专利名称：：一种提高光合细菌产氢速率、产量的方法一种提高光合细菌产氢速率、产量的方法
技术领域：
能源和环境是人类目前面临的两大问题。氢气是未来最理想的绿色能源。在自然界中，许多微生物可以在其代谢过程中将水或碳水化合物中的氢质子转化为氣气，在此基础上形成的生物产氢技术有可能使人类摆脱石油危机并告别燃油汽车排放污染。从产氢速率、碳水化合物产氢转化效率和产物纯化难易来看，光合细菌是最有应用前景的类群之一。光合放氢可以利用多种有机酸，其产氢过程将清洁能源的获得、光能的利用和治理有机污染物三者有机地结合在一起。但要将光合产氢技术应用于工业生产并满足人类对能源日益增长的的需求，仍需进一步提高光合细菌产氢的效率，.并寻找合适的废水作为较廉价的碳源。
发明内容本发明的发明目的是为了提供一种提高光合细菌产氢速率、产量的方法，通过改变光合细菌产氢的培养基、引入适当的铁、钼离子以提高产氬效率并降低成本。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现。一种提高光合细菌产氢速率、产量的方法，其步骤如下a)选择菌种选用的类球红细菌(Rhodobactersphearoides)SH-2菌株；由中科院上海生命科学院植物生理生态研究所分子微生物开放实验室提供。它可以利用苹果酸、乙酸、丁酸等进行厌氧光照放氢。b)细胞培养RCVB培养基由适量的碳源，氮源，基本盐，磷酸缓冲液，维生素组成。调pH值至7.00;接入种子液，培养温度30土2摄氏度，在摇床上以160r/min培养1-2天。c)微量元素的加入在培养基中加入适量的钼离子及铁离子。d)废水处理将生活污泥、变质牛奶或酿造废水经过预处理后加入基本盐，维生素，磷酸缓冲液，L-谷氨酸，调pH值至7.00,灭菌。研究表明，光合细菌的固氮酶是铁硫蛋白，是一个氧不稳定的双分子，分子很大很复杂。活性中心除了含有Fe-S外，还含有Mo-Fe活性中心原子簇。实验表明，培养基中铁、钼离子浓度明显影响类球红细菌的产氢速率。图1为本发明中钼离子浓度对产氢总量的影响折线图；图2为本发明中钼离子浓度对最大产氢速率的影响折线图;图3为本发明钼离子浓度与产氢后的0D值关系图；图4为本发明中铁离子浓度对产氢总量的影响折线图；图5为本发明中铁离子浓度对最大产氢速率的影响折线图;图6为本发明铁离子浓度与产氢后的OD值关系图；具体实施方式下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术特点。本发明的实验数据通过以下方法测试a)选择菌种选用的类球红细菌(Rhodobactersphearoides)SH-2菌株；由中科院上海生命科学院植物生理生态研究所分子微生物开放实验室提供。它可以利用苹果酸、乙酸、丁酸等进行厌氧光照放氢。b)细胞培养每1LRCVB培养基由碳源(30mM苹果酸)，氮源(lgL-谷氨酸)，基本盐50ml，磷酸缓冲液7.51111,维生素lml组成。调pH值至L00;接入种子液，培养温度30±2摄氏度，在摇床上以160r/min培养1-2天。c)微量元素的加入在培养基中加入不同浓度的钼离子及铁离子。其浓度分别为Mo"(yM):0,5，10,15,20，30，60，100，3.5Fe2+(yM):0,20，60,80，100,150,200,300,42d)废水处理将生活污泥、变质牛奶或酿造废水经过预处理后加入基本盐，维生素，磷酸缓冲液，L-谷氨酸，调pH值至7.00,灭菌。e)废水中有机酸的测定用岛津气相色谱(Shimadzu,Kyoto,Japan(FID-氢火焰检测器)(毛细管柱)，进样量10juL，进样温度为25(TC,柱温8(TC,检测器温度为260°C。f)产气量测定反应在35mL的试管中进行，用60mL的注射器收集气体。产气过程中记录产气体积，氢气含量由天美气相色谱(TechcorapGC7900，Shanghai)(TCD-热导检测器)(填充柱)检测，进样量O.lmL，进样口80°C，柱温80。C,检测器温度为13(TC。g)0D值的测定用分光光度计(UnicUV2808,Shanghai)检测660nm的吸收值。