专利名称：5氟尿嘧啶药物敏感基因芯片检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于临床检测的基因芯片技术领域，具体地说涉及一种5氟尿嘧啶药物敏感基因 芯片检测试剂盒。
背景技术：
5氟尿嘧啶是一种一线抗肿瘤化疗药物。5氟尿嘧啶所涉及的药物敏感基因有DPD (二 氢尿嘧啶脱氢酶基因)，GSTPi (谷胱苷肽转移酶i)， MTHFR (5,10亚甲基四氢叶酸还原酶) 禾口XRCC1 (X线修复交叉互补蛋白1)四个基因。二氢嘧啶脱氢酶是一种主要参与嘧啶分解代谢的酶，是5氟尿嘧啶代谢的限速酶。该基 因第14内含子的第一个碱基由G变为A将会引起mRNA剪切变化，造成第14外显子165 个碱基的缺失，从而使该酶失活，进而影响5氟尿嘧啶这种药物的分解代谢，造成有毒药物 在体内的积累而引起严重的毒副作用。AA基因型癌症患者接受5氟尿嘧啶治疗会产生强烈 的毒副作用甚至致死，AG基因型患者接受5氟尿嘧啶治疗也会引发很强的毒副作用。谷胱甘肽S转移酶Pi基因编码发生变化，编码基因发生改变后105位由异亮氨酸变为缬 氨酸的谷胱甘肽S转移酶Pi酶活降低，而低酶活则降低了化疗药物的失活，从而提高化疗药 物5氟尿嘧啶、草酸铂的疗效，增加GG基因型患者在化疗中的生存，而化疗药物对AG基 因型患者也比AA基因型患者的疗效提高许多。5氟尿嘧啶进入体内后经胸苷激酶催化后与5,10亚甲基四氢叶酸形成共价络合物干扰 DNA的合成于修复从而产生抗癌作用。MTHFR主要催化5,10亚甲基四氢叶酸还原为5甲基四 氢叶酸。因此5,10亚甲基四氢叶酸还原酶的活性将直接影响体内5，10亚甲基四氢叶酸的浓度。 MTHFR基因的677位碱基由C变为T导致该酶222位上由丙氨酸变为缬氨酸,从而影响该酶活 性，使该酶活性降低，体内5,10亚甲基四氢叶酸浓度相应提高，增强5氟尿嘧啶的抗癌作用。 TT纯合子的患者对5氟尿嘧啶敏感。DNA修复蛋白XRCC1: DNA修复蛋白XRCC1与多核苷酸激酶、DNA聚合酶P 、 DNA 连接酶III作用，共同参与DNA修复系统中碱基切除修复。该基因发生突变后399位的精氨 酸变为谷氨酰氨降低了 XRCC1的DNA的修复能力从而造成5氟尿嘧啶和奥沙利铂化疗药物 对GA杂合子和AA纯合子的患者疗效不佳，易在化疗过程中诱发治疗性急性白血病。目前用于检测5氟尿嘧啶单位点突变的方法主要有测序法，这是最直接，最准确的方 法；荧光定量PCR法，和单碱基延伸法。这些方法所需要的设备仪器都价格昂贵，技术复杂， 从经济上考虑不适于用作常规方法加以推广。发明内容为了对5氟尿嘧啶药物敏感的相关基因进行平行检测，对大量样本进行同时分析，并考 虑经济推广的可行性，本发明提供一种5氟尿嘧啶药物敏感基因芯片检测试剂盒，包括抽提 液、杂交缓冲液、洗液、扩增液、Taq酶、基因芯片；其特征在于，所含的扩增液含有扩增4 个含突变位点基因的引物，分别是含IVS14 A/G突变位点的DPD基因，含11el05Val突变位 点的GSTPi基因，含C677T突变位点的MTHFR基因，含Arg399Glu突变位点的XRCC1基因。所述的5氟尿嘧啶药物敏感基因芯片检测试剂盒，扩增液可以包含以下一组序列的引物DPD-1: CCTGGACAAAGCTCCTTTDPD-2: AAGCAACTGGCAGATTCGSTPi-l: TATGGGAAGGACCAGCGSTPi-2: GGTGCAGATGCTCACAMTHFR-1: CCTGAAGCACTTGAAGGAMTHFR-2: TTCACAAAGCGGAAGAXRCC1-1: AAGGAGTGGGTGCTGGAXRCC1-2: TTGCCCAGCACAGGAT 所述的5氟尿嘧啶药物敏感基因芯片检测试剂盒，还可以包括扩增液B，扩增液B中包含如 下序列的ASPE (Allele-Specific Primer Extension,即等位基因特特性引物延伸)引物DPD-G: 5'-GCTGACTTTCCAGACAACGDPD-A: 5，-GCTGACTTTCCAGACAACAGSTPi-A: 5，-TGACCTCCGCTGCAAATACAGSTPi-G: 5，-TGACCTCCGCTGCAAATACGMTHFR-C: 5，-AGGTGTCTGCGGGAGCMTHFR-T: 5'-AGGTGTCTGCGGGAGTXRCC1-A: 5'陽CGGCTGCCCTCCCAXRCC1-G: 5，-CGGCTGCCCTCCCG 所述的5氟尿嘧啶药物敏感基因芯片检测试剂盒，扩增液B中包含的ASPE引物还可以是含 