专利名称：分离衰老细胞的方法和模型的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和细胞生物学领域；更具体的，本发明涉及产生同一 年龄阶段细胞群的方法以及由该方法获得的细胞群。
背景技术：
衰老问题是长久以来被广泛关注和研究的热点问题之一，通常是指随年龄 增长而发生的渐进的、受遗传因素影响的、复杂的形态结构与生理功能不可逆 的退行性变化，主要表现为生育力的下降和死亡率的上升。衰老在进化上是相 对保守的，从最高等的生物一一人类，到非常低等的原核生物一一细菌，都存 在衰老这一生理过程。细胞衰老是生物体衰老的基本单位，是细胞生理和生化发生复杂变化的过 程，最终可能反映在细胞的形态、结构和生理功能上。单细胞真核生物酉良酒酵母(Sacc力aro/7 yce5 cereWw'ae ， 简称 & cweWw'se)将细胞衰老和个体衰老联系起来，是目前被广泛应用的衰老实验 模型之一。& cerew'siae以出芽生殖的方式产生子细胞，母细胞经过一定次 数的分裂之后走向衰老，随之发生一系列形态结构等方面的变化(Jazwinski, S. M. (1996). Longevity, genes, and aging. Science 54-59)。母细胞所能分裂的终极次数定义为酵母细胞的寿命(life span) (Barton, A. A. (1950). Some aspects of cell division in saccharorayces cerevisiae. J Gen Microbiol《84-86)。然而，由于母细胞和子细胞形态上的相似性以及衰老细胞在整个细胞群体 中所占比例很小，分离衰老的酵母细胞需要复杂的过程以及特殊的装置(Park, P. U.等(2002) ， Separation of mother and daughter cells. Methods Enzymol 468-477)，获得大量衰老细胞在高通量的层面上进行研究就显得非常困 难，衰老细胞的分离问题因此成为本领域硏究的瓶颈和制约因素。因此，本领域迫切需要找到一种可方便地分离出处于同一年龄阶段(如处 于衰老阶段)的细胞群的方法，从而制备出年龄相对统一的细胞模型，用于研究细胞的生长和衰老机制。 发明内容本发明的目的在于提供一种分离的念珠菌细胞群，所述细胞群中大多数细胞 处于同一年龄阶段。本发明的另一目的在于提供一种制备所述念珠菌细胞群的方法以及所述念 珠菌细胞群的用途。在本发明的第一方面，提供一种分离的念珠菌细胞群，所述细胞群具有以下 特征(a) 所述细胞群中细胞数量为102-10'°个；(b) 所述细胞群中80%以上细胞为念珠菌的菌丝状细胞；和(c) 70%以上的所述念珠菌的菌丝状细胞处于同一年龄阶段。 在本发明的另一优选例中，所述细胞群中，90%以上细胞为念珠菌的菌丝状细胞。在另一优选例中，所述细胞群中，80%以上的所述念珠菌的菌丝状细胞处于 同一年龄阶段。在另一优选例中，所述细胞群中90%以上细胞为念珠菌的菌丝状细胞；禾口/ 或90%以上的所述念珠菌的菌丝状细胞处于同一年龄阶段。在另一优选例中，所述细胞群中细胞数量为103-109个；更优选的，所述细 胞群中细胞数量为105-108个。在另一优选例中，所述念珠菌细胞群的平均传代次数为1-30代，更特别的 为5-25代。在另一优选例中，所述的同一年龄阶段是指衰老阶段(如细胞群的平均传 代次数为20代以上)。在另一优选例中，所述的念珠菌是白念珠菌。在本发明的第二方面，提供一种制备所述的念珠菌细胞群的方法，所述方法 包括步骤(a)在适合菌丝状念珠菌细胞生长的条件下，培养念珠菌细胞群，形成念珠 菌菌丝状细胞群；(b)在适合酵母状念珠菌细胞生长的条件下，培养步骤(a)的念珠菌的菌丝状 细胞群，从而形成含有念珠菌的菌丝状细胞和酵母状子细胞的混合细胞群；和(C)从步骤(b)获得的混合细胞群中分离出念珠菌的酵母状子细胞群，并且在 适合菌丝状念珠菌细胞生长的条件下，培养该酵母状子细胞群，从而形成念珠菌的菌丝状细胞群；(d) 在适合酵母状念珠菌细胞生长的条件下，培养上一步骤所获得的念珠菌的菌丝状细胞群，从而形成含有念珠菌的菌丝状细胞和酵母状子细胞的混合细胞群；(e) 从步骤(d)获得的混合细胞群中分离出念珠菌的菌丝状细胞群。 在本发明的另一优选例中，该方法还包括以下步骤(f) 重复步骤(d)和(e)卜20次，从而获得平均传代次数为2-30代的念珠 菌的菌丝状细胞群。在另一优选例中，在步骤(e)或(f)中，还包括分析所获得的念珠菌的菌 丝状细胞群的平均传代次数。在另一优选例中，步骤(b)中培养时间为0.5-5小时。在另一优选例中，步骤(b)中培养时间为1-4小时，进一步优选的是2-3小时。在另一优选例中，所述的适合菌丝状念珠菌细胞生长的条件为35-42°C，血 清诱导。