专利名称：一种重组腺病毒在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物学领域，具体地说是涉及一种携带人wwox基因的重组腺病毒在制备抗肿瘤药物中的应用，特别是用于制备化疗药 增敏剂。
背景技术：
肺癌是死亡率极高的恶性肿瘤，高发病率、低手术治愈可能性和化疗疗效反应差是最主要的原因。肺癌中80%的患者为非小细胞肺癌， 大约40%的非小细胞肺癌被确诊时已经晚期，全身化疗成为主要的治 疗方法。但是我们不得不面对这样的事实，那就是绝大多数非小细胞 肺癌(NSCLC)在体内和体外都被证实对化疗不敏感。肿瘤化学治疗最大障碍之一是肿瘤细胞对药物的耐受性。有些肿 瘤，如大肠癌细胞对药物存在固有的抗药性(Intrinsicresistance;consti tutiveresistance)亦称原发性耐药，在治疗开始时就表现出对药物的高 度耐受；另一些肿瘤，如乳腺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤等，化疗开始时 有效，久用则产生抗药，出现获得性抗药性(Acquiredresis Tance)亦称 继发性耐药。原发性耐药和继发性耐药区别是:原发性耐药是未接触 药物就已存在的，继发性耐药是接触药物后才产生的。多药耐药性 (multidrugresistance，MDR)是肿瘤细胞长期接触某一化疗药物，不仅对 此种化疗药物产生耐药,而且对其它结构和功能不同的多种药物产生 交叉耐药性。肿瘤的多药耐药特性，其产生机制可归纳为四种类型 一般包括 一，细胞内有效药物浓度不足(一)药物摄入不足；(二)药物泵 出被细胞摄入的化疗药物在起效前，若被重新泵出，则使得药效无 法发挥，这是导致胞内有效药物浓度不足的另一原因。①经典多药耐 药(MDR, multidrug resistance);②非P-糖蛋白型多药耐药(也称
MRP, multidrug resistance protein );③乳腺癌耐药蛋白(BRCP， breast cancer resistance); ④月市耐药相关蛋白(LRP， lung resistance-protein)。 (三)细胞内药物被"封闭"从而不能到达作用靶点，引起药物相对 不足。二、通过干扰药物作用机制、降低药物活性产生耐药。三、通 过DNA修复途径产生耐药肿瘤细胞自身的DNA修复功能可与化疗药 物的DNA毒性发生拮抗，导致耐药。四、可以通过细胞凋亡相关改变 产生耐药凋亡相关因子的异常可引起肿瘤细胞对化疗药物(如紫杉 醇)的促凋亡作用不敏感。目前了解较清楚的凋亡相关因子包括p53、 Bcl-2、 NF-kB、 Rb等。研究已证实突变型p53加强肿瘤对化疗的耐 受性，检测p53的表达水平有助于对化疗效果的评估。针对上述的临床耐药问题，有必要找出合适的方法克服化疗的耐 药性。多药耐药的克服途径逆转MD R的药物称为多药耐药修饰剂 (RM,resistancemodifer)或M D R逆转剂。如l丐通道阻滞剂异博定 Ver(Vpl)、Psc833、托瑞米芬、三氟拉嗪、丁硫氨酸亚砜胺(B S O)等。理想的MD R逆转剂最好具备:①对正常组织毒性小，安全性大； ②在体内能达到体外有效药物浓度；③本身具有一定的抗肿瘤作用； ④稳定性好，体内半衰期长；⑤代谢产物亦能有效。目前所发现的M D R逆转剂远没达到上述要求，并且目前所用RM大多毒性较大，在 体内难达到体外有效浓度，因而临床效果不理想。近年来随着对肿瘤发病分子机制及细胞生长调控机理研究的深 入，肿瘤的基因治疗研究取得了巨大的进展。研究人员根据肿瘤的类 型和分布，采用了多种技术来逆转肿瘤耐药，现在有许多己经应用到 了临床试验。如"今又生"(Gendicine，重组腺病毒-p53基因注 射液)已经在临床上使用，其主要通过以下机理特异性杀伤肿瘤细胞: 1)启动肿瘤细胞凋亡信号通路；2)抑制肿瘤细胞生存信号传递；3) 抑制肿瘤组织血管生成及肿瘤细胞物质及能量代谢；4)抑制肿瘤细 胞浸润转移；5)逆转肿瘤细胞放/化疗抗性；6)阻滞肿瘤细胞周期 的运转，使肿瘤细胞处于严重冬眠状态；7)启动"旁杀伤效应"，调 节机体免疫反应，杀伤肿瘤细胞。因此p53己经作为化疗药物抗性的 逆转剂。
