专利名称：一种高产核苷磷酸化酶的菌种及阿糖核苷的合成方法
技术领域：
本发明属于生化工程领域，具体涉及一种高产核苷磷酸化酶的菌种及应用 该菌种酶法合成阿糖嘌呤类核苷的方法。
技术背景阿糖嘌呤类核苷有阿糖腺苷，二氨基阿糖腺苷，阿糖肌苷等，其化学结构 式如下。阿糖腺苷 二氨基阿糖腺苷 阿糖肌苷其中阿糖腺苷具有广谱抗病毒的作用，对单纯疱疹病毒i、 n型、带状疱疹病毒的作用明显，对腺病毒、EB病毒、牛痘病毒、巨细胞病毒及乙型肝炎病毒(HBV) 等亦有抑制作用，对核糖核酸(RNA)病毒也有一定的抑制作用。临床上可静脉注 射或外用。阿糖腺苷还是阿糖腺苷单磷酸重要中间体，而后者作为注射剂使用 优势明显。二氨基阿糖腺苷和阿糖肌苷也有一定的抗病毒作用，更是昂贵的生 化试剂，用于生化研究。目前，阿糖嘌呤类核苷的制备可有下列方法1)发酵法 从^^ptow;;c^ a加'W加'cw发酵液中分离得到阿糖腺苷(Juichi Awaya， Journal of antibiotics. 1979,10:1050-1054)。此方法发酵单位低(几十毫克每升发酵 液)，提取困难，发酵周期长，且发酵液中混有其它化合物，不适合于大规模工 业化生产。2) 化学合成法化学合成方法有三类(l)卤代糖与嘌呤经保护、縮合、水解等反应制备。 (2)半合成法由木糖腺苷或核糖腺苷经一些反应使2'-羟基转位。(3)全合成法 由D-阿拉伯糖经噁唑烷合成嘌呤糖苷。(l)法得到的是a和P构型的混合物， 步骤长，收率低。(2)法反应步骤也长，且须经层分离。(3)法原料来源方便，步 骤较短，特别是合成的产物具有立体专一的特点，而且从噁唑烷开始，反应的 中间体不需分离。目前我国主要采用化学合成法生产阿糖腺苷。但是化学合成 过程均需基团保护、脱保护反应、手性试剂和其它特殊防护，其工艺复杂、成 本高、收率低(《20%)、易造成环境污染。3) 酶化学合成法先用化学法合成阿糖尿苷(Ara-U)或阿糖5-甲基尿苷(Am-5MU)，再与嘌呤 在嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)和尿苷磷酸化酶(UPase)的作用下，进行碱基和核 糖基的交换反应。酶法合成阿糖嘌呤类核苷可用分离提纯的酶或完整细胞进行 催化。有许多文献报道了酶法合成阿糖嘌呤类核苷，如文献(TakashiUtagawa， Agric.Biol.Chem.. 1985,49 (4) :1053-1058; Takashi Utagawa， Agric.Biol.Chem.. 1985, 49(8): 2425-2430 ; Tskashi Utagawa ， Agric.Biol.Chem.. 1985， 49(7):2167-2171; 郑一敏，生物学杂志，2002， 19 (6): 20-21; 郭勇莉，生 物技术，2006， 16 (1): 32-35)。这些酶化学法虽然有些可以获得较高的收率，如90%以上，但是使用阿糖
尿苷的量是嘌呤的三倍，浪费严重，且酶转化时间长达24小时以上，酶反应难以控制等缺点。发明内容发明人为克服上述酶化学法合成阿糖嘌呤类核苷存在的酶转化时间长达24 小时以上，酶反应难以控制等技术缺陷，进行了广泛的研究。最终提供一种产 气肠杆菌(5"^ra^"W^rage"M)新菌种，该菌种具有高活力的嘌呤核苷磷酸 化酶和尿苷磷酸化酶，应用该菌种为酶源制备嘌呤类阿糖核苷的方法。该方法应用阿糖尿苷或阿糖5-甲基尿苷为阿糖供体，摩尔转化率最高可达90%以上，且酶反应时间大为縮短。大大增强了反应效率，降低了生产成本，适合于工业 化生产。本发明的构思是这样的，以产气肠杆菌完整细胞为酶源，主要利用嘌呤核 苷磷酸化酶和尿苷磷酸化酶，在微生物非增殖的情况下进行酶转化生成阿糖嘌 呤类核苷。本发明所要解决的技术问题之一是提供一种产气肠杆菌DWOQ-58，以提高 嘌呤核苷磷酸化酶和尿苷磷酸化酶的活力与产量。本发明所要解决的技术问题之二是提供一种生产阿糖嘌呤类核苷的方法。 用于本发明所使用的微生物是属于肠杆菌属的产气肠杆菌。