专利名称：一种高效筛选单酶切基因表达载体的方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，尤其涉及基因重组技术，特别涉及一种表达载体的构建和筛选方法，具体来说是一种高效筛选单酶切基因表达载体的方法。
背景技术：
基因重组技术是通过把目的基因重组至质粒或病毒等载体，转染或感染细胞，在细胞中表达目的基因和/或目的基因翻译的蛋白质的一种方法，该技术目前是研究基因或蛋白的常用方法之一。目前通过基因重组构建质粒或病毒载体时一般选用双酶切方法，该方法具有能定向克隆的优点，载体及插入片段在双酶切及连接后不需鉴定插入片段的方向性；但花费较大，选用的两种限制型内切酶的酶切效率可能相差较大，技术要求较高，且要在多克隆位点插入多个片段时可能找不到合适的酶切位点。单酶切方法仅用一种限制型内切酶，花费少，对技术的要求较低，在多克隆位点插入多个片段时可供选择的酶切位点相对双酶切明显要多；但是单酶切的缺点是不能定向克隆，连接后需测序鉴定是否存在插入片段及插入片段的方向是否正确，构建正确重组载体的概率小于50％，因此，测序的样本量至少是双酶切法的2倍，测序费用比双酶切法明显要多。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效筛选单酶切基因表达载体的方法，所述的方法要解决现有技术中的双酶切方法构建重组载体选用的两种限制型内切酶的酶切效率可能相差较大，技术要求较高，且在多次克隆时可能找不到合适的酶切位点和花费高的技术问题，同时要解决单酶切方法构建重组载体不能定向克隆，构建正确的重组载体的概率低和测序花费高的技术问题。
本发明一种高效筛选单酶切基因表达载体的方法，所述的方法包括一个选择合适载体和限制性内切酶的过程，还包括一个利用限制性内切酶对载体进行酶切的过程，还包括一个选择插入基因片段的过程，还包括一个利用上述的限制性内切酶对所述的基因片段进行单酶切的过程，将单酶切酶切后的载体和单酶切酶切后的基因片段转化感受态细胞，根据理论上连接正确的重组质粒的基因序列为模板，以插入基因片段的载体的上序列设计上游引物，根据插入基因片段序列设计下游引物，进行菌落PCR，然后进行电泳，在菌落PCR产物电泳后出现的条带为正确构建的重组载体的菌落。
本发明的工作原理是单酶切后载体及待插入片段均在两端形成黏性末端，连接后会有以下3种情况 A.载体与插入片段连接且方向正确； B.载体与插入片段连接但方向不正确； C.载体自身连接； 以“载体与插入片段连接且方向正确(A情况)”的重组载体序列为模板，根据载体上的序列设计上游引物，根据插入片段序列设计下游引物；在菌落PCR时，正确构建的重组载体(A情况)转化的细菌由于存在DNA模板及相应的上、下游引物，因此PCR能扩增，电泳时可见条带。而“载体与插入片段连接但方向不正确”(即B情况)转化的菌落在PCR时由于插入片段的方向不正确，原先的下游引物此时相当于上游引物，即体系中缺失了下游引物，因此不能扩增出条带。而“载体自身连接”(即C情况)转化的细菌在PCR时没有下游引物结合的序列，因此也不能扩增出条带。因此，只要是PCR能扩增出条带的菌落就是转化有正确构建重组载体的菌落。
本发明和已有技术相比，其技术进步性是显而易见的。本发明充分利用单酶切方法在多克隆位点插入多个片段时可供选择的酶切位点相对双酶切明显要多的特点构建载体，转化细菌后使用特定设计的引物，根据菌落PCR的结果，直接筛选出正确构建的重组载体，从而明显减少测序费用，技术简单，容易推广使用，而且利用单酶切方法在限制型内切酶上花费也较少。由于采用双酶切法构建重组载体，往往也需菌落PCR鉴定，因此本发明并不会增加额外的费用，解决了采用单酶切方法筛选正确构建重组载体时测序费用比双酶切法明显要多的问题。即使双酶切法构建载体时不用行菌落鉴定，本发明的总费用也仅相当于1-2次的测序费用(也相当于1份限制型内切酶的费用)，较不用该方法时的花费明显减少。
图1是本发明采用限制性内切酶对载体进行单酶切后的示意图。
图2是本发明采用限制性内切酶对待插入片段进行单酶切的示意图。
图3是本发明采用限制性内切酶对载体进行单酶切后形成黏性末端的示意图。
图4是本发明采用限制性内切酶对待插入片段进行单酶切后形成黏性末端的示意图。
图5是本发明采用限制性内切酶对载体与插入片段进行酶切后连接且方向正确的示意图。
图6是本发明采用限制性内切酶对载体与插入片段进行酶切后连接但方向不正确的示意图。
图7是本发明采用限制性内切酶对载体与插入片段进行酶切后载体自身连接的示意图。
图8是本发明以正确构建的重组载体为模板，设计引物的示意图。
图9是本发明采用的pTracer-CMV/Bsd真核表达质粒示意图。
图10是本发明的CHMP5-pTracer质粒构建正确的原理示意图。
图11是本发明的CHMP5-pTracer质粒构建不正确的原理示意图。