临床逆转试验的根本性突破有待于多药耐药机理的进一步明确， 随着高效低毒逆转剂的不断发现并逐步用于临床，基因治疗的探索， 传统的细胞毒药物治疗向分子靶向药物治疗过渡，应用循证医学指导 临床实践，最终解决恶性肿瘤的耐药问题有待时日，并且有理由相信 基因治疗对抗癌药物的耐受性将在不久的将来逐渐占重要地位。目前研究表明，WWOX基因(genebank号NMJ)16373;网址 http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi db=nucleotide&val=770 6522)是跨越了整个常见染色体脆性部位FRA16D的一个新的抑癌基 因。WWOX蛋白含有414个氨基酸，在它的氨基末端有两个丽结构域， 丽结构域主要与蛋白之间相互作用有关，其中WWOX的鼎l区域特异 性结合细胞内含有PPXY配体的蛋白；蛋白之间的这种相互作用是机体 抑癌基因通过信号转导途径抑制肿瘤生长所必需。在WWOX蛋白的 中心部位有一短链氧化还原酶功能域(SRD)，结合WWOX基因在激素 调节组织如前列腺、卵巢癌高表达，WWOX基因被推测为一参与性 激素调节的酶，在前列腺癌、卵巢癌中WWOX基因的频发异常更加 支持上述推测。WWOX和甾体激素、乳腺癌致癌作用有重要的作用 和复杂的关联。有研究报道，通过重组腺病毒(Ad-WW0X)和药物诱 导系统(松甾酮A、 ponA)，在肺癌细胞株中恢复WWOX的表达，内 源性鼎0X蛋白阴性的细胞株(A549， H460, and H1299)通过激活内源 性凋亡caspase级联反应，诱导细胞凋亡。经过重组腺病毒(Ad-WW0X) 和药物(松甾酮A、 ponA)诱导系统两种方法，异位表达WWOX导致 A549、 H460和H1299细胞株在裸鼠致肿瘤性受到显著抑制。实验证实 WWOX是一种抑癌基因，并且高效率抑制肺癌异种移植物的生长。发明内容本发明的目的在于提供一种重组腺病毒在制备抗肿瘤药物中的 应用，特别是在制备化疗药增敏剂(Chemosensitizer)中的应用。本发明所要解决的技术问题是构建携带人WWOX基因的重组腺 病毒(Ad-WWOX)，并进行WWOX逆转A549/紫杉醇耐药细胞 (A549/T)对化疗药物(紫杉醇和顺铂)耐药的研究。本发明提供一种携带人wwox基因的重组腺病毒在制备抗肿瘤 上述应用是指用于制备化疗药增敏剂，特别是肺癌化疗药增敏剂。所述的化疗药增敏剂也称为多药耐药修饰剂或MD R逆转剂。本发明的技术方案1. 构建携带人WWOX基因的重组腺病毒通过细胞内质粒同源重组人全长wwox基因整合到腺病毒载体上，获得重组腺病毒， 并制备和纯化一定量的病毒颗粒；具体步骤首先构建pDC316-IRES-EGFP质粒；其次构建携带人 WWOX基因的穿梭质粒，命名为pDC316-WWOX-IRES-EGFP(如图2所示)。 将pDC316-丽0X-IRES-EGFP与携带腺病毒基因组的骨架质粒 pBHGloxAEl， 3Cre共转染293细胞，两者在细胞内发生同源重组， 形成携带人全长WWOX的重组腺病毒，命名为Ad-丽OX (如图3所示)。2. 建立耐药模型A549紫杉醇耐药株和基因转移方法，观察腺 病毒在A549/T细胞的表达；3. 通过体外药敏实验(CCK-8法)，证明WWOX能显著逆转紫 杉醇和顺铂的耐药性，尤其是对紫杉醇的耐药性。本发明可逆转肺癌细胞耐药，为最终解决恶性肿瘤的耐药问题提 供新的方法。本发明将使肿瘤对抗癌药物的耐受性在不久的将来被逐 渐克服。
