专利名称：一种溶菌酶蛋白的纯化方法
技术领域：
本发明属于蛋白纯化领域，具体而言，本发明涉及一种以甲壳素为亲和层 析介质的溶菌酶蛋白纯化方法。
背景技术：
溶菌酶的用途相当广泛。在国外，溶菌酶普遍的应用在食品的杀菌、保鲜、 防腐以及微生物发酵和生物工程技术中菌体内容物如核酸、蛋白质、抗生素、酶 等的提取。在医药和临床上，溶菌酶制成的各种药物具有抗菌抗病毒、消炎、消 肿、增强抗菌素疗效等作用。
目前，溶菌酶的开发已经显示了良好的临床应用前景，随着对溶菌酶的临床 应用研究的深入，丌发出具有重要临床价值的药物已指闩可待，那时人类将会掀 丌抗生素研究历史上的崭新篇章。而且溶菌酶作为一种天然蛋白质，能在胃肠内 作用营养物质被消化和吸收，对人体无毒性，也不会在体内残留，是一种安全性 很高的食品保鲜剂、营养保健品。在环境污染日趋严重的当今世界，无公害食品 生产渐成一种时尚和需求，溶菌酶无疑符合了这一趋向，它在食品工业上的广泛 应用，无疑会提高人们的生活质量。因此，溶菌酶集药理、保健和防腐等多种功 能于一体。在倡导绿色食品的今天，可以想象溶菌酶的应用甜景是相当广阔的。
在国内，溶菌酶尚未得到充分应用，主要是由于国内生产溶菌酶的产量低、 质量差，医药、食品及科研用溶菌酶仍依赖进口。随着食品工业、微生物工业和 生物工程技术的迅速发展，以及溶菌酶在医药领域上的推广应用，人们对溶菌酶 的需求量与闩俱增，同时，对溶菌酶质量的要求也越来越高，因此，许多研究者 都在寻找新的溶菌酶分离纯化技术，以提高溶菌酶产品的纯度及活性。
Mayer等于1936年发表了溶菌酶分离与纯化的报道。翌年，Abraham等以相 似的方法获得了溶菌酶结晶状标准品，但其质量和收率仍不理想[船津胜，鹤大 典编著.溶菌酶.山东科学技术出版社，1982]。 Alderton等于1945年改用膨 土岩吸附，再用吡啶洗脱，从鸡蛋清中纯化溶菌酶，收率较高。而后，其又采用
直接结晶法将含有5%氯化钠的鸡蛋清调至鸡溶菌酶的等电点，然后加入溶菌 酶晶种，获得溶菌酶结品品。80年代以来，研究者对直接结晶法进行了一系列 改进，使其产率达到60 80%。这种方法由于产率高，普遍应用于鸡溶菌酶的工 业生产。但是，结晶的条件很难获得，因此其他来源的溶菌酶的生产难以采用结 晶法；此外，结晶法成本较高，生产工艺复杂，并且结晶法不能解决生物大分子 的共晶问题，在实际中除鸡溶菌酶的生产外，其他溶菌酶的生产一般不采用结晶 法。
离子交换色谱法是利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进 行物质分离的操作技术，由于具有简便、高效、成本低，且可自动化连续操作的 优点，因此一直以来都是溶菌酶生产所常用的方法。常用的离子交换介质有 Duolite 464、羧酸纤维素(PC)、羧甲基纤维素(CMC)和羧甲基琼脂糖等。Li Chang等用Duolite 464从性质均一的蛋清溶液中分离溶菌酶，建立的一种简 便而有效的工艺过程，可使溶菌酶的回收率高达90 95%。同时采用Duolite 464分离纯化溶菌酶适合于连续自动化操作。Durance等也采用Duolite 464从 未被稀释的蛋清溶液中同时分离溶菌酶和抗生素蛋白[Durance TD， Nakai S. Simultaneous isolation of avidin and lysozyme from egg albumen. J Food Sci， 1988, 53(4): 1096 1102]。但是，离子交换色谱法亦存在一些不足一 般的离子交换介质刚性小、收縮性大、再生手续麻烦，且易被柱堵塞；对于含有 复杂蛋白质组成的样品混合液，分离条件严格，需要多步纯化，且产品纯度有限。 到目甜为止，尚未有报道将甲壳素作为亲和层析介质，用于分离溶菌酶。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作简易、成本低廉并且高效的溶菌酶蛋白纯化方法。
