在着有效成分损失大、周期长、工序多。提取率不高等缺点。本发明采用在中药提取方面出现了微波细胞破壁、超临界萃取、超临界梯度结晶等多种新技术、新方法，些新技术和方法的应用，使得中草药提取既符合传统的中医理论，又能达到提高有效成分的收率和纯度的目的。①本发明采用了新颖的细胞破壁技术一微波破壁技术，，中药之所以能治病，是因为其所含的化学(有效)成分。植物性中药的有效成分通常分布在细胞内与细胞间质中，且以细胞内为主。细胞壁位于细胞膜之外，也就是说，植物性中药的有效成分往往包裹在细胞壁之内。细胞壁是由纤维素、半纤维素、果胶质、木质素等物质构成的致密结构，可保护细胞抵抗低渗环境，使细胞在低渗的环境下不易破裂，对维持固有形态起重要作用；可允许水分及直径小于Inm的可溶性小分子自由通过，与物质交换有关。中药的提取过程是由浸润、渗透、解吸、溶解、扩散、置换等6个相互联系、相互交错的阶段所组成。当溶剂加入到中药中，由于渗透和扩散作用，使溶剂逐渐通过细胞壁、细胞膜渗透到细胞内，溶剂在细胞 内溶解了大量的可溶性成分，造成细胞内、外溶液的浓度差而产生了渗透压。在渗透压的作用下，细胞内有效成分通过扩散，不断地从细胞壁、细胞膜向外释放出来，而细胞外的溶剂又不断进入，直至达到动态平衡，释放停止。目前可用于植物细胞破壁的技术有超微粉碎、超声波提取、微波萃取、酶法提取等方法。这几种方法各有优劣超微粉碎对直接入药的药材粉末，有效成份需要在人体内溶出释放的，提高药效比较明显；超声波提取、微波萃取、酶法提取都是用大量溶媒为基础，提取时间较长，有效成份损失也较大。本发明采用药材浸润后微波破壁技术，有效控制升温带来的有效成份破坏，同时不至于使药材粉末过于细小，黏液质、胶质等无效成份的过量溶出，使提取物更容易精制。②本发明采用了超临界液体萃取技术提取千层塔及其毛状根中石杉碱甲。超临界流体萃取(简称SCFEFE)是以超临界流体(简称SCF)代替常规有机溶剂对中草药有效成分进行革取和分离的新型技术。本发明中利用二氧化碳在临界点附近某区域(超临界区)内与行层塔及其毛状根中的生物碱等溶质具有异常相平衡行为和传递性能，用乙醇为夹带剂提取石杉碱甲等生物碱。③本发明利用由于微粉硅胶具有粒度小、孔容大、表面活性强的特点，采用微粉硅胶稀释提取物，加大了在梯度结晶分离多种生物碱时萃取剂与提取物的接触面积，使多种生物碱更容易分离。目前微粉硅胶多用于片剂胶囊剂，微囊等的稀释剂或填充剂、助流剂、抗黏附剂混悬液、软膏、栓剂的混悬剂或增稠剂，乳剂的稳定剂，固体制剂中液体组的分散齐U，消泡剂。也可用于香精、香料中作吸附干燥剂。但作为超临界梯度结晶技术中的应用是比较新颖的。④本发明采用梯度结晶方法分离提取的生物碱。生物碱的分离方法的确很多，既有经典的分离方法，如溶剂萃取法、蒸馏法、沉淀法、盐析法、结晶法、膜渗透升华法等，也有较为现代、先进的分离方法，如色谱分离法。但利用超临界梯度结晶方法分离还是首次尝试。经过摸索，把提取物附加在适宜载体上，利用二氧化碳对生物碱的溶解能力随压力和温度的改变而在相当宽的范围内变动，成功地从千层塔及其毛状根中提取的多种生物碱混合物中萃取出高纯度的待分离组分。
①附图I 5为分离出的五种化合物根据结构鉴定及相关文献确定的石杉碱甲的结构式。②附图6 10为分离出的五种化合物用高效液相色谱法外标法测定含量色谱图。经测定，从千层塔及其毛状根中分离出的五种生物碱供应量都达到99%以上。
具体实施方式
①备料取阴干的、含量较高的千层塔植物或其毛状根粉碎成40 100目的干粉、1%盐酸或1%酒石酸、二氧化碳流体、乙醇、丙酮及氯仿，其中二氧化碳流量与干粉中石杉碱甲含量的重量比为100 200 1，二氧化碳与乙酸的重量比为100 2 10。②原料浸润、微波辐射取千层塔植物或其毛状根干粉，置带微波装置的萃取釜中，加酸液浸润过夜，开启微波进行辐射，辐射频率为2300 2600MHz，功率为3000 6000W，辐射时间120 240S(以水温不超过60°C为限)。