图1是AdMax腺病毒包装试剂盒中穿梭质粒^pDC316质粒的图 谱图2是pDC316- WWOX-IRES-EGFP的图谱 图3是Ad-WWOX的结构示意4是感染Ad-WWOX-IRES-EGFP的A549/T细胞形态 其中A是感染Ad-WWOX-IRES-EGFP前A549/T细胞形态 相差倒置显微镜X100 B是感染Ad-WWOX-IRES-EGFP 48小时A549/T细胞形态相差倒置显微镜X100 C是感染Ad-WWOX-IRES-EGFP 48小时A549/T细胞形态
荧光显微镜xioo图5是westblot检测腺病毒感染A549/T后WWOX的表达
其中1泳道是感染Ad-IRES-EGFP的A549细胞 2泳道是感染Ad-IRES-EGFP的A549/T细胞 3泳道是感染Ad-WWOX-IRES-EGFP的A549/T细胞 4泳道是阳性对照MCF-7细胞
图6是A549/T感染含目的基因腺病毒组和对照组的TAX生存曲线图7是A549/T感染含目的基因腺病毒组和对照组的DDP生存曲线
具体实施例方式
现结合附图和实施例，对本发明作进一步描述，但本发明的实施 并不仅限于此。
实施例l:重组腺病毒(Ad-WWOX)的构建和制备
(一)重组腺病毒的构建复制缺陷性腺病毒AdMax腺病毒包装系统(加拿大MicrobixBiosystems公司产品，穿梭质粒-pDC316质粒的图谱如图l所示，骨架质粒——pBHGlox_El， 3Cre。)
293细胞为加拿大MICROBIX BIOSYSTEMS公司产品。 1. pDC316-IRES-EGFP质粒构建 1. 1从质粒pIRES-EGFP上扩增序列IRES-EGFP设计引物(引物设计软件oligo6.0)，从质粒pIRES-EGFP(购 自clontech公司)上扩增序列IRES-EGFP ， 构建质粒 pDC316-IRES-EGFP。引物序列为
IRES up 5'-GCCAGTCGACACCGCATCGAGCTGA-3' IRES down 5'-CTGCCAAGTTGCTCGAAGTCGACT-3'利用引物IRES叩和IRES down从pIRES-EGFP质粒上扩增片断 IRES-EGFPPCR体系为名称 ul IRES up 2 IRES down 2 dNTP 0.510Xprobest buffer 5 Probest 0.5H20 39 Template 1 Total 50 95度5min， 94度30sec， 60度30sec， 72度lmin30sec， 25cycles; 72度7min。1%琼脂糖电泳，用PCR产物胶纯化柱纯化PCR产物。从 pIRES-EGFP扩增IRES-EGFP基因，条带大小为723bp。1. 2载体和PCR产物均用酶Sal I酶切，用Sal I单酶切载体pDC316 的电泳条带大小为3913bp;回收载体和PCR产物。1.3连接 体系名称 体积(ul)Vector (Sal I) 4IRES-EGFP (Sal I) 4Ligase 0.510 X buffer 1.5H20 5Total 15 16度过夜连接，转化，挑菌。 1.4筛选构建好的载体用Hind lll单酶切鉴定，正确的载体能够切 出大小为243bp的条带，该质粒的图谱见图2。 1.5经英骏(Invitrogen)生物科技有限公司测序证实构建成功。2. 构建pDC316- WW0X-IRES-EGFP2. 1以pINCY-WWOX质粒(美国open biosystens公司，CATALOG IHS1380-97652595)为模板，根据而0X的CDS序列合成上、下游引物