产气肠杆菌 DWOQ-58即为本发明所述的具有高活力核苷磷酸化酶的菌种，以下简称 DWOQ-58。该菌种与产气肠杆菌模式菌种ATCC 13048为同一种。经对 ATCC13048长期深冻，紫外线照射，Y射线辐射，化学试剂处理(如硫酸二乙 酯，亚硝酸，N-甲基-硝基-N-亚硝基胍等)，超声波等诱变处理，即可获得所说 的产气肠杆菌DWOQ-58。本发明的产气肠杆菌(E"to'o^cto' aerogem s) DWOQ-58已于2007年4月30日在中国微生物菌种保藏管理委会员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址中国科学院北京微生物研究所)保藏，保藏号为 CGMCC No. 2035。DWOQ-58具有如下特征1. 形态特征(1) 细胞的形态和大小直杆状，0.6-1.0 umX 1.2-3.0 um;(2) 孢子形成无；(3) 革兰氏染色阴性。2. 在各种培养基上的生长状态(1) 牛肉浸膏琼脂平板培养(30°C， 48小时)菌落形状圆形； 菌落表面隆起扁平状，平滑； 大小2-6mm; 色调浅灰色至灰白色。(2) 牛肉浸膏琼脂斜面培养(30°C， 48小时) 生长良好；生长形态疣状。3. 生理特性(1) 能在以柠檬酸盐或丙二酸盐作为唯一碳源培养中生长；(2) 不从硫代硫酸盐产生H2S;(3) 明胶液化缓慢；(4) 不产生脱氧核糖核酸酶；(5) V-P试验阳性；(6) MR试验阴性；(7) 不产生fl引哚；(8) 可同化葡萄糖酸，果糖，纤维二糖，甘露醇，L-阿拉伯糖，葡萄糖，半乳糖，麦芽糖，龙胆二糖，蜜二糖，棉籽糖，松二糖，乳糖，蔗糖，海藻糖，山梨醇，e-羟基丁酸，琥珀酸，丙二酸，肌醇等；不同化阿拉伯醇，木糖醇，卫矛醇，a-羟基西酸等。(9) pH生长范围:3.0-10.0;(10) 生长最适温度25-35°C;(11) 具有5-氟胞嘧啶抗性；(12) 嘌呤核苷磷酸酶活性14.6单位/mg湿菌体；尿苷磷酸化酶活性24.4 单位/mg湿菌体。根据"伯杰系统细菌学手册"提供的方法和上述试验结果表明，DWOQ-58 属于产气肠杆菌类群，但又与原产气肠杆菌有明显不同，其主要不同之处在于 具有5-氟胞嘧啶抗性，且嘌呤和尿苷磷酸化酶活性明显提高。通过常规的培养方法，可以发酵生产DWOQ-58。以该菌种为酶源，由常规的酶反应方法可以酶法生产嘌呤类阿糖核苷。本发明菌种的培养方法是以碳源、氮源、无机盐以及必要的维生素等有 机营养素加以培养。所说的碳源选自葡萄糖、淀粉水解糖、糖蜜、蔗糖、乳糖、果糖、柠檬酸 盐、丙二酸盐中的一种或多种；所说的氮源选自氨水、酵母膏、牛肉膏、玉米 浆、蛋白胨、大豆水解液、氨基酸复合液中的一种或多种，所说的无机盐选自 磷酸盐、锰盐、钾盐、铁盐中的一种或多种，所说的维生素选自VB、 VB6。产 气肠杆菌的培养方法在对本技术领域的普通技术人员来说是已知的。收集上述方法培养的DWOQ-58，即可直接使用，或者进一步进行菌体处理，
如进行丙酮干燥，超声波处理，表面活性剂，冷冻处理等，以达到提高转化效 率、稳定酶活和提高酶利用率的目的。优选的本发明的菌种培养方法，将所得的产气肠杆菌DWOQ-58置于含有 碳源、氮源、无机盐等的无菌培养基中、pH=7.0、培养温度25-35°。、培养时间 12-48小时。离心发酵液收集菌体，然后用磷酸盐溶液洗涤三次，置于冰箱冷藏备用。用本发明的菌种生产阿糖嘌呤类核苷的方法，包括如下步骤(1) 培养并收集本发明的产气肠杆菌DWOQ-58,禾口，(2) 用将所说的产气肠杆菌DWOQ-58与阿糖供体、嘌呤碱基受体接触， 其特征在于，缓冲液pH5.0-10.0，反应温度为30-70°C，反应时间4-12小时， 阿糖供体和嘌呤碱基受体的浓度为5-50mmol/L，菌体加入量为1-20% (菌体湿 重g/100mL,下同)。优选的生产阿糖嘌呤类核苷的方法，pH为6.5-8。 优选的生产阿糖嘌呤类核苷的方法，反应温度40-60°C 。 优选的生产阿糖嘌呤类核苷的方法，阿糖供体和嘌呤碱基受体的浓度为 10-30mmol/L。