③萃取在萃取釜内压力为15 45MPa、温度为34 60°C条件下，按上述重量比通入携带有夹带剂乙醇的超临界态的二氧化碳进行一级萃取，时间为40 80min,萃取液通入一级分离器，在压力为15 45MPa，温度为30 40°C条件下分离出膏状物溶液和废渣，将该膏状物溶液通入二级萃取釜，在压力为15 45MPa，温度为30 40°C条件下进行二级萃取，时间为lt，将二级萃取物通入二级分离器，在压力为5 15MPa、温度为30 50°C条件下，从二级分离器中分离出膏状物、乙醇及二氧化碳，该二氧化碳经冷凝压缩后再次携带夹带剂乙醇进入一级萃取釜进行下一轮萃取，完成一个循环所用时间为3 5h。④梯度结晶将二级分离器中的膏状物直接加入微粉硅胶，搅拌均匀，挤压过100目以上筛网，混合均匀。分别使用甲醇、乙醇、丙酮、氯仿为夹带剂，温度分别为32 38°C、42 48°C、52 58°C、62 68 ，压力分别为 11 13MPa、15 17MPa、19 21MPa、23 25MPaMPa，进行超临界梯度萃取结晶，分别得到五种生物碱。⑤结构鉴定将分离出的各化合物进行结构鉴定，紫外分析仪用ZF-I型(上海顾村中实仪器厂)，红外光谱用Tensor 27型红外光谱仪(Btaker公司生产)，KB r压片；质谱用VarianMat — 711质谱仪,核磁共振谱用Bmker DRX 一 500核磁共振仪，TMS为内标，化学位移(S )值的单位用ppm，偶合常数J的单位为Hz。⑥纯度测定将分离出的各个化合物用高效液相色谱法，采用面积归一化法测定各化合物的纯度，结果分离出的各化合物纯度均达到99%以上。实施例I :取千层塔粗粉10kg，加I %盐酸溶液20kg，浸泡过夜，超声120S，用乙醇为夹带剂，超临界萃取，得到相对密度为I. 26 (60°C热测)2. 41kg。实施例2 :取千层塔粗粉10kg，加I %盐酸溶液30kg，浸泡过夜，超声240S，用乙醇为夹带剂，超临界萃取，得到相对密度为I. 25(60°C热测)2. 46kg。实施例3 :取千层塔粗粉10kg，加I %酒石酸溶液20kg，浸泡过夜，超声120S，用乙醇为夹带剂，超临界萃取，得到相对密度为I. 27(60°C热测)2. 44kg。实施例4 :取千层塔粗粉10kg，加I %酒石酸溶液30kg，浸泡过夜，超声240S，用乙醇为夹带剂，超临界萃取，得到相对密度为I. 24(60°C热测)2. 48kg。
实施例5 :取浸膏5. 0kg，加微粉硅胶，搅拌均匀，挤压过100目以上筛网，混合均匀，用甲醇作夹带剂，压力11 13MPa，温度42 48°C，超临界萃取结晶，得到无色结晶化合物I ;提高温度到62 68°C，压力19 21MPa，得到无色针晶化合物2。实施例6 :取浸膏5. Okg,加微粉硅胶，搅拌均匀，挤压过100目以上筛网，混合均匀，用氯仿作夹带剂，压力15 17MPa，温度32 38°C，超临界萃取结晶，得到无色粉末化合物3 ;提高温度到52 58°C，压力23 25MPa，得到无色粉末化合物4 ;接着将夹带剂由氯仿换为水后，保持压力温度不变，得到白色粉末状化合物5。实施例7 :对化合物I进行结构鉴定，结果溶于甲醇，|flg:-150. 4(c0. 498，MeOH)，碘化铋钾显色呈红色，EI-MS显示分子量为242，结合1H-NMR和13C-NMR推定分子式为C15H18N2O0 1H-NMR 显示有 2 个芳香质子[δ 6. 45 (1Η，d，J = 9. 4，H_2)，7. 92 (1H，d，J = 9· 4，H-3) ]、2 个烯质子信号[δ 5. 53 (1H，q，J = 6· 7，H-II)，5. 45 (1H，d, J = 4.8, H_8) ]，I 个双峰甲基[δ I. 72(3H，d，J = 6. 7Hz，H-10)]和 I 个单峰甲基[δ I. 56 (3Η，s，Η-16) ]。13C-NMR和DEPT谱表明含有9个不饱和碳信号(其中I个为羰基碳)、2个CH2、I个CHl个季碳和2 个 CH3。IH-NMR(CD3OD) δ 7. 92(lH，d，J = 9· 4，H_3)，6· 45 (1H，d，J = 9· 4，H_2)，5· 53 (1H，q, J = 6. 7，H-II)，5. 45 (1H, d, J = 4. 8，H_8)，3. 67 (1H, brs, H_7)，2. 83 (1H, dd, J = 17. 3，