引物序列如下WW0X-EcoR I-UP: 5'-GGAATTCATGGCAGCGCTGCGCTACGCGGGGCTGGAC-3' WWOX-BamH I-DW: 5'-GGGATCCTTAGCCGGACTGGCTGCCAAGCCGTTC-3' PCR反应参数如下94度30秒 58度30秒 72C 1分钟 30个循环，最后72度延伸5分钟 结果从plNVY-WWOX质粒上扩增WWOX基因，条带大小为1259bp2.2酶切体系2. 2. 1 PCR产物用DNA胶回收试剂盒纯化后，用EcoRI/BamHI双酶切 酶切反应体系如下■ 5ul (0.4 ug/ul)H Buffer(Roch) 3 ulEcoRI 1 ul (20u/ul)BamHI 1 ul (20u/ul)DD Water 20 ul37。C 3h酶切产物电泳后用胶回收试剂盒纯化 2.2.2载体酶切体系同上，将BamHI换成BglII并将DNA量减半 2. 3连接与转化按《分子克隆》操作手册常规方法进行2.3. l连接反应体系DNA (质粒DNA+PCR酶切产物) 5ulLigation buffer (10x) lulddH20 3ulligase lulTotal 10ul 160C overnight 2. 3. 2构建好的载体用EcoR I和Hind III双酶切鉴定，正确的质粒 应该切出大小为1.3k的条带；用PCR鉴定阳性克隆；送交测序证实 与，测序由英骏(Invitrogen)生物科技有限公司完成。3. Ad5-WW0XLIRES-EGFP重组腺病毒毒种制备3. 1293细胞的培养和传代将冻存的一管293细胞在37'C水浴轻轻晃动融化，融化后在超 净台无菌条件下用70%乙醇将冻存管的盖沿檫拭干净，加入 10mll0。/。DMEM重悬，600Xg离心5分钟，弃上清后用10mllO。/。DMEM重 悬，轻轻打匀，转入75cm2培养瓶中培养，在5。/。C02孵箱中37。C培养， 将生长至90%左右的细胞用PBS洗三次，室温下胰酶消化30-120秒 使细胞脱落，倒置显微镜下观察细胞是否变圆、脱落，加入少许培养 基中止消化，吹打细胞，收集细胞，离心，稀释细胞悬液，1: 3-5 转入新的培养瓶中。3.2双质粒共转染293细胞，同源重组产生重组腺病毒腺病毒包装系统AdMax (骨架质粒pBHGlox_El， 3Cre，穿梭质粒pDC316-WW0X-IRES-EGFP) 荧光观察有(V )、无()，其它出毒时间转染后第8天 收毒时间转染后第ll天毒种名称Ad5-WW0X-IRES-EGFP (图3) 具体流程如下3. 2. 1转染前一天，将293细胞接种于六孔板中，每孔5 X 105个细胞， 培养DMEM+1096胎牛血清，置37°(:含5% C02的培养箱中培养过夜。 3. 2. 2转染当天换液，用新鲜的含10%胎牛血清的DMEM培养基继续培 养。待细胞生长至底面积的80-90%时，取骨架质粒和穿梭质粒，用 Lipofectamine2000脂质体(invitrogen公司产品)按其所附说明书 进行转染。具体步骤为1) 每个转染孔取骨架质粒4ug，穿梭质粒lPg，混和均匀。2) 质粒用300ul的DMEM培养液进行稀释，室温放置5min。 3) 取10 y 1的脂质体用300 ul的DMEM培养液进行稀释，室温 放置5min。4) 将两者混和，室温避光放置30min。然后将混合物加入到细 胞中。3.2.3转染后第二天，将长满的细胞传代于25cm2细胞培养瓶中，用 含5。/。胎牛血清的DMEM培养基继续培养，每天观察，待细胞长满瓶底 时，再传入75cm2细胞培养瓶中，每天观察细胞出毒迹象。