Mo"对产氢的影响培养基中Mo"的浓度对类球红细菌产氢的产氢总量、底物转化效率、最大产氢速率均有影响，并存在一个明显的峰值，具体数据如下<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>从表中看到，当Mo"浓度在3.5pM时，产氢总量、最大产氢速率及底物转化效率都达到了高峰，分别为105±1ml/33ml培养基、138(mlH2/L'h)、71.22%;当Mo"浓度超过3.5MM时，类球红细菌的产氢效果开始下降；当Mo"浓度超过10iaM时，产氢总量、最大产氢速率及底物转化效率没有大的波动，都维持在相近的水平，分别为70-80ml/33ml培养基左右、60-70mlH2/L.h左右、50%左右。在实验中还观察到，当Mo"浓度低于30iuM时，接种后大约18小时左右类球红细菌开始产气，在20-30小时段达到产气高峰；当Mo"浓度高于30juM时，接种后大约27小时左右类球红细菌开始产气，在30-40小时段达到产气高峰。通过对产气后培养基OD值的检测，发现当Mo"浓度低于5pM时，Mo"浓度越大，0D值越小；当Mo"浓度超过5nM时，Mo"浓度的变化与0D值并无明显联系。说明Mo"浓度对类球红细菌的生长有一定的影响，但此影响不大，且类球红细菌在Mo"浓度为3.5mM的培莽基中生长得最好(除了0pM)。因此，控制Mo"浓度在3.5uM，可以大大增强类球红细菌的产氢效果，提高产氢总量、最大产氢速率及底物转化效率。钼离子浓度对产氢效果的影响可由图1-图3直观表达。Fe"对产氢的影响培养基中Fe2+的浓度对类球红细菌产氢的产氢总量、底物转化效率、最大产氢速率均有影响，具体数据如下<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>从上表可以看到，随着F,浓度的增加，类球红细菌的产氢总量、最大产氢效率、底物转化效率均变大，当Fe"浓度达到42iuM及150iaM时，产氢总量、最大产氢效率、底物转化效率达到高峰，且Fe"浓度为150yM的培养基效果最好，产氢总量、最大产氢效率、底物转化效率分别是122ml/33ml培养基、136mlH2/L.h、82.99%,Fe2'浓度为42(jM的培养基效果略差，产氢总量、最大产氢效率、底物转化效率分别是115ml/33ml培养基、105mlH2/L-h、78.23%;当Fe"浓度在42)aM及150yM之间时，Fe2+浓度的变化对产氣效果影响不大，产氢总量、最大产氢效率、底物转化效率分别是100-110ml/33ml培养基左右、90-100ralH2/Lh左右、65%-75°/左右；当Fe"浓度超过150(jM时，产氢效果较150pM的略差，但基本持平，且无大波动。OD值的检测反映了铁离子浓度变化对类球红细菌的生长影响不大，当Fe"浓度在42pM时，类球红细菌生长得最好，但与其它浓度相比相差很小。因此，控制培养基中Fe2+浓度在42juM或150nM时，类球红细菌产氣效果最好，当然，若F^浓度为150jLiM,虽则产氢速率较大，但同时也伴随着成本的上升。铁离子浓度对产氢效果的影响可由图4-图6直观表达。Mo"与Fe2+的比较将上述两种微粒的实验数据中产气效果最好的两组进行对比，发现类球红细菌在150pMF,的培养基中产氢速率略低于在3.5yMMo"的培养基，但产氢总量与底物转化效率较大。如下表所示:<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>类球红细菌在酿造废水中的产氢情况醋是我国人民非常喜爱的一种富有营养的.酸性调味品，研究表明，醋酸是酿造醋中的主要成分，糖、氨基酸、酯、醛、醇、酚、酮类等为微量化学成分。本课题试验了类球红细菌在酿造厂制醋的废水中的产氢效果。通过对酿造厂制醋的废水进行有机酸检测，发现其中含有一定浓度的乙酸，具体数据如下<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>将该废水稀释1.5倍后进行调制，添加基本盐，维生素，磷酸缓冲液，L-谷氨酸，调pH值至7.OO作为培养液。在35mL试管中加入33mL培养液，用光照强度为4000-5000Lux的光源照射7天。