在另一优选例中，所述的适合菌丝状念珠菌细胞生长的条件为36-40°C。进 一步优选的，所述的适合菌丝状念珠菌细胞生长的条件为37-38°C。 更优选的，所述的血清是小牛血清或胎牛血清。在另一优选例中，所述的适合酵母状念珠菌细胞生长的条件为25-32°C。更优选的，所述的适合酵母状念珠菌细胞生长的条件为28-30°C。进一步优选 的，所述的适合酵母状念珠菌细胞生长的条件为3(TC。在另一优选例中，在步骤(c)中，通过密度梯度离心分离出念珠菌的酵母 状子细胞群；或者，在步骤(e)中，通过密度梯度离心分离出念珠菌的菌丝状细胞群。在另一优选例中，所述的念珠菌是白念珠菌。在另一优选例中，所述念珠菌的培养基是YPD培养基。在本发明的第三方面，提供所述的细胞群的用途，用于作为硏究细胞的生长、 发育、代谢、衰老的模型；或用于筛选调节细胞的生长、发育、代谢、衰老的物质。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而 易见的。
图1显示了白念珠菌的形态及寿命。其中图1A显示了白念珠菌在不同生长条件下的形态转换。左3(TC，酵母形态；中37°C，血清诱导，菌丝形态；右菌丝状母细胞在3CTC非诱导条件下产生酵母状子细胞。 图1B显示了酵母形态和菌丝形态的白念珠菌细胞具有相同的复制型寿命。图2显示了在白念珠菌中大规模分离衰老细胞系统的建立。其中 图2A显示了该分离系统中的菌丝状母细胞主要是由4-6个细胞串联组成 的菌丝体；图2B显示了菌丝状细胞的分离效率接近80%;图2C显示了随时间进程分离得到的细胞具有依次递减的复制型寿命。图 中，从右至左的曲线分别代表细胞群的平均复制型寿命分别为22.9， 13.1， 8.4， 5.4。图3显示了检测衰老过程中白念珠菌细胞的氧化损伤蛋白水平的结果。其中-图3A显示了 Coomassie blue染色显示不同年龄细胞样品的总蛋白水平基 本一致。其中，泳道l、 3、 5、 7分别代表平均寿命22. 9代、13. l代、8. 4代、 5. 4代的细胞样品加入2，4-二硝基苯酰肼反应后的检测结果，泳道2、 4、 6、 8 分别代表平均寿命22. 9代、13. l代、8. 4代、5. 4代的细胞样品不加2， 4_二硝基苯酰肼反应的检测结果.。图3B显示了抗DNP抗体免疫检测细胞中氧化损伤蛋白水平，Tubulin作为 内参。其中，泳道l、 3、 5、 7分别代表平均寿命22. 9代、13. l代、8. 4代、5. 4代的细胞样品加入2,4-二硝基苯酰肼反应后的检测结果，泳道2、 4、 6、 8 分别代表平均寿命22.9代、13.1代、8.4代、5.4代的细胞样品不加2,4-二 硝基苯酰肼反应的检测结果。
图4显示了碘染色法检测白念珠菌细胞中的糖原水平。其中 图4A显示了在白念珠菌细胞衰老过程中，随年龄的递增碘染色逐渐加深， 显示细胞内糖原水平依次升高。其中，1(平均寿命22.9代)、2(平均寿命13. 1 代)、3(平均寿命8.4代)、4(平均寿命5.4代)分别表示滤纸上年龄依次递增 的白念珠菌细胞点区域。
图4B显示了图4A的定量分析。
图5显示了 Southern杂交检测白念珠菌细胞的端粒长短。基因组DNA经 酶切消化后进行琼脂糖电泳分离，与46nt端粒特异性探针杂交。其中，泳道M 为DNA marker;泳道1-8:不同年龄的细胞提取的样品的杂交结果，其中，泳道l， 2:平均寿命22. 9代；泳道3， 4:平均寿命13. l代；泳道5， 6:平均 寿命8.4代;泳道7， 8:平均寿命5.4代；泳道Y:酵母形态的细胞样品的杂 交结果；泳道H:菌丝形态的细胞样品的杂交结果。
图6显示了白念珠菌衰老细胞中ERC的检测。其中图6A显示了平均寿命分别为2么9(泳道1)， 13. 1(泳道2)， 8.4(泳道3)， 5.4(泳道4)的细胞群样品的基因组DNA进行0. 7%琼脂糖凝胶电泳，转膜后与 rDNA探针相杂交的结果。
图6B显示了平均寿命分别为22.9(泳道1)， 13. 1(泳道2)， 8. 4(泳道3)， 5.4(泳道4)的细胞群样品的基因组測A经酶切，电泳，转膜，与rDNA探针杂 交，洗掉信号后再与ACT1探针杂交的结果。