有5'-端检测定位序列的如下序列DPD-tag-G: 5'-CTTTATCAATACATACTAGCTGACTTTCCAGACAACGDPD-tag-A: 5，-TACATTACCAATAATCTTGCTGACTTTCCAGACAACAGSTPi- tag-A: 5'陽TCAACAATCTTTTACAATGACCTCCGCTGCAAATACAGSTPi- tag-G: 5，-AATCCTTTTACATTCATTGACCTCCGCTGCAAATACGMTHFR- tag-C: 5'-CTTTAATCCTTTATCACTTTAGGTGTCTGCGGGAGCMTHFR- tag墨T: 5'-TCAATCAATTACTTACTCAAAGGTGTCTGCGGGAGTXRCC1 - tag-A: 5 ， -TTACTCAAAATCTACACTTTTTCGGCTGCCCTCCCAXRCC1 - tag-G: 5 '-CTACAAACAAACAAACATTATCCGGCTGCCCTCCCG 所述的5氟尿嘧啶药物敏感基因芯片检测试剂盒，扩增液B含有生物素标记的dCTP。 所述的5氟尿嘧啶药物敏感基因芯片检测试剂盒，所含的基因芯片上的探针序列可以是以下 序列 'posl: TGATTGTAGTATGTATTGATAAAGpos2: GATTTGAAGATTATTGGTAATGTApos3: GATTTGATTGTAAAAGATTGTTGApos4: GTAAGTAATGAATGTAAAAGGATTpos5: TGATAAAGTGATAAAGGATTAAAGpos6: GTATTTGAGTAAGTAATTGATTGApos7: TGAAAAAGTGTAGATTTTGAGTAApos8: TTGATAATGTTTGTTTGTTTGTAG该试剂盒通过将5氟尿嘧啶所涉及的药物敏感基因DPD (二氢尿嘧啶脱氢酶基因)，GSTPi (谷 胱苷肽转移酶i)， MTHFR (5，10亚甲基四氢叶酸还原酶)和XRCC1四个基因结合在一起，达 到对相关基因进行平行检测的目的。另外通过将ASPE法与化学发光法相结合，检测单位点突 变，优点在于(1)结果准确，(2)通量大，(3)背景低，(4)操作简便，(5)无需大型 仪器。
图1为5氟尿嘧啶药物敏感基因芯片检测试剂盒应用流程图 图2为试剂盒中所含5氟尿喷啶药物敏感基因检测芯片示意图具体实施方式
下面结合附图和举例说明本发明目的的实施。实施例子1. 样本处理用口腔粘膜脱落细胞作为样本来源，进行基因组DNA抽提。抽提使用博大泰克的细胞 基因组抽提试剂盒。2. 芯片制备，将文献中已有标记定位探针在超平玻片上点样，探针序列如下posl- TGATTGTAGTATGTATTGATAAAG pos2: GATTTGAAGATTATTGGTAATGTA pos3: GATTTGATTGTAAAAGATTGTTGA pos4: GTAAGTAATGAATGTAAAAGGATT pos5: TGATAAAGTGATAAAGGATTAAAG pos6: GTATTTGAGTAAGTAATTGATTGA pos7: TGAAAAAGTGTAGATTTTGAGTAA pos8: TTGATAATGTTTGTTTGTTTGTAG3. 引物设计(1)设计以下引物序列组A，用以扩增含突变位点的与5氟尿嘧瞎所涉及的药物敏感相 关的基因片断，包括有DPD(二氢尿嘧啶脱氢酶基因)，GSTPi (谷胱苷肽转移酶i)， MTHFR (5,10亚甲基四氢叶酸还原酶)和XRCC1四个基因。 DPD-h CCTGGACAAAGCTCCTTT DPD-2: AAGCAACTGGCAGATTC GSTPi-l: TATGGGAAGGACCAGC GSTPi-2: GGTGCAGATGCTCACA MTHFR-1: CCTGAAGCACTTGAAGGA MTHFR-2: TTCACAAAGCGGAAGA XRCC1-1: AAGGAGTGGGTGCTGGAXRCC1-2: TTGCCCAGCACAGGAT (2)设计以下ASPE引物序列组B,用以扩增含突变位点的序列，同时引进用于基因检测定 位的标记序列，以便与芯片上相应的定位探针杂交，从而获得检测结果。