5.l，H-6)，2. 64 (1H, dd, J = 17. 0,0. 9，H_6)，2. 26(lH，d，J = 16. 8，H_14)，2. 17 (1H, d, J =16. 8，H-14)，I. 70 (3H, d, J = 6. 7，H-10)，I. 56 (3H, s’ H-16) ; 13C-NMR(CD3OD) δ 165. 6 (s,C-l), 117. 7 (d, C-2)，140. 3 (d, C_3)，124. 5 (s, C_4)，141. 6 (s, C_5)，36. I (t, C_6)，33. 6 (d,C-7)，125. I (d, C-8)，135. 0(s, C_15)，12. 6(t, C-10)，113. 4(d，C_ll)，144. 6 (s, C-12)，55. 2 (s，C-13)，49. 3 (t，C-14)，22. 6 (q，C_16)。与文献报道石杉碱甲数据一致，因此鉴定化合物I的结构为石杉碱甲(huperzineA),见说明书附图I,纯度测定见附图6。实施例8 :对化合物2进行结构鉴定，结果溶于甲醇，[ag :-54. 2 (c0. 203，MeOH)，碘化铋钾显色呈红色，性状与化合物I极其相近，初步推测为生物碱。EI-MS显示分子量为256 ;结合核磁共振谱图推定分子式为CieffiO^Ot51H-NMR显示有2个芳香质子[δ 7. 86 (1Η，d，J = 9. 5，H-3)，6. 48 (1H，d，J = 9· 5，H_2) ]、I 个烯质子信号[δ 5· 55 (1Η，brd, Η_8)]和I个单峰甲基[δ I. 58 (3Η，s，Η-16) ]。13C-NMR和DEPT谱表明含有7个不饱和碳信号(其中 I 个为羰基碳)、4 个 CH2,2 个 CHU 个季碳和 I 个 CH30 1H-NMR(CD3OD) δ 7. 86 (1Η，d，J=9· 5，H-3)，6. 48 (1H, d，J = 9· 5，H_2)，5. 55 (1H, brd, H_8) ,2. 91 (1H, dd, J = 17. 8,5. 4，H-6), 2. 81 (1H, m, H_9)，2. 45 (1H, dd, J = 11. 7，0. 4，H_6)，2. 37 (1H, m, H_7)，2. 30 (1H, m,H-9)，I. 94 (1H, m, H-14)，I. 73 (1H, m, H-14)，I. 58 (3H, s’ H-16)，I. 61-1. 67 (3H, m, H-IO a，
11β , H-12), I. 34 (1H, m, H-IO β ), I. 28 (1H, m, H-Il a ) ; 13C-NMR(CD3OD) δ 166. l(s，C_l)，118. 3(s, C-4)，141. 9 (d, C_3)，119. 5(d, C-2)，145. 8 (s, C_5)，30. 7(t，C_6)，35. 4(d，C-7)，127. 4 (d, C-8)，47. 4 (t, C_9)，26. I (t, C-10)，26. 9 (t, C_ll)，40. 3 (d, C_12)，56. 6 (s, C-13)，42. 6(t，C-14)，133. 4(s,C-15) ,23. 4(q,C-16)。其物理形态、旋光、1H-NMR、13C-NMR 和 EI-MS与文献报道石杉碱乙数据一致，鉴定化合物2为石杉碱乙(huperzineB)，结构见说明书附图2，纯度测定见附图7。实施例9 :对化合物3进行结构鉴定，结果溶于氯仿，碘化铋钾显色呈红色。EI-MS表明分子量为261，结合1H-NMR和13C-NMR确定分子式为C16H23NO2。13C-NMR和DEPT谱显示该化合物有16个碳，包括9个CH2, 2个CH，I个CH3、2个双键季碳和2个羰基碳信号，由此推测该化合物为马尾杉碱类型。1H-NMR(CD3OD) δ 4. 05 (1Η, m, H-Ib), 3. 87 (1H，m, H_9b)，3. 16 (1H, m, H-9a)，2. 84 (1H, m, H-1 a)，2. 70-2. 76 (3H, m, H_7，10a, lib)，2. 63-2. 