图6C显示了对图6B的定量分析。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的硏究和试验，基于念珠菌在不同生长条件下具有明显不同的两种生长形态(酵母状形态和菌丝状形态)且形态上的不同并不 影响其传代次数的特点，首次开发了一种可方便大量地获得处于同一年龄阶段(如衰老阶段)的细胞群的方法。所述处于同一年龄阶段的细胞群可用于研究细 胞生长、发育及其在各个年龄阶段的特征，以及用于研究细胞的衰老，从而为 生物体的生长、发育、衰老机制的研究提供了有效的途径。在此基础上完成了 本发明。如本发明所用，所述的"菌丝状"是念珠菌在高温(通常35-42。C)和诱导条 件(如血清诱导)下形成的一种形态，通常由l个或多个菌丝细胞串联组成菌丝体。 如本发明所用，所述的"念珠菌的菌丝状细胞群"是指一群细胞，该细胞群中大多数(通常80%以上，更佳地90%以上，最佳地95%以上)细胞是以念珠菌的菌 丝状形态生长的。如本发明所用，所述的"酵母状"是念珠菌在常规适合酵母生长的条件(如 3(TC左右)下形成的一种菌体形态，通常呈现为圆形或椭圆形。如本发明所用，所述的"念珠菌的酵母状细胞群"是指一群细胞，该细胞群 中大多数(通常80%以上，更佳地90%以上，最佳地95%以上)细胞是以念珠菌的酵母状形态生长的。如本发明所用，所述的"处于同一年龄阶段"是指所述的念珠菌细胞群中大 多数细胞(一般为总细胞数的70%以上，更佳地为总细胞数的80%以上，最佳地为 总细胞数的90%以上)处于接近的细胞年龄，也即各细胞的传代次数接近(通常各 个细胞的传代次数相差不超过土5代；更优选的，各个细胞的传代次数相差不超过 土3代；最优选的，各个细胞的传代次数相差不超过土2代)。如本文所用，所述的"平均传代次数"是指细胞群中各细胞的传代次数的平 均值。例如，细胞群中有80%细胞处于传代第10代，8%细胞处于传代第9代，8% 细胞处于传代第11代，2%处于传代第8代，2%处于传代第12代，则按照平均计算， 该细胞群的传代次数为传代第10代。如本文所用，所述的"复制型寿命(R印licative Life Span)"或"复制 寿命"是指待测念珠菌细胞可产生的酵母状子细胞的个数，如果菌丝体包含大 于1个细胞，则计算每个细胞产生子细胞个数的平均值。例如，念珠菌l只包含一个细胞，则该念珠菌的复制型寿命即是其总共产生的子细胞个数；念珠菌 2(菌丝状)包含3个细胞，则该念珠菌的复制型寿命即是其总共产生的子细胞个数除以3获得的数值。可通过常规的Life Span Assay方法来分析念珠菌细 胞的复制型寿命。通常，待测念珠菌细胞的年龄越大(传代次数越多)，其复制 型寿命越低；反之，待测念珠菌细胞的年龄越小(传代次数越少)，其复制型寿 命越高。如本文所用，所述的"平均复制型寿命"或"平均复制寿命"或"平均寿 命"是指一个念珠菌细胞群中细胞的复制型寿命的平均值。念珠菌本发明的用于制备处于同一年龄阶段细胞群的方法是利用念珠菌(&/7^&)进行的。念珠菌属于半知菌纲的酵母菌，其具有多形态，在不同的 条件下能形成酵母状形态和菌丝体形态。作为本发明的一种优选方式，所述的念珠菌是白念珠菌(&/7&'& WWc朋s，简称C. WWc朋s)。白念珠菌是念珠菌的一种，亦称"白色假丝酵母"，在约3CTC时以酵母形态生长，在约37-4(TC以及某些诱导因子存在时可 以形成菌丝体，但如果回复到3(TC非诱导条件培养时菌丝状的细胞又可以分裂 产生酵母状的子细胞，但菌丝状细胞本身不会再回复到酵母状的形态。本发明人正是利用了念珠菌的形态差异，来建立大规模有效分离衰老细胞 的方法。制备处于同一年龄阶段细胞群的方法基于念珠菌在不同的培养条件下菌体形态明显不同以及该形态上的不同 并不影响念珠菌的复制和传代这一特征，本发明提供了一种制备处于同一年龄 阶段细胞群的方法。由于念珠菌在生长过程中，不断地复制产生子代细胞，子代细胞再复制产生 下一代细胞，因此在常规的念珠菌培养物中， 一般含有处于各种不同年龄阶段的细 胞，有的是年轻的细胞(如传代次数为5次以下，或如复制型寿命为20代以上)， 有的是衰老的细胞(如传代次数为20次以上，或如复制型寿命为5代以下)。由于 处于不同年龄阶段的细胞的复制速度、代谢机制、生理特征等均可能是不同的，这 给研究细胞的发育和衰老机制造成了困难。因此需要分离出属于同一年龄阶段的细胞，从而便于研究人员细致地观察细胞生长的不同年龄阶段的各种特征D通常念珠菌细胞在复制了 20-30代后成为衰老细胞，作为前提条件，为了后 续获得处于同一年龄阶段的细胞群，必须在复制起始的时候各细胞也处于同一年龄 阶段。因此，为了获得复制起始的时候处于同一年龄阶段的细胞，本发明人首先在 适合菌丝状念珠菌细胞生长的条件下，培养念珠菌细胞群，形成菌丝状细胞群； 然后，将该菌丝状细胞群在适合酵母状念珠菌细胞生长的条件下、在相对短的时间内培养(一般是0.5-5小时，更优选的为1-4小时，进一步优选的是2-3小时)， 形成含有菌丝状细胞和酵母状子细胞的混合细胞群；之后从该混合细胞群中分离出 酵母状子细胞群，该子细胞群可作为起始的最年轻的细胞(处于同一年龄阶段)，用 于后续制备处于同一所需年龄阶段的细胞群。之后，在适合菌丝状念珠菌细胞生长的条件下，培养前述获得的作为起始的 最年轻的酵母状细胞群，使之形成最年轻的菌丝状细胞群。之后，将前述形成的菌丝状细胞群在适合酵母状念珠菌细胞生长的条件下培 养，使之产生酵母状子细胞，形成含有菌丝状细胞和酵母状子细胞的混合细胞群； 然后，在子细胞达到一定浓度后，根据菌丝状细胞与酵母状细胞的形态不同，从中 去除酵母状子细胞，分离出菌丝状细胞群。