优选的生产阿糖嘌呤类核苷的方法，菌体加入量为5-15%。 更优选地，生产阿糖嘌呤类核苷的方法，包括如下步骤(1) 培养并收集本发明的产气肠杆菌DWOQ-58，禾口，(2) 用将所说的产气肠杆菌DWOQ-58与阿糖供体、嘌呤碱基受体接触， 其特征在于，pH为6.5-8，反应温度40-6(TC，阿糖供体和嘌呤碱基受体的浓度 为10-30mmol/L，菌体加入量为5-15%。所说的阿糖供体为阿糖尿苷，阿糖5-甲基尿苷，阿糖胞苷，或其相应的磷酸盐。所说的嘌呤受体为腺嘌呤，二氨基腺嘌呤，次黄嘌呤等。所说的缓冲液可以磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠， 磷酸二氢铵，磷酸铵等。本发明的菌种具有显著的技术进步，如一个具体实施例显示的那样，本发 明的菌种的嘌呤核苷磷酸化酶和尿苷磷酸化酶的活力分别提高了 1倍和21倍， 并能够抗5-氟胞嘧啶。本发明生产阿糖嘌呤类核苷的方法可以获得较高的转化率， 一般均在80%以上，且反应时间縮短为K2小时以内。本发明生产阿糖嘌呤 类核苷的方法的一个实施例中，反应时间6hr，阿糖腺苷摩尔转化率为92%。本 发明无需提取酶，直接以完整菌体参与反应，大大降低了生产操作程序与生产 成本。本发明的酶活分析方法尿苷磷酸化酶活力测定参照Saunders法 (P.RSaunders， Journal of Biological Chemistry, i 969， 244(13):3691-3697),嘌呤核苷 磷酸化酶活力测参照Kalckar法(KalckarH.M，)。核苷类化合物的分析方法采用高效液相色谱法。色谱仪为岛津高效液相色 谱仪；泵LC-10AT;紫外检测器SPD-10A;色谱柱HypersilC18;流动相 水乙腈-95: 5;流速为imL/min;室温；检测波长254nm。本发明的产气肠杆菌DWOQ-58已于2007年4月30日在中国微生物菌种 保藏管理委会员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.2035。
图l为酶反应进程曲线。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步说明本发明，但是应该理解所有这些实施例都
是说明性的，专利保护的范围由权利要求的法律结构确定。 实施例1将产气肠杆菌ATCC13048从斜面上刮一环接种于无菌培养基中(培养基1: 蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L) ， 30"C振荡培养16 小时，收集菌体，用无菌生理盐水洗涤三次，并溶解在无菌生理盐水中，调整 菌密度为10S个/mL，经一系列的诱变处理，均匀的涂辅在无菌培养皿上(培养 基2:培养基加100微克/mL的5-氟胞嘧啶和20g/L琼脂)，3(TC培养三天，选 取生长较好菌落较大的菌种，接于含培养基l摇瓶中，振荡培养24小时。收集 菌体，用磷酸盐缓冲液洗涤三次，测定酶活，最终得到一株高活力的嘌呤和尿 苷磷酸化酶的菌种DWOQ-58。酶活力及特性如表l。表l菌种嘌呤核苷磷酸化酶 (单位/mg湿菌体)尿苷磷酸化酶 (单位/mg湿菌体)抗5-氟胞嘧啶 (100微克/mL)ATCC130481.21.1不长DWOQ-5814.624.4生长良好实施例2将产气肠杆菌DWOQ-58从斜面上刮一环接种于无菌培养基1中，35'C振 荡培养16小时，收集菌体，用无菌生理盐水洗涤三次，菌体冷藏备用。 ATCC13048也按同样方法，获得湿菌体。取1克DWOQ-58湿菌体，分别加入1Ommol/L腺嘌呤，30mmol/L阿糖尿 苷，pH=7.0的磷酸钾缓冲液，总体积10mL, 6(TC振荡反应6小时，反应结束， 高速离心，取上清液分析。阿糖腺苷摩尔转化率为92%。