68 (2H,m, H-3b，11a)，2. 40-2. 46 (3H, m, H_2b，3a，14a) ,2. 33 (1H，m, H_6a)，2. 21 (1H, m, H_6b)，2. 17 (1H, m, H-2b)，2. 12 (1H, m, H-15)，I. 92 (1H, m, H-IOb)，I. 91 (H, m, H_8b)，I. 85 (1H, m,H-14a)，L76(lH，m，H-8a)，1.41(lH，m，H-2a)，1.07(3H，d，J = 7.0，H_16) ; 13C-NMR(CD3OD)δ 51. 4(t, C-l)，20. 6 (t, C-2)，22. 7 (t, C_3)，142. 0 (s, C-4)，207. 7 (s, C_5)，38. 8 (t, C_6)，41. 5 (d, C-7) ,41. 3 (t, C-8) ,51. 3 (t, C_9)，26. l(t, C—10)，29. 2 (t，C—ll)，172. 2 (s，C—12)，
173.7 (s, C-13)，41. I (t, C-14)，26. 9 (d, C_15)，27. 5 (q, C_16) ； IRv=CztT1 :3363, 2922，1687，1643，1624，1458，1417，1234，1092,818 ;EI_MS :m/z261，246，233，218，190，176，150 ；与文献报道马尾杉碱乙数据一致，确定该化合物结构为马尾杉碱乙(P hlegmariurineB·),结构见说明书附图3，纯度测定见附图8。实施例10 :对化合物4进行结构鉴定，结果溶于氯仿，碘化铋钾显色呈红色，EI-MS表明分子量为277，结合1H-NMR和13C-NMR确定分子式为C16H23N03。13C-NMR谱显示该化合物有16个碳，与马尾杉碱乙化学位移值非常相似。区别在于化合物5比马尾杉碱乙多一个含氧次甲基(δ79. 9)]，少一个亚甲基，应为马尾杉碱乙中的一个亚甲基被氧化。1H-NMR(CD3OD) δ 4. 09 (1Η, m, H-Ib) ,3. 98 (1H, m, H_9a)，3. 92 (1H, m, H_8)，3· 44 (1Η,m, H-3b)，3. 18 (1Η, d, J = 15Hz, H-14a)，3. 16 (1Η, m, H-1 a)，3. 02 (1H, m, H_7)，2. 85 (1H,m, H-9b)，2. 73 (1H, m, H_2b)，2. 72 (1H, m, H_3a)，2. 57 (H, m, H-I la)，2. 44 (1H, m, H-I lb)，2. 40 (2H, m, H_6b，10a)，2. 34 (1H, m, H-15)，I. 95 (1H, m, H_6a)，I. 87 (1H, m, H_2a)，I. 48 (1H,d, J = 15，H-14b), I. 40 (1H, m, H-IOb), I. 19 (1H, d, J = 7.0，H-16) ； 13C-NMR(CD3OD)δ 51. 4(t, C-l)，26. I (t, C-2)，31. 3 (t，C_3)，142. 7 (s, C-4)，206. 8 (s, C_5)，38. 4(t, C_6)，48. 6 (d, C-7) ,79. 9 (d, C-8) ,51. 4 (t, C_9)，19. 6 (t, C—10)，23. 0 (t，C—ll)，172. 2 (s, C—12)，
174.I (s，C-13) ,32. 2 (t, C—14)，31. 4 (d，C—15)，24. 4 (q，C_16) ； IRvf^cw'1 3395, 2971,2825，1689，1629，1603，1486，1424，1339，1232，1076,872 ;EI_MS m/z277,249,179，178，161，150，148，123，122，105。以上数据与文献报道8 β -羟基马尾杉碱乙一致，由此化合物4鉴定为8β-轻基马尾杉碱乙(8 β-hydroxyphlegmariurineB),结构见说明书附图4,纯度测定见附图9。