DPD-tag-G: 5，-CTTTATCAATACATACTAGCTGACTTTCCAGACAACG DPD隱tag-A: 5，-TACATTACCAATAATCTTGCTGACTTTCCAGACAACA GSTPi- tag-A: 5，-TCAACAATCTTTTACAATGACCTCCGCTGCAAATACA GSTPi- tag-G: 5,-AATCCTTTTACATTCATTGACCTCCGCTGCAAATACG MTHFR- tag墨C: 5'-CTTTAATCCTTTATCACTTTAGGTGTCTGCGGGAGC MTHFR- tag-T: 5，-TCAATCAATTACTTACTCAAAGGTGTCTGCGGGAGT XRCC1- tag-A: 5'-TTACTCAAAATCTACACTTTTTCGGCTGCCCTCCCA XRCC1- tag-G: 5，-CTACAAACAAACAAACATTATCCGGCTGCCCTCCCG4. PCR扩增待测片断并引入生物素标记。用引物序列组A扩增含待测突变位点的序列，用ASPE 引物序列组B扩增含突变位点的序列，扩增时加入含生物素标记的dCTP，以此引入对样本产 物检测所需的生物素标记。5. 杂交检测 .—按以下步骤对得到的相应样本产物进行杂交检测(1) 将扩增得到的标记产物与杂交液(5XSSC,0.2%SDS)以1:6的比例混合，加入反应. 区域，50ul。(2) 42'C保温保湿反应60分钟。(3) 用洗液(2XSSC,0. 1%SDS)洗涤4-6次，每次2分钟，振动。(4) 加入HRP标记的亲和素反应液，50ul。(5) 在42。C反应15-20min。(6) 用洗液(2XSSC,0. 1%SDS)洗涤4-6次，每次2分钟，晃动。(7) 加检测液20ul/孔，使检测液均匀分布于反应区域。(8) CCD检测，视发光信号强度曝光30-60秒。6. 结果判定依据不同指标的OitOff值，参考标准品梯度曲线，判定样本的阴阳性。 与此同时，用常规方法对测试的样本进行常规检测。结果表明，用本发明的试剂盒得出 的测试结果与常规方法相同。序列表DPD-1: CCTGGACAAAGCTCCTTT DPD-2: AAGCAACTGGCAGATTC GSTPi陽h TATGGGAAGGACCAGC GSTPi-2: GGTGCAGATGCTCACA MTHFR-1: CCTGAAGCACTTGAAGGA MTHFR-2: TTCACAAAGCGGAAGA XRCC1 -1: AAGGAGTGGGTGCTGGA XRCC1-2: TTQCCCAGCACAGGATDPD-G: 5' -GCTGACTTTCCAGACAACG DPD-A: 5' -GCTGACTTTCCAGACAACA GSTPi-A: 5' -TGACCTCCGCTGCAAATACA GSTPi-G: 5'陽TGACCTCCGCTGCAAATACG MTHFR-C: 5' -AGGTGTCTGCGGGAGC MTHFR-T: 5' -AGGTGTCTGCGGGAGT XRCC 1-A: 5' -CGGCTGCCCTCCCA XRCC1-G: 5' -CGGCTGCCCTCCCGDPD-tag-G: 5' -CTTTATCAATACATACTAGCTGACTTTCCAGACAACG DPD-tag-A: 5' -TACATTACCAATAATCTTGCTGACTTTCCAGACAACA GSTPi隱tag-A: 5' -TCAACAATCTTTTACAATGACCTCCGCTGCAAATACA GSTPi-tag-G: 5' -AATCCTTTTACATTCATTGACCTCCGCTGCAAATACG MTHFR-tag-C: 5' -CTTTAATCCTTTATCACTTTAGGTGTCTGCGGGAGC MTHFR-tag-T: 5' -TCAATCAATTACTTACTCAAAGGTGTCTGCGGGAGT XRCC 1-tag-A: 5' -TTACTCAAAATCTACACTTTTTCGGCTGCCCTCCCA XRCCl-tag-G: 5' -CTACAAACAAACAAACATTATCCGGCTGCCCTCCCGposl: TGATTGTAGTATGTATTGATAAAG pos2: GATTTGAAGATTATTGGTAATGTA pos3: GATTTGATTGTAAAAGATTGTTGA pos4: GTAAGTAATGAATGTAAAAGGATT pos5: TGATAAAGTGATAAAGGATTAAAG pos6: GTATTTGAGTAAGTAATTGATTGApos7: TGAAAAAGTGTAGATTTTGAGTAA pos8: TTGATAATGTTTGTTTGTTTGTAG
权利要求
1.一种5氟尿嘧啶药物敏感基因检测试剂盒，包括抽提液、杂交缓冲液、洗液、扩增液、Taq酶、基因芯片；其特征在于，所含的扩增液含有扩增4个含突变位点的基因，分别是含IVS14 A/G突变位点的DPD基因，含Ile105Val突变位点的GSTPi基因，含C677T突变位点的MTHFR基因，含Arg399Glu突变位点的XRCC1基因。