出毒现象 为细胞变大变圆，呈葡萄状，并开始出现明显噬斑。待细胞大部分病 变并从底部脱落进行收毒。3.2.4收毒将出毒的细胞培养瓶先后置于-7(TC冰箱和37。C水浴锅 中反复冻融三次，使病毒从病变细胞中充分释放。将冻融液3000rpm 离心5min，收集含病毒的上清液，弃沉淀。该上清即为第一代毒种(Pl)，作为随后大量病毒扩增的毒种。 3. 3毒种鉴定3.3.1引物上游WW0X-UP 、下游WWOX-DO丽(同实施例1 (一) 中2. 1中的引物)3.3.2扩增片段大小1200bp左右 3.3.3具体流程如下1) 模板准备在25cm2细胞瓶中培养293细胞，待细胞生长至90%满时，取上 述第一代毒种500u 1接种于细胞上，待细胞完全病变时按前述方法 冻融细胞三次，离心收集病毒上清液，此即为第二代毒种(P2)。目的基因的PCR鉴定取50ixlP2毒种上清液，力口入2ul蛋白 酶K， 56。C温育，煮沸10分钟，冰浴冷却，取1 u 1作为模板，用PCR水稀释。2) PCR体系模板 lul■X-叩 0. 5ul丽OX-down 0.5ul10XPCRBuffer 2.5ul(2. 5uM)dNTP 2ul Taq 0.25ulddH20 18.25ul25ul3) PCR条件94°C 5min ， 94°C 30s ， 56°C 30s , 72°Clmin ， 72°C 5min ， 4°C-30Cycles。3.4毒种滴度测定重组腺病毒TCID50测定(Reed和Muench两氏法，参考文献Reed U, Muench H. A simple method for estimating fifty percent end points. Am J Hyg 1938:27:493-497)。 (二)病毒扩增与纯化1) 毒种生产与粗纯化在l个75cm2方瓶中接种4X 106 2 93细胞，培养过夜，待细胞生长 至9(Fo满时，取2ml P2代毒种接种培养瓶内，24小时，显微镜下观察 发现有60°/。细胞病变，44小时后细胞完全病变。收获病变细胞混悬液 后，冻融三次，离心，取上清，按同样方法接种于另外4个75 cri^方 瓶中，44小时完全出毒，收获病毒，用于接种转瓶。在每个转瓶中接 种1.8X108个293细胞，共接种4个转瓶，等细胞生长至90%融合时， 按10ml/转瓶(M0I约为1)接种第2步收获的病毒上清，染毒后70小时 收获病变细胞混悬液。混悬液3000rpm离心，弃上清，细胞沉淀用腺 病毒保存液重悬浮，反复冻融三次，6000rpm离心，取上清，即为粗 纯化的重组腺病毒Ad5-丽0X病毒液，分装保存于-70。C冰箱中(短期 内使用可保存于4'C)。2) 病毒的纯化反复扩增腺病毒至需要病毒量，氯化铯密度梯度离心纯化病毒， 预冷离心机转头至4'C， 50ml离心管12000g，十分钟，取上清，弃沉淀， 每lml上清加入lml20%PEG8000/2. 5M NaCL，混匀，冰浴1小时，4 。C,12500g，30分钟，弃上清，沉淀充分重悬于5mlCsCL l.lg/ml，4 t:，8000g，5分钟，取上清，在超速离心管中缓慢加入2ml CsCL 1.4 g/ml，非常小心轻轻顺管壁加入另一层3ml CsCL 1.3 g/ml，沿管壁小 心加满病毒颗粒，约5ml上清l. lg/ml，平衡离心管，4°C， 60， 000g离心2