然后，可分析或估测所述菌丝状细胞群的细胞年龄，如细胞未达到所需年龄，则可在适合酵母状念珠菌细胞生长的条 件下再培养菌丝状细胞，使之产生酵母状子细胞，在子细胞达到一定浓度后除去子细胞，分离菌丝状细胞，该步骤可重复多次进行，直至获得处于同一所需年龄阶 段细胞的菌丝状细胞群。由于子细胞在达到一定的浓度后会抑制菌丝状母细胞的复制，因此，在菌丝 状母细胞产生的子细胞达到一定的浓度后，需要从混合培养物中分离掉子细胞，使 得菌丝状母细胞能够继续产生子细胞且年龄逐渐增加。本领域人员通常可根据常规 的念珠菌复制规律来确定该浓度，通常，当混合培养物的OD,值达到2-5时，可 分离掉子细胞。本发明对适合酵母状念珠菌细胞生长的条件没有特别的限制，只要该条件是 适合于酵母状念珠菌生长的，且基本上不会使酵母状念珠菌生长成菌丝状念珠菌。 作为本发明的优选方式，所述的适合酵母状念珠菌细胞生长的条件为25-32'C; 更优选的，所述的适合菌丝状细胞生长的条件为28-3(TC;进一步优选的，所述的 适合菌丝状细胞生长的条件为3(TC。本发明对适合菌丝状念珠菌细胞生长的条件没有特别的限制，只要该条件是适合于菌丝状念珠菌生长的，且基本不会使菌丝状念珠菌生长成酵母状念珠菌。作为本发明的优选方式，所述的适合菌丝状念珠菌细胞生长的条件为35-42°C，血 清诱导(通常可调节pH 7.0左右，起始酵母细胞浓度107ml左右)。更优选的， 适合菌丝状细胞生长的温度条件为36-40°C;迸一步优选的，适合菌丝状细胞生长 的温度条件为37-38°C。任何本领域已知的适合于培养酵母状念珠菌和菌丝状念珠菌的培养基均可用 于本发明，只要该培养基能够提供念珠菌进行生长、复制等所需的足够的能量和营 养。作为本发明的优选方式，念珠菌的培养基是YPD培养基。本发明对诱导酵母状念珠菌形成菌丝状念珠菌的诱导方法没有特别的限制， 任何可使得酵母状念珠菌形成菌丝状念珠菌的诱导方法均是可用的，包括但不限于 采用血清诱导。当需要培养菌丝状念珠菌时，可在YPD培养基中加上诱导成分如血 清等；诱导成分的加入浓度是本领域人员熟知的常识。本发明对分离酵母状念珠菌和菌丝状念珠菌的方法没有特别的限制，只要该 方法能够在不影响菌株存活和特性的前提下可将两种的念珠菌进行分离。作为本发 明的优选方式，所述的分离是基于酵母状念珠菌和菌丝状念珠菌形态的不同进行分 离的。通常，所述的方法包括但不限于离心法、过滤法。作为本发明的更优选 方式，通过密度梯度离心分离酵母状细胞和菌丝状细胞，该方法不仅不影响菌株 存活和特性，而且分离效率非常高，其优于过滤法的特点还在于不会在分离过程中 造成滤器的堵塞。Life Span Assay表明，白念珠菌形态上的不同并不影响其复制性寿命长 短(见图1B),也即不影响白念珠菌细胞的传代次数。因此，本发明人以菌丝体 为母细胞，使其不断分裂产生酵母状的子细胞，从而发生复制性衰老。按照上 述思路，本发明人通过蔗糖密度梯度离心的方法分离菌丝状的母细胞和酵母状 的子细胞，在整个复制性细胞衰老的过程中收集各个年龄阶段的菌丝状母细 胞，对不同年龄的白念珠菌细胞(包括年轻细胞)进行研究。由于菌丝状的母细 胞和酵母状的子细胞在形态上存在非常显著的差异，从而使分离效率大大提 高，因此本发明的方法与现有技术人员在5". cerew'w'ae中的分离方法相比， 具有明显的优势。在本发明的实施例中，本发明人根据已知的衰老细胞的特征对本发明所建 立的分离方法进行了一系列实验验证。结果证明，采用本发明的方法分离得到的衰老的菌丝状母细胞确实是复制型衰老的。同时还发现了白念珠菌的细胞衰老过程不同于5". cereWw'3e的一些特性，因而对细胞衰老的机理有了更深入 的理解。本发明的方法操作简单易行，便于大量制备，并且可以获得处于衰老各个 阶段的不同年龄的细胞，解决了大规模高通量实验细胞制备的难题，为更好更 深入地研究细胞衰老的发生机制奠定了基础。本发明的方法为大规模高通量的获得同一年龄阶段细胞提供了有效的途 径，从而可用于后续开展大规模的基因组学以及蛋白质组学研究，筛选出调控 细胞生长、衰老过程的基因或途径，在更深的层面上进一步探索细胞生长、衰 老的分子机制。处于同一年龄阶段的细胞群及其用途本发明还提供了一种细胞群，其是由通过本发明的方法制备的处于同一年 龄阶段的细胞组成。本发明所述细胞群具有以下特征(a) 所述细胞群中细胞数量为102-10'°个；(b) 所述细胞群中80%以上细胞为念珠菌的菌丝状细胞；和(c) 70。/。以上的所述念珠菌的菌丝状细胞处于同一年龄阶段。 作为本发明的优选方式，所述细胞群中，90%以上细胞为念珠菌的菌丝状细胞；更优选的，95%以上细胞为念珠菌的菌丝状细胞。作为本发明的优选方式，所述细胞群中，80%以上的所述念珠菌的菌丝状细 胞处于同一年龄阶段；更优选的，90%以上的所述念珠菌的菌丝状细胞处于同一 年龄阶段；进一步优选的，95%以上的所述念珠菌的菌丝状细胞处于同一年龄阶 段。