本发明提供了一种溶菌酶蛋白纯化方法，即将含有溶菌酶蛋白的溶液进行 亲和层析，亲和层析介质为碱化的甲壳素，即可得到高纯度的溶菌酶蛋白。
甲壳素即2-N-乙酰氨基-2-脱氧-0-1,4-葡萄糖，是由2-N-乙酰氨基-D-葡 萄糖通过e -1， 4糖苷键聚合而成的直链含氮多糖，是与纤维素结构极为相似的天 然高分子。本发明所用的甲壳素可以以目前各类市售产品为原料，例如，Sigma 公司的C7170，和济南海得贝海洋生物工程有限公司，青岛海普生物技术有限公 司，潍坊科海甲壳素有限公司等单位的产品。
本发明中，将甲壳素在10-3(TC条件下碱化3分钟-24小时后，静置并洗至中 性，从而制成层析介质。所用碱为氢氧化钠或者氢氧化钾等，甲壳素与碱中OH— 的质量摩尔比为质量摩尔比为8-200:1 ，单位为g/M。也可以将甲壳素碱化静置后， 经过过滤再洗涤至中性备用。过滤的方法可以是脱脂纱布过滤，等等。或者， 在甲壳素碱化后，用酸处理再静置洗涤至中性备用。所用酸为可以是醋酸、柠檬 酸等弱酸中的一种或者几种。酸处理时，加入甲壳质与酸中H+的质量摩尔比为 25-200:1。
处理后，介质颗粒能够迅速沉淀，无絮状漂浮物，再已低浓度的醋酸洗脱 空柱时，洗脱液280nm吸光值应较小。
本发明中，介质溶胀(即介质得率)计算方法为将一定质量介质经碱化， 过滤、洗净处理或经碱化，过滤、洗净，冰冻处理后，浸于蒸馏水，置量筒中自 然沉降12h，读取介质湿体积V，介质溶胀比率=V/介质质量。
本发明中，介质收缩比率计算方法为将一定体积经充分溶胀的介质装柱，
用pH6. 40的0. 02MPBS平衡柱床后，计算柱体积V,,,换用0. 1M醋酸溶液平衡柱 床，计算柱体积Vb，介质收縮比率=i-vb/ Va。
本发明中，介质相对流速比率测定方法为在0.05MPa压力下，测定单位时 间空床中0. 1M醋酸溶液流速Vu。将相同体积各组介质装柱，使用0. 1M醋酸溶 液平衡柱床，在O. 05MPa压力下，测定单位时间各介质流速vP。介质相对流速
比率二Vp/Vu。
本发明中，介质吸附容量比较方法为采用静态吸附法量取lml充分溶胀 各组介质，加入3ml蒸馏水及lml的浓度为lOmg/ml的鸡溶菌酶(c-LYZ)，混匀， 待稍沉降，取0. 5ml上清液，5000rpm离心10min，取0. 4ml上清液，用蒸馏水 稀释至2ml，测280nm吸光度，记为A1;另将原液室温，静置6h后，5000rpm离 心10min，计算上清液体积V，取0. 5ml上清液，5000rpm离心10min，取0. 4ml 上清液，用蒸馏水稀释至2ml，静置6h，观纟280nm吸光度，记为A2， AA= A,-A2，
介质的吸附容量Q「— 二 AA XVX介质溶胀比率。
本发明中，甲壳素亲和介质吸水量计算方法为取真空低温冻干的甲壳素亲 和介质O. 05g，加入O. 5ml双蒸水，室温溶胀6h后，3000rpm离心30min，计算 上清液体积，并计算单位质量甲壳素亲和介质吸水量。
本发明中，介质得率计算方法将一定质量介质经碱化，过滤、洗净处理后， 浸于蒸馏水，置量筒中自然沉降12h，读取介质湿体积V,，介质溶胀比率=V,/ 介质质量；将上述介质经O. 1M醋酸处理后，过滤、洗净，浸于蒸馏水，置量筒 中自然沉降12h，读取介质湿体积V"介质得率=V2/介质质量。
本发明中，介质的损耗比率=1-介质得率/介质溶胀比率。
本发明中，介质的吸附容量Q^y, A,XVX介质溶胀比率。