图12是本发明的菌落PCR电泳图，M为100bp Marker；1-13为各菌落PCR结果。
图13是本发明的pTracer-CMV/Bsd质粒上Bst XI单酶切的位点前后的序列。
图14是本发明的CHMP5-pTracer重组质粒载体测序结果图。
具体实施例方式 本发明的单酶切法构建重组载体及转化感受态细菌的实验方法均为常规使用的方法，参考《分子克隆》等分子生物学书籍。
实施例1 本发明首先采用限制性内切酶对载体进行单酶切(如图1所示)，然后再采用限制性内切酶对待插入片段进行单酶切(如图2所示)，单酶切后载体在两端形成黏性末端(如图3所示)；及待插入片段均在两端形成黏性末端(如图4所示)；连接后会有以下3种情况 A.载体与插入片段连接且方向正确(如图5所示)； B.载体与插入片段连接但方向不正确(如图6所示)； C.载体自身连接(如图7所示)；即 以“载体与插入片段连接且方向正确”(即A情况)的重组载体序列为模板，使用引物设计软件如primer 5或“primer 2”等网上免费软件，根据载体上的序列设计上游引物，根据插入方向正确的片段序列设计下游引物，(如图8所示)，在菌落PCR时，正确构建的重组载体(A情况)转化的细菌由于存在DNA模板及相应的上、下游引物，因此PCR能扩增，电泳时可见条带。而“载体与插入片段连接但方向不正确”(即B情况)转化的菌落在PCR时由于插入片段的方向不正确，原先的下游引物此时相当于上游引物，即体系中缺失了下游引物，因此不能扩增出条带。而“载体自身连接”(即C情况)转化的细菌在PCR时没有下游引物结合的序列，因此也不能扩增出条带。因此，只要是PCR能扩增出条带的菌落就是转化有正确构建重组载体的菌落。
实施例2 本发明采用单酶切法构建重组载体时以“载体与插入片段连接且方向正确”的重组载体序列为模板，使用引物设计软件如primer 5或“primer2”等网上免费软件，根据载体上的序列设计上游引物，根据插入方向正确的片段序列设计下游引物，行菌落PCR，电泳有DNA条带的即为构建正确的重组载体。
本实施例用单酶切法构建CHMP5-pTracer重组质粒载体。
2.CHMP5-pTracer重组质粒载体的构建真核表达质粒载体pTracer-CMV/Bsd购自Ivitrogen公司，如图9所示，其有限制性内切酶BstXI酶切位点。
2.1高保真PCRCHMP5(Genbank编号NM_016410)，使用PrimerPremier 5设计引物，并在上、下游引物5′端加上BstX I的酶切位点及保护性碱基(下面小写字部分)，上游引物为5′tag cca gtg tgg tgg TGC TCAAGA TGAACC GAC TCT 3′，下游引物为5′tgt cca ctg tgc tgg CGA AGAAAG CAT TTC CCA AGC 3′，按照设计，PCR后可得到一段编码完整CHMP5蛋白的DNA序列，PCR产物长851bp。使用TAKARA公司的高保真Taq酶(LATaq)，按说明书行PCR，PCR反应条件为94℃4min；94℃45s，55℃1min，72℃45s，进行30个循环，最后72℃延伸10min结束反应。PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳。琼脂糖凝胶电泳后使用北京鼎国生物公司的DNA快速纯化/回收试剂盒回收、纯化851bp的PCR产物，操作步骤如下紫外灯下切取含DNA片段的琼脂糖(100mg-300mg)并移入1.5ml EP管中，用移液器吸头捣碎后按切取重量溶液A的体积比为1∶3的比例加入溶液A。65℃水浴5-10min，振荡2次，待胶完全融化后置室温，加入15μl溶液B，充分混匀后转入离心柱中，静置2min，10000rpm 30s，弃下清。加500μl溶液C于离心柱中，10000rpm 30s，弃下清。重复此步骤一次。12000rpm再次离心1min，弃下清。将离心柱装入新的离心管中，敞开离心管管口室温静置10min。加入20μl 50℃水浴预热的溶液D，静置2min，13000rpm离心1min，管底液体即为回收的DNA。
2.2Bst XI限制性内切酶单酶切使用MBI公司的限制性内切酶Bst XI分别酶切PCR产物及pTracer-CMV/Bsd质粒，琼脂糖凝胶电泳后回收、纯化酶切产物。酶切后的PCR产物及pTracer-CMV/Bsd质粒使用T4DNA连接酶(MBI公司)相连接，对照质粒为pTracer-CMV/Bsd空质粒。Bst XI酶切体系为40μl体系10×buffer O+4μl，Bst XI 2μl，pTracer-CMV/Bsd质粒或PCR产物4μl，ddH2O 30μl；55℃2h，4℃10min进行酶切。T4连接酶反应体系为10μl，包括酶切后的pTracer-CMV/Bsd质粒3μl，酶切后的PCR产物3μl，10×T4 Ligase Buffer 1μl，T4连接酶1μl，ddH2O2μl，混匀后，置22℃孵育16h。