本发明的方法对于大规模地获得同一年龄阶段的细胞是特别有用的，因 此，本发明所述的细胞群通常有102-10'°个细胞(优选的，所述细胞群中细胞数 量为103-109个；更优选的，所述细胞群中细胞数量为105-108个)。然而，应理 解，在得知了本发明提供的方法后，本领域人员也可能可以利用该方法制备出 少于102或多于10'。个念珠菌细胞的细胞群，该细胞群也应被涵盖在本发明的 范围内。本发明的方法可以制备出处于任何年龄阶段的细胞群，例如可以是平均传代次数为3代的年轻细胞，或是平均传代次数为20代的衰老细胞；或者，也可以是平均复制型寿命为3代的衰老细胞，或是平均复制型寿命为20代的年轻 细胞。通常，所述念珠菌的菌丝状细胞的平均传代次数为1-30代，更佳的为5-25 代。通常，当需要研究衰老细胞的特性时，可制备平均传代次数高于15代，更 优选的高于20代的念珠菌细胞群。本发明的处于同一年龄阶段的念珠菌细胞群可以作为一种细胞模型，用于研 究细胞在生长、发育、衰老等各种阶段中的形态、结构、代谢等机制；还可用 于筛选调节细胞生长、发育、代谢、衰老等机制的物质。筛选抗衰老物质作为本发明的一种应用方式，可利用本发明的方法来制备衰老细胞群，从而用于筛选抗衰老的药物。所述的筛选方法为将候选物质与衰老细胞接触， 判断该物质对于衰老细胞的影响，如果该物质能够延缓衰老细胞的死亡或促进 (优选显著促进)衰老细胞的代谢，则说明该物质是一种抗衰老的潜在物质。 优选的，所述筛选方法例如包括步骤在测试组中，在衰老细胞的培养物中添加候选物质；检测衰老细胞的平均 传代次数，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的、与 测试组衰老细胞处于同一年龄阶段的细胞。将测试组中细胞的平均传代次数与 对照组中细胞的平均传代次数进行比较，如果测试组中细胞的平均传代次数在 统计学上显著高于对照组(如测试组细胞的平均传代次数比对照组高3代；更优选的为高4代，进一步优选的为高5代或更高)，就表明该候选物是抗衰老的潜在药物。本发明的主要优点在于(1) 首次基于念珠菌在不同生长条件下具有明显不同的两种生长形态的特 点，幵发出制备处于同一年龄阶段(如衰老阶段)的细胞群的方法。(2) 所述处于同一年龄阶段的细胞群可用于研究细胞生长、发育及其在各 个年龄阶段的特征，以及用于研究细胞的衰老，从而为生物体的生长、发育、 衰老机制的研究提供了极其有效的途径。(3) 采用本发明的方法，可方便地大量制备年龄接近的衰老细胞，从而为研究和筛选抗衰老的药物提供了极其有效的途径。(4)本发明的方法操作简单易行，特别有利于高通量地制备处于同一年龄 阶段的细胞群，克服了以往本领域技术人员难以有效地分离衰老细胞和年轻细 胞的技术缺陷。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂 商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟 悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于 本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1处于同一年龄阶段的细胞的分离方法 1.菌株及培养条件实验所用菌株为白念珠菌(Cs/2&Va a乃ic朋s)野生型菌株SC53H (购自 ATCC)。酵母状细胞培养条件为30。C， YPD培养基。在该培养条件下，白念珠菌的 生长状态如图1A左图所示。菌丝状细胞培养条件为37t;， YPD+157。小牛血清。在该培养条件下，白念 珠菌的生长状态如图1A中图所示。当将白念珠菌菌丝状细胞从该培养条件回复 到培养条件为3(TC, YPD培养基继续培养时，其可产生酵母状的子细胞如图1A右图所示。YPD培养基的配方如下 蛋白胨 2%， 酵母抽提物 1%， 葡萄糖 2%， 配制在蒸馏水中。2.分离衰老细胞的方法① .取新鲜白念珠菌野生型菌株SC5314单克隆接种至YPD液体培养基， 于3(TC过夜培养，该培养物中包含各种年龄阶段的酵母状细胞；② .用新鲜YPD稀释过夜培养物至0D,约为0. 1，力Q 15%小牛血清于37°C 诱导4-5小时，得到各种年龄阶段的菌丝状细胞；③ .将菌丝状细胞收集并转移至新鲜YPD液体培养基中，3(TC培养2.5小 时，使菌丝状母细胞在一个相对短的时间内产生酵母状子细胞，以0-30%不连 续蔗糖密度梯度于1000rpm离心3rain收集上层水相中的酵母状子细胞，该子 细胞被认为是最年轻的子细胞； .以2中的条件诱导菌丝状细胞，得到作为起始的母细胞； .