本发明的溶菌酶蛋白纯化方法中，亲和层析过程中洗脱液pH值为2. 5-5. 2。 本发明中，亲和层析过程中洗脱液主要采用酸性试剂，例如乙酸等，浓度 为0.02M-1M。
本发明中，亲和层析过程中温度为4-3(TC。
本发明中，上述纯化方法还包括透析，即在亲和层析后进行透析操作。 本发明中，所述的过滤方法可以包括超滤，即亲和层析后再经过超滤操作。 本发明中，洗脱前可以进行预洗脱。
本发明中，预洗脱时，缓冲液浓度可以为磷酸钾或者磷酸钠，浓度可以为 0, 02M-3M。
用本发明的方法从含有溶菌酶的溶液中提纯溶菌酶蛋白，可以得到纯度70% 以上，甚至100%的蛋白，例如，用于提纯人的3型类溶菌酶(NCBI accession ID:AF099029)，纯化人G型溶菌酶(NCBI登陆号AF323919)等。
本发明的纯化方法简便易行，成本低廉；甲壳素亲和介质吸附性专一，流 速较快；釆用甲壳素亲和介质纯化溶菌酶，步骤简单高效，经过一次纯化，即可 从发酵液中分离到近100%的纯度的溶菌酶，纯化效率明显高于目前通行的溶菌 酶纯化式艺。因此，本研究的甲壳素亲和介质制备工艺可适用于大规模的溶菌酶
工业生产。
图1是pH对rh-LYZ洗脱的影响。其中，一令一0Dw是以pH6. 11 0. 02MPBS 为洗脱液；—■— OD脇是以pH2. 85 0. 2MHac为洗脱液。
图2是盐浓度对rh-LYZ洗脱的影响图。其中， 一令一OD，m是以pH6. 51 0. 02MPBS with 0. 5MNaCl为洗脱液，—■— OD脇是以pH2. 85 0. 2MHac为洗脱液。
图3是缓冲液浓度对rh-LYZ洗脱的影响图。其中，一令一OD^是以pH5. 42 0. 2图ac-NaAc为洗脱液，—0D28。 是以pH2. 85 0. 2MHac为洗脱液。可见， 使用BandScan V4. 30软件分析发酵液中rh-LYZ占82. 1%,纯化后rh-LYZ纯度 为100%。
图4是rh-LYC3粗产品SDS-PAGE结果图。其中，M是蛋白标记；11道是 rh-LYC3; 12道是rh-LYZ。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明进 -歩说明。 实施例中涉及的主要试剂有
30%丙烯酰胺凝胶贮存液取丙烯酰胺29g，亚甲双丙烯酰胺lg,溶于60ml 双蒸水，定容至100ml， pH小于7.0，置棕色瓶4'C保存。
10%过硫酸铵取lg过硫酸铵溶于10ml双蒸水，4匸保存。
1. 5MTris-HCl缓冲液(pH8. 8):取Tris碱18. 16g，充分溶于50ml双蒸水， 用浓盐酸调节pH至8.0，定容至100ml。
1M Tris-HC1缓冲液(pH6. 8):取Tris碱12. llg，充分溶于80ml双蒸水， 用浓盐酸调节pH至6.8，定容至100ml。
蛋白电泳上样缓冲液取0. 5mol/L Tris Cl (pH6. 8) 5ml， SDS lg， 巯基乙醇O. 6ml， 50。/。甘油8ral， 0.05。/。溴酚蓝lml，双蒸水4. 4ml混合。
电泳缓冲液取Tris3. 03g，甘氨酸14. 41g，双蒸水定容至lml,加SDS lg， 搅拌溶解。
实施例中涉及的主要仪器有 蛋白凝胶电泳系统 凝胶成像分析系统 752紫外可见光分光光度计 Agilent series 1100型HPLC PHSJ-4A型pH计 恒温摇床 磁力搅拌器 净化工作台 透析袋
美国Bio-Rad公司 美国UVP公司 上海精密科学仪器有限公司 分析仪美国Hewlett-Packard公司 上海精密科学仪器有限公司 上海市离心机械研究所 上海精密科学仪器有限公司 苏州安泰空气技术有限公司 华美生物工程公司