类球红细菌在该废水中的产氢情况如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>以上数据说明，类球红细菌能在酿造废水中放氢，且效果较好。类球红细菌在生活污泥、变质牛奶中的产氢情况生活污泥中含有大量的有机酸，而腐败的牛奶中有一定浓度的丁酸，生活污泥及腐败牛奶经与处理后有机酸的含量见下表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>将生活污泥及腐败牛奶离心，分别在生活污泥和稀释2.7倍的腐败牛奶中加入基本盐，维生素，磷酸缓冲液，L-谷氨酸，调PH值至7.00作为培养液。在35mL试管中加入33mL培养液，用光照强度为4000-5000Lux的光源照射7天。虽然生活污泥及腐败牛奶中有乙酸、丁酸作为碳源，且类球红细菌生长情况良好，但是几乎不产氢。怀疑上述两种废水中含有抑制类球红细菌产氢的物质。因为NH/会抑制光合细菌产氢，故检验了其中的氨氮值，为[NH4+]-0.7523mM,不在抑制产氢的范围内，所以光合细菌不产氢的原因不在于受到"铵抑制"，具体原因仍需进一步分析。(1)从上述实验数据，在培养基里添加钼、铁离子可提高类球红细菌的产氢效率。当Mo"浓度在3.5;aM时，产氢总量、最大产氢速率及底物转化效率都达到了高峰，且生长状况最好。当Fe"浓度达到42mM或150jLiM时，产氢总量、最大产氢效率、底物转化效率达到高峰，其中又以Fe2+浓度为150pM的培养基效果最好，产氢速率最大，但成本也较大。两者相比，类球红细菌在150/aMFe2+的培养基中产氢速率略低于在3.5juMMo"的培养基，但产氢总量与底物转化效率较大。(2)从上述数据可以得出酿造废水可作为类球红细菌光合产氢的廉价碳源。但其在腐败牛奶及生活污泥中却不产氢一一尽管这两类废水里都含有丰富的小分子有机酸。已排除受铵抑制，具体原因有待进一步探讨。权利要求1、一种提高光合细菌产氢速率、产量的方法，其步骤如下a)选择菌种选用的类球红细菌(Rhodobactersphearoides)SH-2菌株；由中科院上海生命科学院植物生理生态研究所分子微生物开放实验室提供。它可以利用苹果酸、乙酸、丁酸等进行厌氧光照放氢；b)细胞培养RCVB培养基由适量的碳源，氮源，基本盐，磷酸缓冲液，维生素组成。调pH值至7.00；接入种子液，培养温度30±2摄氏度，在摇床上以160r/min培养1-2天；c)微量元素的加入在培养基中加入适量的钼离子及铁离子；d)废水处理将生活污泥、变质牛奶或酿造废水经过预处理后加入基本盐，维生素，磷酸缓冲液，L-谷氨酸，调pH值至7.00，灭菌。2、根据权利要求l所述的一种提高光合细菌产氢速率、产量的方法，其特征在于所述的Fe2+离子选用0pM-300juM。3、根据权利要求2所述的一种提高光合细菌产氢速率、产量的方法，其特征在于所述的Fe2+离子选用42juM-150mM。4、根据权利要求3所述的一种提高光合细菌产氢速率、产量的方法，其特征在于所述的Fe2+离子选用150]LiM。5、根据权利要求l所述的一种提高光合细菌产氢速率、产量的方法，其特征在于所述的Fe2+离子浓度为0|iM~100MM。6、根据权利要求5所述的一种提高光合细菌产氢速率、产量的方法，其特征在于所述的F^+离子浓度为3.5)LiM。全文摘要本发明公开了一种提高光合细菌产氢速率、产量的方法，其步骤如下a)选择菌种选用的类球红细菌(Rhodobactersphearoides)SH-2菌株；b)细胞培养RCVB培养基由适量的碳源，氮源，基本盐，磷酸缓冲液，维生素组成。调pH值至7.00；接入种子液，培养温度30±2摄氏度，在摇床上以160r/min培养1-2天；c)微量元素的加入在培养基中加入适量的钼离子及铁离子；d)废水处理将生活污泥、变质牛奶或酿造废水经过预处理后加入基本盐，维生素，磷酸缓冲液，L-谷氨酸，调pH值至7.00，灭菌。实验表明，培养基中铁、钼离子浓度明显影响类球红细菌的产氢速率。文档编号C12N1/20GK101333504SQ200710043028公开日2008年12月31日申请日期2007年6月29日优先权日2007年6月29日发明者朱亦辰申请人:上海市上海中学