2. 根据权利要求1所述的5氟尿嘧啶药物敏感基因检测试剂盒，其特征在于，所述的扩增液 可以包含以下一组序列的引物DPD-h CCTGGACAAAGCTCCTTT DPD-2: AAGCAACTGGCAGATTC GSTPi-l: TATGGGAAGGACCAGC GSTPi-2: GGTGCAGATGCTCACA MTHFR-1: CCTGAAGCACTTGAAGGA MTHFR-2: TTCACAAAGCGGAAGA XRCC1 -1: AAGGAGTGGGTGCTGGA XRCC1-2: TTGCCCAGCACAGGAT 。
3. 根据权利要求1或2所述的5氟尿嘧啶药物敏感基因检测试剂盒，其特征在于，还可以包 括扩增液B，扩增液B中包含如下序列的ASPE (Allele-Specific Primer Extension,即等位 基因特特性引物延伸)引物-DPD-G: 5' - GCTGACTTTCCAGACAACG DPD-A: 5' -GCTGACTTTCCAGACAACA GSTPi-A: 5' -TGACCTCCGCTGCAAATACA GSTPi-G: 5' -TGACCTCCGCTGCAAATACG MTHFR-C: 5' -AGGTGTCTGCGGGAGC MTHFR-T: 5' -AGGTGTCTGCGGGAGT XRCC 1-A: 5' -CGGCTGCCCTCCCA XRCCl陽G: 5'垂CGGCTGCCCTCCCG 。
4. 根据权利要求3所述的5氟尿嘧啶药物敏感基因检测试剂盒，其特征在于，所述的扩增液 B中包含的ASPE引物还可以是含有5'-端检测定位序列的如下序列DPD-tag-G: 5' -CTTTATCAATACATACTAGCTGACTTTCCAGACAACG DPD-tag-A: 5' -TACATTACCAATAATCTTGCTGACTTTCCAGACAACA GSTPi-tag-A: 5' -TCAACAATCTTTTACAATGACCTCCGCTGCAAATACA GSTPi-tag-G: 5' -AATCCTTTTACATTCATTGACCTCCGCTGCAAATACG MTHFR-tag-C: 5' -CTTTAATCCTTTATCACTTTAGGTGTCTGCGGGAGC MTHFR-tag-T: 5' -TCAATCAATTACTTACTCAAAGGTGTCTGCGGGAGT XRCC 1 - tag-A 5' -TTACTCAAAATCTACACTTTTTCGGCTGCCCTCCCA XRCC 1-tag-G: 5' -CTACAAACAAACAAACATTATCCGGCTGCCCTCCCG 。
5. 根据权利要求3或4所述的5氟尿嘧啶药物敏感基因检测试剂盒，其特征在于，所述的扩 增液B含有生物素标记的dCTP。
6. 根据权利要求4所述的5氟尿嘧啶药物敏感基因检测试剂盒，其特征在于，所含的基因芯片上的探针序列可以是以下一组序列-posl: TGATTGTAGTATGTATTGATAAAG pos2: GATTTGAAGATTATTGGTAATGTA pos3: GATTTGATTGTAAAAGATTGTTGA pos4: GTAAGTAATGAATGTAAAAGGATT pos5: TGATAAAGTGATAAAGGATTAAAG pos6: GTATTTGAGTAAGTAATTGATTGA pos7: TGAAAAAGTGTAGATTTTGAGTAA pos8: TTGATAATGTTTGTTTGTTTGTAG
全文摘要
本发明提供一种5氟尿嘧啶药物敏感基因芯片检测试剂盒，可用于平行经济地检测与5氟尿嘧啶药物敏感的相关基因。该试剂盒包括抽提液、杂交缓冲液、洗液、扩增液、Taq酶、基因芯片，所述的扩增液含有扩增4个含突变位点基因的引物，分别是含IVS14 A/G突变位点的DPD基因，含Ile105Val突变位点的GSTPi基因，含C677T突变位点的MTHFR基因，含Arg399Glu突变位点的XRCC1基因。5氟尿嘧啶是一种一线抗肿瘤化疗药物，本发明可用于检测对5氟尿嘧啶药物敏感的上述4个基因突变情况。
文档编号C12Q1/68GK101333558SQ20071004317
公开日2008年12月31日 申请日期2007年6月29日 优先权日2007年6月29日
发明者杜喜玲, 汪宁梅, 穆海东 申请人:上海裕隆生物科技有限公司