实施例1 甲壳素亲和层析介质的制备方法
将一定目数甲壳素(通常为60目)用2MNa0H溶液，以l: 10浴比，在搅 拌下室温碱化12h—二层脱脂棉纱布过滤，用50倍体积蒸馏水洗涤3次，复浸 于一定体积蒸馏水中—加入等体积0. 2M乙酸溶液，室温磁力搅拌5min—二层脱 脂棉纱布过滤，用蒸熘水洗至中性，复浸于一定体积蒸熘水中，加入无水乙醇至 20%浓度，4'C保存，备用。
实施例2人G型溶菌酶(NCBI登陆号AF323919)的纯化
取甲壳素介质15ml，加入发酵液上清，室温磁力搅拌吸附0. 5h,沉淀lOmin 后，倾去上清液，将介质装1 cm X 20cm色谱柱，用pH6. 4的0. 02MPBS洗柱床， 洗脱液OD脇值降至0. 010以下后，换用pH3. 27的0. 05M醋酸溶液解离，收集洗 脱液，洗脱液0D2^降至0.010以下后停止收集。换用pH5. 42的0. 2M醋酸钠缓 冲液解离，收集洗脱液，待洗脱液0028。
降至0. 010以下后停止收集；再用pH3. 27 的0. 05M醋酸溶液解离，以1. 5ml为单位收集洗脱液，洗脱液OD2s(^降至0. 010 以下后停止收集。
一歩洗脱法纯化的c-LYZ粗产品SDS-PAGE,使用BandScan V4. 30软件分析。 结晶中蛋白含量(按分子量大小)分别为24. 5%， 28.1%， 47.4%，上清中溶菌酶 纯度为100%。
权利要求
1.一种溶菌酶蛋白的纯化方法，其特征在于，将含有溶菌酶蛋白的溶液进行亲和层析，亲和层析介质为碱化的甲壳素，即可得到溶菌酶蛋白。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，亲和层析过程中洗脱液pH 值为2. 5-5. 2。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，亲和层析过程中洗脱液为乙 酸，浓度为0. 02M-1M。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，亲和层析过程中温度为4-30。C。
5. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述的纯化方法还包括透析， 即在亲和层析后进行透析操作。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的纯化方法还包括超滤， 即亲和层析后再经过超滤操作。
7. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，洗脱前进行预洗脱。
8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，预洗脱时，缓冲液浓度为磷 酸钾或者磷酸钠，浓度为0.02M-3M。
全文摘要
本发明属于蛋白纯化领域，具体而言，本发明涉及一种以甲壳素为亲和层析介质的溶菌酶蛋白纯化方法。溶菌酶的用途相当广泛。许多研究者都在寻找新的溶菌酶分离纯化技术，以提高溶菌酶产品的纯度及活性。本发明的纯化方法简便易行，成本低廉；甲壳素亲和介质吸附性专一，流速较快；采用甲壳素亲和介质纯化人溶菌酶，步骤简单高效，经过一次纯化，即可从发酵液中分离到近100％的纯度的溶菌酶，纯化效率明显高于目前通行的溶菌酶纯化式艺。因此，本研究的甲壳素亲和介质制备工艺可适用于大规模的溶菌酶工业生产。
文档编号C12N9/36GK101353650SQ200710044260
公开日2009年1月28日 申请日期2007年7月26日 优先权日2007年7月26日
发明者龙 余, 唐丽莎, 李宗林, 鹏 黄 申请人:复旦大学