2.3感受态细胞的转化及阳性菌落的筛选取新鲜TOPO 10感受态菌200μl，加2μl连接物，混匀，冰上放置30min。42℃热休克30s，冰上放置2min。加入250μl S.O.C培养基，37℃200rpm振摇1h。取40μl涂抗氨苄青霉素琼脂平板，37℃过夜。
2.4菌落PCR筛选挑选单个菌落，置入5ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中，37℃200rpm振摇培养过夜后取2μl菌液行菌落PCR。由于我们采用的是Bst XI单酶切，酶切后pTracer-CMV/Bsd质粒与PCR产物在连接时方向可正可负，筛选出连接正确的重组质粒较困难，因此，在设计菌落PCR的引物时我们以连接正确的重组质粒的序列为模板，使用质粒上的T7测序引物位点作为上游引物位点，并在CHMP5插入部分设计下游引物。如果CHMP5片段插入方向正确(如图10所示)，可扩增出长度约210bp的PCR产物，如果插入方向错误，则不能扩增出PCR产物(如图11所示)。T7测序引物为5′TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG 3′，CHMP5下游引物为5′GTG CCA ATG CAG TCA GTC A 3′。PCR反应条件为94℃4min；94℃45s，58℃45s，72℃45s，进行30个循环，最后72℃延伸10min结束反应。PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳(如图12所示)，在菌落PCR产物电泳后出现长度约210bp条带的菌落中应该转有正确构建的重组质粒。
图10表明CHMP5片段正确插入质粒时，针对质粒上T7测序位点的上游引物与CHMP5的下游引物在行PCR时能扩出DNA条带；图11表明CHMP5片段反向插入质粒时，设计的上、下游引物此时相当于两条上游引物，由于缺少下游引物，因此不能扩出DNA条带。同理，当载体自身连接时(没有图示)，由于没有与设计的下游引物结合的DNA模板，因此也不能扩增出条带。由图12可知，菌落7、9和13的PCR产物电泳后可见长度在200-300bp的条带，与我们设计的PCR产物长度为210bp相符，说明在这三个菌落中有正确构建的重组质粒。
2.5测序鉴定取菌落PCR阳性的菌液(选用图12中的7号)3ml，送上海生工生物公司测序；由于pTracer-CMV/Bsd质粒Bst XI单酶切的位点前后的序列为5′CCG AGC TCG GAT CCA CTA GTC CAG TGTG(酶切位点)G TGGA3′(如图13所示)，高保真PCR时的上游引物(不是菌落PCR时的上游引物)为5′tag cca gtg tg(酶切位点)g tgg TGC TCA AGA TGA ACCGAC TCT3′，因此，如果插入片段方向正确，测序结果应该为5′CCG AGCTCG GAT CCA CTA GTC CAG TGT G g tgg TGC TCA AGA TGA ACC GACTCT 3′。我们的测序结果表明重组质粒中插入序列的方向完全正确(如图14所示)，表明我们筛选构建正确的单酶切基因表达载体的方法是有效的。
权利要求
1.一种高效筛选单酶切基因表达载体的方法，所述的方法包括一个选择合适载体和限制性内切酶的过程，还包括一个利用限制性内切酶对载体进行酶切的过程，还包括一个选择插入基因片段的过程，还包括一个利用上述的限制性内切酶对所述的基因片段进行单酶切的过程，其特征在于将单酶切后的载体和单酶切后的基因片段转化感受态细胞，根据理论上连接正确的重组质粒的基因序列为模板，以插入基因片段的载体的上序列设计上游引物，根据插入基因片段序列设计下游引物，进行菌落PCR，然后进行电泳，在菌落PCR产物电泳后出现的条带为正确构建的重组载体的菌落。
全文摘要
一种高效筛选单酶切基因表达载体的方法，包括一个选择合适载体和限制性内切酶的过程，一个利用限制性内切酶对载体进行酶切的过程，一个选择插入基因片段的过程，一个利用限制性内切酶对基因片段进行单酶切的过程，将单酶切后的载体和单酶切后的基因片段转化感受态细胞，根据理论上连接正确的重组质粒的基因序列为模板，以插入基因片段的载体上的序列设计上游引物，以插入基因片段序列设计下游引物，进行菌落PCR，然后进行电泳，在菌落PCR产物电泳后出现的条带为正确构建的重组载体的菌落。本发明采用单酶切方法构建载体，转化细菌后使用特定设计的引物，进行PCR，根据菌落PCR的结果，直接筛选出正确构建的重组载体，减少了测序费用。
文档编号C12N15/63GK101333536SQ20071004303
公开日2008年12月31日 申请日期2007年6月28日 优先权日2007年6月28日
发明者王海嵘, 陈芳源 申请人:上海交通大学医学院附属仁济医院