换用新鲜YPD液体培养基于3crc连续培养菌丝状母细胞，根据需要在不同时间以0-30%不连续蔗糖密度梯度离心，去掉上层酵母状子细胞，收集下 层菌丝状母细胞，并换用新鲜YPD培养液继续培养，直至得到最衰老的母细胞。 在连续培养过程中，当培养物的0Ds。。值达到2-5时，都需进行细胞分离，去掉培 养物中大量的子细胞并换新鲜培养液以保证母细胞的正常生长状态。显微观察显示，菌丝状母细胞主要由4-6个细胞串联而成，如图2A。菌丝 状细胞的分离效率接近80%，如图2B，考虑到每个菌丝状母细胞端部的酵母状 母细胞约占10%以上，该方法分离衰老细胞的效率可达90%以上，已经相当理 想。本发明人将平均每个菌丝细胞所产生的酵母状子细胞的个数定义为该菌丝 状母细胞的复制型寿命(R印licative Life Span)。如果菌丝体包含大于1 个菌丝细胞，则计算每个菌丝细胞产生子细胞个数的平均值。 复制型寿命检测实验(Life Span Assay)的操作如下 从需要进行复制型寿命检测的细胞群体中随机选取细胞放置于YPD平板 上，通过显微操作仪将50-80个细胞有序的排布到平板上的固定位置。在30。C 培养使细胞进行1-2次分裂，去掉子细胞并计数，重复该步骤，直至所有的母 细胞不再分裂。夜间将平板置于4'C。对于只包含一个菌丝细胞的菌丝体，可 以以子细胞的个数来代表分裂代数；对于包含多于一个菌丝细胞的菌丝体，则 计算每个细胞产生子细胞个数的平均值，即以获得的总的子细胞数除以细胞个 数作为分裂代数。统计数据并由Wilcoxon rank-sum检验确定是否有统计学意义，P值小于0.05表示两组数据之间存在显著差异。3.分离处于各个年龄阶段的细胞群除了上述制备衰老细胞以外，可通过减少菌丝状母细胞的复制时间和复制 代数，来获得所需各个年龄阶段的细胞。因此，根据前述制备衰老细胞类似的 方法，本发明人还在细胞复制的不同时间点分别获取细胞群，获得4种处于各 个年龄阶段的菌丝体细胞群(其中一种细胞群是最年轻的细胞)。分别对前述获得的4种处于各个年龄阶段的细胞群进行Life Span Assay 实验，结果见图2C。由结果表明，本发明人分离得到的不同年龄阶段的细胞具 有不同的复制型寿命，从起始最年轻细胞算起，平均复制型寿命分别是22. 9(最 年轻的细胞，平均传代次数约为1代)，13. l(平均传代次数约为10.8代)， 8.4(平均传代次数约为15.5代)，5.4(平均传代次数约为18.5代)代，且每一 细胞群中的细胞大多处于同一年龄阶段，确实反映了白念珠菌细胞复制性衰老 的进程。实施例2.氧化损伤蛋白在白念珠菌衰老过程中不断积累衰老的细胞对某些压力如氧化压力的抗性会大大下降，所以衰老细胞中积 累的氧化损伤的蛋白应该也较年轻细胞要多。被氧化修饰的蛋白分子中会被不 可逆的引入羰基基团，本发明人利用羰基基团的化学特性，结合免疫检测的方 法对分离得到的不同年龄的白念珠菌细胞中氧化损伤蛋白的水平进行了对比 分析。本发明人分别取平均寿命为22. 9， 13.1, 8.4， 5. 4代的白念珠菌细胞群， 进行氧化损伤蛋白检测实验。氧化损伤蛋白检测实验如下用常规的玻璃珠方法裂解细胞抽提总蛋白，Bradford定量蛋白浓度，将各 样品总蛋白浓度调整至相同量(OO n g/" 1)。取1倍体积样品与1倍体积12。/。SDS 混合，力口2倍体积2， 4-二硝基苯酰肼(2,4-Dinitrophenylhydrazine， 20mM，溶 于10%三氟乙酸)反应(Levine等(1994) ， Carbonyl assays for determination of oxidatively modified proteins. Methods Enzymol i^J, 346-357)， 室 温，15-30min。加入1.5倍体积2M Tris/30%甘油/19°/。巯基乙醇中和。进行SDS-PAGE电泳，Coomassie blue染色；及利用抗2， 4- 二硝基苯酚 (2， 4-dinitr叩henyl)抗体(购自ZYMED公司)进行Western Blot检测，出现条带 且条带越深，表示氧化损伤的蛋白水平越高。
结果显示，随着年龄增加，细胞中氧化损伤的蛋白水平明显升高，见图3A 和图3B所示。这说明氧化损伤的蛋白在衰老的细胞中不断积累。结合在5\ cerew'w'ae中的研究成果，本发明人认为衰老细胞中氧化损伤蛋白的积累主 要是抗氧化压力能力的下降所引起，而非细胞衰老过程中活性氧的形成增多所 导致。