实施例11 :对化合物5进行结构鉴定，结果不溶于氯仿、乙酸乙酯、丙酮，微溶于甲醇，易溶于水；碘化铋钾显色呈红色；EI-MS显示分子量为318，结合1H-NMR和13C-NMR确定分子式为C18H26N2Oy红外光谱表明含有羟基(3284cm-l)，酰胺(3361，1627，788cm_l)和羧基信号(3387，1698cm-l)。1H-NMR 显示有 I 个双峰甲基[δ I. 00 (3Η, d, J = 7. 4，Η-16)] 13C-NMR和DEPT谱表明含有4个不饱和碳信号(其中2个为羰基碳)、9个CH2、3个CH、1个季碳和 I 个 CH3。1H-NMR(CD3OD) δ 3. 85(lH，m，H_la)，3· 64(lH，m，H_9a)，3· 17 (1H, brd,H-9e)，3. 12(1H, brd, H-1e)，2. 63(1H, m, H_6a)，2. 59(1H, m, H_3e)，2. 56(1H, m, H_14e)，2. 21 (1H, m, H-3a)，2. 14 (1H, m, H_7)，I. 98 (1H，m, H_2a)，I. 88 (1H，m, H-IOe)，I. 84 (1H，m, H-II)，I. 76 (3H, m, H_2e，12，10a)，I. 73 (1H, m, H-15)，I. 70 (1H, m, H_8e)，I. 58 (2H, m,H-15)，L31(lH，m，H-8a)，1.24(lH，m，H-14a)，1.00(3H，d，J = 7.4，H_16) ; 13C-NMR(CD3OD)
δ 48. 3 (t, C-l)，18. 0 (t, C-2)，22. 2 (t, C_3)，121. 2 (s, C-4)，134. 5 (s, C_5)，33. 2 (t, C_6)，35. 3 (d, C-7) ,43. 7 (t, C-8) ,51. 3 (t, C_9)，24. 6(t，C-10)，26. 2 (t，C-ll)，44. 6 (d，C—12)，67. O (s，C-13)，41. 8 (t，C—14)，28.4 (d, C—15)，22.5 (q, C_16)，164.8 (s, C_17)，166.8 (s,C-18) ； IRv^cm'1 :3485, 3365，2954，1695，1624，1457，1361,777 ;EI_MSm/z :318,275,261，217，189，172。以上数据与文献报道石杉碱庚一致，由此鉴定化合物5为石杉碱庚(hu-perzineG),结构见说明书附图5,纯度测定 见附图10。
权利要求
1.利用超临界萃取-结晶技术提取分离千层塔及其毛状根中生物碱的方法，包括备料、微波辐射、萃取、结晶、重结晶、产品检测及包装，其特征在于所述的方法包括下列步骤 ①备料取阴干的、含量较高的千层塔植物或其毛状根粉碎成40 100目的干粉、I%盐酸或I %酒石酸、二氧化碳流体、乙醇、丙酮及四氯化碳，其中二氧化碳流量与干粉中生物碱含量的重量比为100 200 1，二氧化碳与乙醇的重量比为100 2 10 ; ②原料浸润、微波辐射取千层塔植物或其毛状根干粉，置带微波装置的萃取釜中，力口酸液浸润过夜，开启微波进行辐射，辐射频率为2300 2600MHz，功率为3000 6000W，辐射时间120 240S(以水温不超过60°C为限)； ③萃取在萃取釜内压力为15 45MPa、温度为34 60°C条件下，按上述重量比通入携带有夹带剂乙醇的超临界态的二氧化碳进行一级萃取，时间为40 80min,萃取液通入一级分离器，在压力为15 45MPa，温度为30 40°C条件下分离出膏状物溶液和废渣，将该膏状物溶液通入二级萃取釜，在压力为15 45MPa，温度为30 40°C条件下进行二级萃取，时间为lt，将二级萃取物通入二级分离器，在压力为5 15MPa、温度为30 50°C条件下，从二级分离器中分离出膏状物、乙醇及二氧化碳，该二氧化碳经冷凝压缩后再次携带夹带剂乙醇进入一级萃取釜进行下一轮萃取，完成一个循环所用时间为3 5h ; ④梯度结晶将二级分离器中的膏状物直接加入微粉硅胶，搅拌均匀，挤压过100目以上筛网，混合均匀。