另取ATCC13048同样操作，阿糖腺苷摩尔转化率仅为11%。 实施例3同实施例2，但是将阿糖尿苷换为阿糖5-甲基尿苷。DWOQ-58催化合成阿 糖腺苷摩尔转化率为87%，而ATCC13048合成阿糖腺苷的摩尔转化仅为8%。 实施例4同实施例2，但是将阿糖尿苷换为阿糖胞苷。DWOQ-58催化的阿糖腺苷摩 尔转化率为82%，而ATCC13048的反应中只有微量的阿糖腺苷生成。 实施例5同实施例2，但是将阿糖尿苷的浓度降低为10mmol/L， DWOQ-58催化的阿 糖腺苷摩尔转化率为80%，而ATCC13048的反应中只有微量的阿糖腺苷生成。 实施例6同实施例2，但是将腺嘌呤换为二氨基腺嘌呤，DWOQ-58的反应中阿糖二 氨基腺苷的摩尔转化率为87%,而ATCC13048的反应中阿糖二氨基腺苷的摩尔 转化率为15%。实施例7同实施例2，但是将腺嘌呤换为次黄嘌，DWOQ-58的反应中阿糖肌苷的摩 尔转化率为81%，而ATCC13048的反应中阿糖肌苷的摩尔转化率为7%。 实施例8同实施例2，但是于3、 6、 12、 24、 36、 48小时取样分析阿糖腺苷，得到 酶反应进程曲线。见图1。
权利要求
1.一种产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)DWOQ-58，保藏号为CGMCCNo.2035。
2. 根据权利要求1的产气肠杆菌DWOQ-58的培养方法，以碳源、氮源、无机 盐以及必要的维生素等有机营养素加以培养，所说的碳源选自葡萄糖、淀粉水 解糖、糖蜜、蔗糖、乳糖、果糖、柠檬酸盐、丙二酸盐中的一种或多种；所说 的氮源选自氨水、酵母膏、牛肉膏、玉米浆、蛋白胨、大豆水解液、氨基酸复 合液中的一种或多种，所说的无机盐选自磷酸盐、锰盐、钾盐、铁盐中的一种 或多种，所说的维生素选自VB、 VB6。
3. 用权利要求1所述的菌种生产阿糖嘌呤类核苷的方法，包括如下步骤(1) 培养并收集本发明的产气肠杆菌DWOQ-58，禾口，(2) 用将所说的产气肠杆菌DWOQ-58与阿糖供体、嘌呤碱基受体接触， 其特征在于，缓冲液pH5.0-10.0，反应温度为30-70°C，反应时间4-12小时， 阿糖供体和嘌呤碱基受体的浓度为5-50mmol/L，菌体加入量为1-20% (菌体湿 重g/100mL)。
4. 根据权利要求3所述的生产阿糖嘌呤类核苷的方法，其特征在于pH为6.5-8。
5. 根据权利要求3所述的生产阿糖嘌呤类核苷的方法，其特征在于反应温度 40画60。C。
6. 根据权利要求3所述的生产阿糖嘌呤类核苷的方法，其特征在于阿糖供体和 嘌呤碱基受体的浓度为10-30mmol/L。
7. 根据权利要求3所述的生产阿糖嘌呤类核苷的方法，其特征在于菌体加入量 为5-15% (菌体湿重g/100mL)。
8. 根据权利要求3所述的生产阿糖嘌呤类核苷的方法，其特征在于pH为6.5-8， 反应温度40-6(TC，阿糖供体和嘌呤碱基受体的浓度为10-30mmol/L，菌体加入量为5-15%。
9.根据权利要求3 8任一所述的生产阿糖嘌呤类核苷的方法，其特征在于， 阿糖供体选自阿糖尿苷、阿糖5-甲基尿苷、阿糖胞苷或其相应的磷酸盐，嘌呤 受体选自腺嘌呤，二氨基腺嘌呤，次黄嘌呤。
全文摘要
本发明一种高产核苷磷酸化酶的菌种及阿糖核苷的合成方法属于生化工程领域，具体涉及一种高产核苷磷酸化酶的菌种及应用该菌种酶法合成阿糖嘌呤类核苷的方法。本发明所要解决的技术问题是提供一种高产嘌呤核苷磷酸化酶和尿苷磷酸化酶的菌种及用改菌种生产阿糖嘌呤类核苷的方法。本发明公开了一种产气肠杆菌，保藏号为CGMCC No.2035，并公开了用该菌种生产阿糖嘌呤类核苷的方法，包括(1)培养并收集本发明的产气肠杆菌DWOQ-58和(2)用将所说的产气肠杆菌DWOQ-58与阿糖供体、嘌呤碱基受体接触。本发明的菌种酶活力高，抗5-氟胞嘧啶，而且转化率，一般均在80％以上，且反应时间缩短为12小时以内。
文档编号C12P19/00GK101113420SQ20071004325
公开日2008年1月30日 申请日期2007年6月29日 优先权日2007年6月29日
发明者丁庆豹, 伶 欧, 邱蔚然, 阎蓬勃, 魏晓琨 申请人:上海蔚平生物科技有限公司