实施例3.糖原水平伴随白念珠菌细胞衰老进程不断升高衰老的细胞是代谢不旺盛的细胞，因此某些代谢产物会在衰老细胞中积 累。酵母中细胞衰老的过程伴随着糖原异生以及能量储存，因此衰老细胞中糖 原水平较高(Lin, S. S.等(2001)， Enhanced gluconeogenesis and increased energy storage as hallmarks of aging in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem 2% 36000-36007.)。基因组学研究表明，糖原合成的基因在衰老细胞 中表达上调(Lesur， . I.等(2004) ， The transcriptome of prematurely aging yeast cells is similar to that of telomerase-deficient cells. Mol Biol Cell 75， 1297-1312.)。在高等生物中，糖原积累不但在生理性衰老过程中发 生，还在一些病理性条件下出现。
本发明人取平均寿命分别为22. 9， 13.1, 8.4， 5.4代的白念珠菌细胞群， 进行糖原水平检测实验。
糖原水平检测实验如下-
用血球计数板对各组细胞样品进行细胞计数，取等量的各组细胞样品点在 GF/C滤纸(购自Whatman公司)上，于37 °C用碘蒸气熏蒸2-3rain ，拍照并用 Bio-Rad Quantity-One program(购自Bio-Rad公司)定量分析,结果见图4A和 图5B所示。
本发明人的实验结果表明，在白念珠菌衰老过程中糖原水平发生了显著升 高。糖原的积累可能反映了衰老细胞中某种程度的糖代谢紊乱和能量翻转。
实施例4.白念珠菌细胞衰老过程中端粒长度保持稳定端粒是真核生物染色体末端由重复的DNA序列及其结合蛋白所组成的核蛋白复合物，端粒可以维持染色体的稳定性以及帮助DNA完整复制的进行。端粒 酶是一个特化的逆转录酶，起着延伸端粒的作用。在野生型5". cereWWse细 胞中，端粒酶是有活性的，因此端粒并不会随着细胞分裂即复制型细胞衰老的 进行而縮短。为了回答在白念珠菌中是否也存在同样的机制，本发明人检测了 不同年龄的白念珠菌细胞端粒的长短。本发明人取平均寿命分别为22. 9, 13.1, 8.4， 5.4代的白念珠菌细胞群， 进行端粒长短检测实验。端粒长短检测实验如下用常规的玻璃珠法抽提各组细胞的基因组DNA， NlaIII和AluI酶切后进行 0.9%琼脂糖凝胶电泳，转移至Hybond-N+膜(Amersham Biosciences),与包含 两个白念珠菌端粒重复序列的5'末端32P标记的寡核苷酸探针 (5， -gaa-gtt-aga-cat-ccg-tac-acc-aag-aag-tta-gac-atc-cgt-aca-cca-a-3，)进行Southern杂交(Singh， S. M.等(2002) ， Analysis of Telomerase in Candida albicans: Potential Role in Telomere End Protection. Eukaryot Cell人967-977)。结果见图5，由结果可见，白念珠菌在整个生命周期中端粒维持在一个稳 定的水平。实施例5.染色体外核糖体DNA环的积累不是白念珠菌衰老的主要原因在5\ cererisj'se中，核糖体DNA是位于第12染色体上的一段100-200 个串联重复的大约9. lkb的序列。ERC理论认为，相邻的核糖体DNA重复序列 之间的同源重组导致产生ERC, ERC可以自我复制并且随着细胞分裂不均等的 分配积累在母细胞中，从而导致细胞衰老。ERC的积累既是导致酵母细胞衰老 的原因，同时也是细胞衰老的标志(Sinclair, D. A.和Guarente， L. (1997). Extrachromosomal rDNA circles—a cause of aging in yeast. Cell 57， 1033-1042.)。本发明人在白念珠菌中对该理论进行了验证。取平均寿命分别为22. 9， 13.1， 8.4， 5.4代的白念珠菌细胞群进行检测。采用的染色体外核糖体DNA环(extrachromosomal rDNA circle, ERC)检测实验如下用Zymolyase裂解法抽提基因组DNA， 0. 7%琼脂糖凝胶电泳，1V/cm， 40hr; 转移至Hybond-N+膜，用，标记的白念珠菌18S rDNA的l. 7kb PCR产物(常规方 法制备)进行Southern杂交检测。为了检测rDNA的拷贝数，基因组DNA用EcoRV 和SalI酶切，0.9%琼脂糖凝胶电泳，转膜然后与rDNA探针(常规方法制备)杂 交。将膜上杂交的探针洗掉，重新与l.lkb的CWCT (ACT1)探针(常规方法制 备)杂交，对rDNA杂交信号进行标准化。用Image Quant软件(Amersham Biosciences)对rDNA拷贝数进行量化处理，最年轻细胞的rDNA拷贝数定为55/ 细胞 (Jones, T.等(2004) ， The diploid genome sequence of Candida albicans. Proc Natl Acad Sci U S A 101， 7329-7334)。