小时,取出离心管，固定于离心管架上，用5ml注射器，18G针头，在病毒 层的最低点刺破管壁，在CsCLl. 3g/ml和CsCL1. 4g/ml交界处吸出病毒 颗粒层，病毒层溶液转移到一个无菌的容器，4'C，透析过夜，换液三次， 病毒置于-8(TC保存。(三)实验模型与基因转移1) 构建A549紫杉醇耐药细胞株(短时间作用法)对数生长期(生长密度达60-70%)的A549细胞(购自中国科学院 上海生命科学院细胞资源中心)与泰素(紫杉醇、TAXOL，美国百时美 施宝公司产品)作用lh，细胞经不含药物的培养液洗涤后置入不含药 的培养基中培养至对数期(生长密度达80%)传代，加大剂量重复上 诉诱导过程。TAX0L10—100ng/ml，从低浓度开始，每次上升幅度为 10ng/ml，中毒征象(细胞增殖减慢、细胞浆颗粒明显增多)时停用 药物刺激，常规培养(1: 2传代，增加胎牛血清浓度至12-15%)，中 毒征象好转(细胞颗粒减少、增殖正常)后继续加药刺激。历时6月， 获得在100ng/ml TAXOL中生长状态良好的A549/T细胞株。2) 基因转移A549/T细胞撤TAX0L—周后按2-4X 107孔接种于六孔板中，每孔 补充DMEM培养液至2.5ml，细胞贴壁生长24小时后，细胞密度达 85-90%，吸净每孔培养基。选择两孔为T+组(即A549/T+)，加 Ad-WWOX-IRES-EGFP+1640完全培养基(含胎牛血清及双抗)IOOOUL， 十字形晃动培养板三次，放入孵箱5小时后，补足1640完全培养基至 每孔两毫升，继续放入孵箱，48小时后收集细胞以备后续的检测。另 选两孔加等量Ad-IRES-EGFP 50UL者(T-组，即A549/T-)及两孔未加 腺病毒者(T组)为阴性对照，培养方法同T+组。同时，A549细胞按 l-2X106/孔接种于六孔板中，每孔补充1640培养液至2. 5ml，细胞贴 壁生长，细胞密度达85-90y。用Ad-IRES-EGFP50UL感染接种于A549 (A-组，艮卩A549—组)。(四)携带绿色荧光蛋白的重组腺病毒(Ad-EGFP)在A549/T细 胞中的表达荧光纤维镜下观察荧光蛋白的表达:A-组、T-组和T+组细胞感染 腺病毒24-48小时后在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白(EGFP)的 绿色荧光(图4)。WESTEN-BLOT法检测丽OX的表达:MCF-7、 A549/T+细胞均见大小为 46KDa杂交信号带，A549-和A549/T-细胞未见杂交条带，其中46KDa 位置的信号条带与文献报告一致，证实腺病毒携带的丽OX目的基因成 功表达(图5)。兔抗WW0Xl+4多克隆抗体(abl4691)采用英国ABcom公司产品。实施例2:重组腺病毒介导人WWOX基因对人肺腺癌细胞耐药基因 治疗的实验研究(一)肺腺癌耐药细胞耐药性基因治疗检测(体外药物敏感性实验 -CCK-8法)A549/T+组、A549/T-组和A549-组生长达80%感染Ad (MOI: 50)， 48小时收集细胞；加入96孔培养板中(100ul完全培养基+8000个细 胞/孔)，培养12小时，加入不同浓度的CDDP (澳大利亚科鼎制药有 限公司产品)或TAX (每孔设三个复孔)；37。C培养箱中培养72小时， 接真空泵的一次性输液针头吸尽所测孔培养液，加入完全培养基(预 混的5ul CCK-8+100ul含10。/o胎牛的培养基/ L)，培养3. 5小时；测 定450nm吸光度(参比波长650nm)，计算细胞存活率公式细胞 存活率(％) =[ (A1-A3) / (A2-A3)]，其中，Al:实验孔(含有细 胞的培养基、CCK-8、化疗药物)A2:对照孔(含有细胞的培养基、CCK-8、没有化疗药物)、A3:空白 孔(不含细胞和化疗物质的培养基、CCK-8);通过excel表计算IC50 值；计算耐药指数(RI)^耐药细胞IC50/亲本细胞IC50，计算逆转倍 数(RF):A549/T-细胞IC50/A549/T+细胞IC50 (RK5为低度耐药， RI5-15为中度耐药，RI〉15为高度耐药)；统计学处理:两组均数比较 采用t检验，IC50计算采用加权直线回归分析。Cell counting kit-8 (CCK-8)试剂盒采用DOJIDO株式会社同 仁化学研究所产品。 (二)肺腺癌耐药细胞株对紫杉醇和顺铂耐药基因治疗的效果采用CCK-8法进行了体外药物敏感性分析，计算出A549-、 A549/T-、 A549/T+三组细胞对不同药物的细胞生存率(图6和7)，按