分别使用甲醇、乙醇、丙酮、氯仿为夹带剂，温度分别为32 38°C、42 48°C、52 58°C、62 68 ，压力分别为 11 13MPa、15 17MPa、19 21MPa、23 25MPaMPa，进行超临界梯度萃取结晶，分别得到五种生物碱； ⑤结构鉴定将分离出的各化合物进行结构鉴定，紫外分析仪用ZF-I型(上海顾村中实仪器厂)，红外光谱用Tensor 27型红外光谱仪(Btaker公司生产)，KB r压片；质谱用VarianMat 一 711质谱仪,核磁共振谱用Bmker DRX 一 500核磁共振仪,TMS为内标,化学位移(S )值的单位用ppm，偶合常数J的单位为Hz ； ⑥纯度测定将分离出的各个化合物用高效液相色谱法，采用面积归一化法测定各化合物的纯度，结果分离出的各化合物纯度均达到99%以上。
2.根据权利I所述的利用超临界萃取-结晶技术提取分离千层塔及其毛状根中生物碱的方法，其特征在于千层塔植物或其毛状根粉碎成40 100目的干粉，用1%盐酸或1%酒石酸水解。
3.根据权利I所述的利用超临界萃取-结晶技术提取分离千层塔及其毛状根中生物碱的方法，其特征在于利用微波进行辐射，辐射频率为2300 2600MHz，功率为3000 6000W，辐射时间120 240S(以水温不超过60°C为限)来达到细胞破壁，加快生物碱的溶出。
4.根据权利I所述的利用超临界萃取结晶技术提取分离千层塔及其毛状根中生物碱的方法，其特征在于萃取时用二氧化碳流体、乙醇，其中二氧化碳流量与干粉中生物碱含量的重量比为100 200 1，二氧化碳与乙醇的重量比为100 : 2 10。
5.根据权利I所述的利用超临界萃取-结晶技术提取分离千层塔及其毛状根中生物碱的方法，其特征在于在一级萃取时压力为15 45MPa、温度为34 60°C,时间为I小时，在二级萃取时压力为15 45MPa、温度为34 40°C，时间为40 80min。
6.根据权利I所述的利用超临界萃取-结晶技术提取分离千层塔及其毛状根中生物碱的方法，其特征在于将提取的膏状物直接加入微粉硅胶，搅拌均匀，挤压过100目以上筛网，混合均匀，以利于超临界梯度结晶时分离出纯度较高的化合物。
7.根据权利I所述的利用超临界萃取-结晶技术提取分离千层塔及其毛状根中生物碱的方法，其特征在于使用不同的夹带剂，在不同的压力、温度条件下，得到五种物质。
8.根据权利I所述的利用超临界萃取-结晶技术提取分离千层塔及其毛状根中生物碱的方法，其特征在于对从千层塔及其毛状根提取的石杉碱甲用高效液相色谱外标法、其它生物碱采用高效液相色谱面积归一化法测定，其纯度均在99%以上。
9.根据权利I所述的利用超临界萃取结晶技术提取分离千层塔及其毛状根中生物碱的方法，其特征在于经使用紫外分析、红外光谱、质谱、核磁共振谱等方法进行结构鉴定，确认分离得到的化合物为石杉碱甲、石杉碱乙、石杉碱庚、马尾杉碱乙、8R —烃基马尾杉碱乙(5)。
10.根据权利I所述的利用超临界萃取-结晶技术提取分离千层塔及其毛状根中生物碱的方法，其特征在于使用过的二氧化碳经冷凝压缩后再次携带夹带剂乙醇进入一级萃取釜进行下一轮萃取，节省二氧化碳使用量，减少排放，达到节能环保要求。
全文摘要
本发明公开了利用超临界萃取-结晶技术提取分离千层塔及其毛状根中石杉碱甲的方法，其特征在于通过备料、微波辐射、萃取、结晶、重结晶、产品检测及包装，由于采用微波辐射破壁技术，减少传统提取方法中酸的用量，减少酸的排放及环境污染；采用超临界萃取结晶技术，大幅提高收得率，加之选用价廉而用量又小的乙醇为溶剂，故而大幅降低生产成木，与传统工艺相比，生产成本下降40％。通过对提取物利用超临界梯度结晶技术，经结构鉴定及纯度测定，共分离出高纯度的生物碱5种。而且原料中石杉碱甲含量在0.0025％以上都具工业生产价值，实现资源利用最大化，利用超临界萃取排放的CO2废气经过冷凝压缩后再次携带夹带剂乙醇进入一级萃取釜进行下一轮萃取，节省二氧化碳使用量。
文档编号C07D487/08GK102786472SQ201110129850
公开日2012年11月21日 申请日期2011年5月19日 优先权日2011年5月19日
发明者于振艳, 刘同祥, 叶乾堂, 孙纲春, 张宗申, 李志成, 王祖红 申请人:河南省海乐森药用细胞工程技术有限公司