结果与以往的研究截然不同，不但没有检测到ERC的存在(图6A)，整个基 因组的rDNA水平也未发现有明显变化(图6B和图6C)。联系前人研究结果不难 发现，ERC目前也只在S. cerew'she中被证明是存在的，因此并不是一种普 遍存在的导致细胞衰老的因素。并且，本发明人还发现，单拷贝S/A^基因的敲除可以导致白念珠菌寿命 縮短，说明Si7^对白念珠菌寿命的正调控可能不是通过抑制ERC的产生实现 的。这些结果表明酵母细胞衰老过程中还存在着其它ERC非依赖性的途径，ERC 的积累并不是导致白念珠菌衰老的原因。实施例6.筛选抗衰老药物的方法细胞模型实施例l制备的衰老细胞。测试组添加候选物的实施例1制备的衰老细胞。对照组未添加候选物的实施例1制备的衰老细胞(与测试组衰老细胞处 于同一年龄阶段)。所述的筛选方法包括以下步骤在测试组中，在实施例1制备的衰老细胞的培养物中添加候选物，观察细 胞的平均传代次数。将前述测试组中细胞的平均传代次数与对照组中细胞的平均传代次数进行比较，如果测试组中细胞的平均传代次数在统计学上显著高于对照组(例如测试组的平均传代次数比对照组高出3-5代)，就表明该候选物是抗衰老的潜在药物。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种分离的念珠菌细胞群，其特征在于，所述细胞群具有以下特征(a)所述细胞群中细胞数量为102-1010个；(b)所述细胞群中80％以上细胞为念珠菌的菌丝状细胞；和(c)70％以上的所述念珠菌的菌丝状细胞处于同一年龄阶段。
2. 如权利要求1所述的念珠菌细胞群，其特征在于，所述细胞群中，90% 以上细胞为念珠菌的菌丝状细胞。
3. 如权利要求1所述的念珠菌细胞群，其特征在于，所述细胞群中，80% 以上的所述念珠菌的菌丝状细胞处于同一年龄阶段。
4. 一种制备权利要求1所述的念珠菌细胞群的方法，其特征在于，所述方法包括步骤(a) 在适合菌丝状念珠菌细胞生长的条件下，培养念珠菌细胞群，形成念珠 菌菌丝状细胞群；(b) 在适合酵母状念珠菌细胞生长的条件下，培养步骤(a)的念珠菌的菌丝状 细胞群，从而形成含有念珠菌的菌丝状细胞和酵母状子细胞的混合细胞群；和(c) 从步骤(b)获得的混合细胞群中分离出念珠菌的酵母状子细胞群，并且在 适合菌丝状念珠菌细胞生长的条件下，培养该酵母状子细胞群，从而形成念珠菌的 菌丝状细胞群；(d) 在适合酵母状念珠菌细胞生长的条件下，培养上一步骤所获得的念珠菌 的菌丝状细胞群，从而形成含有念珠菌的菌丝状细胞和酵母状子细胞的混合细胞 群；和(e) 从步骤(d)获得的混合细胞群中分离出念珠菌的菌丝状细胞群。
5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，该方法还包括以下步骤(f) 重复步骤(d)和(e)1-20次，从而获得平均传代次数为2-30代的念珠 菌的菌丝状细胞群。
6. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(b)中培养时间为0.5-5 小时。
7. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的适合菌丝状念珠菌细胞生 长的条件为35-42°C，血清诱导。
8. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的适合酵母状念珠菌细胞生长的条件为25-32°C。
9. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中，通过密度梯度 离心分离出念珠菌的酵母状子细胞群；或者，在步骤(e)中，通过密度梯度离心分离出念珠菌的菌丝状细胞群。
10. 权利要求1所述的细胞群的用途，其特征在于，用于作为研究细胞的生 长、发育、代谢、衰老的模型；或用于筛选调节细胞的生长、发育、代谢、衰老的 物质。
全文摘要
本发明属于生物技术和细胞生物学领域，涉及分离衰老细胞的方法和模型。本发明公开了一种分离的念珠菌细胞群，所述细胞群中大多数的细胞处于同一年龄阶段。本发明还公开了制备所述细胞群的方法以及所述细胞群的用途。本发明首次基于念珠菌在不同生长条件下具有明显不同的两种生长形态的特点，开发出可大规模制备处于同一年龄阶段的细胞群的方法。所述处于同一年龄阶段的细胞群可用于研究细胞生长、发育及其在各个年龄阶段的特征，以及用于研究细胞的衰老，从而为生物体的生长、发育、衰老机制的研究提供了极其有效的途径。
文档编号C12N1/20GK101333503SQ20071004279
公开日2008年12月31日 申请日期2007年6月27日 优先权日2007年6月27日
发明者付晓虹, 周金秋, 孟飞龙 申请人:中国科学院上海生命科学研究院