照所得细胞生存率的数据计据计算IC50、 RI和RF (表l， 2)。 表1 Ad-WW0X感染A549/T细胞对化疗药物的IC50值(均数土标准差，ug/ml)A549-A549/T-A549/T+TAXOL 0.05 ±0.010. 97±0. 05 *0. 36±0. 01 *DDP0.02±0.010. 39±0, 01 *0. 14±0.01 ** A549/T+和A549/T-细胞IC50值相比，p<0. 01表2感染腺病毒的A549/T细胞的耐药指数(RI)和丽OX对耐药的逆转倍数(RF)耐药指数— 逆转倍数A549/T-A549/T+泰素 21.398. 012. 69顺铂 13.997. 151. 96由表1可见，感染含WWOX的腺病毒后A549/T(T+)细胞和感染空 腺病毒载体的A54T(T-)细胞，两组细胞经TAXOL或CCDP分别作用72 小时，体外药敏实验(CCK-8法)测定IC50值，T+组IC50较T-组低，t 检验发现有显著差异(-0.01)，因此,冊0X增强耐药细胞对TAX和 CDDP敏感性的结论。由表2可见，A549/T感染空腺病毒载体组(T-)和感染丽0X腺 病毒组(T+)，经泰素作用72小时，逆转倍数为2. 69;耐药指数从21. 39 下降至8. 01，即从高度耐药降至中等度耐药，充分说明A549/T细胞对 泰素敏感性增强，耐药性下降。A549/T感染空腺病毒载体组(T-)和 感染WWOX腺病毒组(T+)加顺铂作用72小时，逆转倍数达1.96;72 小时耐药指数分别从13. 99下降至7. 15，说明A549/T细胞对顺铂敏 感性增强，耐药性下降。因此，从定量角度上讲，可得出WW0X显著增强 了耐药细胞对TAXOL和CDDP (尤其是TAX0L)的敏感性的结论。
权利要求
1、一种重组腺病毒在制备抗肿瘤药物中的应用，其中所述的重组腺病毒携带人WWOX基因。
2、 根据权利要求1所述的应用，所述的重组腺病毒用于制备化疗药 增敏剂。
3、 根据权利要求2所述的应用，所述的重组腺病毒用于制备肺癌化 疗药增敏剂。
4、 根据权利要求l、 2或3所述的应用，所述的重组腺病毒是通过细 胞内质粒同源重组人全长WWOX基因整合到腺病毒载体上获得的。
5、 根据权利要求4所述的应用，其中的腺病毒载体是AdMax腺病毒。
全文摘要
本发明涉及生物学领域。肺癌是死亡率极高的恶性肿瘤，全身化疗成为主要的治疗方法，但决大多数NSCLC在体内和体外都被证实对化疗不敏感。本发明的目的是提供一种携带人WWOX基因的重组腺病毒在制备抗肿瘤药物中的应用，特别是用于制备化疗药增敏剂。本发明首先构建携带人WWOX基因的重组腺病毒，然后建立耐药模型A549紫杉醇耐药株和基因转移方法，观察腺病毒在A549/T细胞的表达；最终通过体外药敏实验证明WWOX能显著逆转紫杉醇和顺铂的耐药性。本发明可逆转肺癌细胞耐药，为最终解决恶性肿瘤的耐药问题提供新的方法。
文档编号C12N15/861GK101130092SQ20071004384
公开日2008年2月27日 申请日期2007年7月17日 优先权日2007年7月17日
发明者吴俊杰, 强 李 申请人:中国人民解放军第二军医大学