专利名称：嘌呤类药物敏感基因检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于临床检测的基因芯片技术领域，具体地说涉及一种嘌呤类药物敏感基因检测 试剂盒。
背景技术：
目前研究结果表明，治疗急性淋巴细胞白血病的巯嘌呤代谢药物——6-巯基嘌呤和6-巯代 鸟嘌呤均是无内在生物活性的药物,必须通过体内一系列代谢后才能发挥药效。而人体的巯基 嘌呤甲基转移酶(TPMT)的代谢酶在此类药物代谢和抗白血病作用中起关键作用。TPMT上含 有的突变位点与人体对嘌呤类药物的敏感性有关。目前用于检测5氟尿嘧啶单位点突变的方法主要有测序法，这是最直接，最准确的方 法，；荧光定量PCR法，和单碱基延伸法。这些方法所需要的设备仪器都价格昂贵，技术复杂， 从经济上考虑不适于用作常规方法加以推广。发明内容为了对嘌呤类药物敏感的相关基因进行平行检测，对大量样本进行同时分析，并考虑经 济推广的可行性，本发明选择TPMT的三个突变位点作为检测对象，提供一种嘌呤类药物敏 感基因芯片检测试剂盒，包括抽提液、杂交缓冲液、洗液、扩增液、Taq酶、基因芯片；其 特征在于，所含的扩增液含有扩增巯基嘌呤甲基转移酶(TPMT)基因上3个突变位点序列的引 物，3个突变位点分别是238， 460和719。所述的嘌呤类药物敏感基因检测试剂盒，其特征在于，扩增液可以包含以下一组序列的引物238-1: TGAAACCCTATGAACCTG 238-2: TCCAGGAATTTCGGTGT 460-1: GTTGAAGTACCAGCATG 460-2: CCTGGATTGATGGCAA 719-1: GGTTGATGCTTTTGAAGAA 719-2: CAATCTGCAAGACACATAG所述的嘌呤类药物敏感基因芯片检测试剂盒，其特征在于，还可以包括扩增液B，扩增 液B中包含如下一组序列的ASPE (Allee-Specific Primer Extension,即等位基因特特性引物延伸)引物238-G5'-ATTTTATGCAGGTTTG238-C5，-ATTTTATGCAGGTTTC460-G5'-GGATAGAGGAG460-A5'-GGGATAGAGGAA719-A5'-TCTTTTTGAAAAGTTATA719—G5'-TCTTTTTGAAAAGTTATG所述的嘌呤类药物敏感基因芯片检测试剂盒，其特征在于，扩增液B中包含的ASPE弓物还可以是含有5'-端检测定位序列的如下序列238-G: 5' -CAATTCATTTCATTCACAATCAATTTTATGCAGGTTTG238-C: 5' -CAATATACCAATATCATCATTTATTTTATGCAGGTTTC460-G: 5' -TCAATCATCTTTATACTTCACATGGGATAGAGGAG460-A: 5， -CTTTTTCAATCACTTTCAATATTTGGGATAGAGGAA719-A: 5' -CAATTTACTCATATACATCACTTTCTTTTTGAAAAGTTATA719-G: 5'國CTACTAATTCATTAACATTACTATCTTTTTGAAAAGTTATG所述的嘌呤类药物敏感基因芯片检测试剂盒，其特征在于，扩增液B含有生物素标记的dCTP。所述的嘌呤类药物敏感基因芯片检测试剂盒，其特征在于，所含的基因芯片上的探针序列可以是以下一组序列POS-1: ATTGATTGTGAATGAAATGAATTG POS-2: GTAAATGATGATATTGGTATATTG POS-3: ATTGTGAAGTATAAAGATGATTGA POS-4: ATGAATTGAAAGTGATTGAAAAAG POS-5: AAAGTGATGTATATGAGTAAATTG POS-6: GTAGTAATGTTAATGAATTAGTAG该试剂盒通过将嘌呤类所涉及的药物敏感基因巯基嘌呤甲基转移酶(TPMT)基因上的3个 突变位点结合在一起，达到对相关基因进行平行检测的目的。另外通过将ASPE法与化学发光 法相结合，检测单位点突变，优点在于(1)结果准确，(2)通量大，(3)背景低，(4)操 作简便，(5)无需大型仪器。
图1为检测试剂盒应用流程2为试剂盒中所含嘌呤类药物敏感基因检测芯片示意图具体实施方式
下面结合附图和举例说明本发明目的的实施。实施例子1. 样本处理用口腔粘膜脱落细胞作为样本来源，进行基因组DNA抽提。抽提使用博大泰克的细胞基 因组抽提试剂盒。2. 芯片制备，将文献中已有标记定位探针在超平玻片上点样，探针序列如下POS-1: ATTGATTGTGAATGAAATGAATTG POS-2: GTAAATGATGATATTGGTATATTG POS-3: ATTGTGAAGTATAAAGATGATTGA POS-4: ATGAATTGAAAGTGATTGAAAAAG POS-5: AAAGTGATGTATATGAGTAAATTGPOS-6: GTAGTAATGTTAATGAATTAGTAG3.引物设计(1) 设计以下引物序列组A，用以扩增TMPT基因上，与嘌呤类药物敏感相关的3个基因片 断，分别含突变位点238， 460和719。238-1: TGAAACCCTATGAACCTG 238-2: TCCAGGAATTTCGGTGT 460-1: GTTGAAGTACCAGCATG 460-2: CCTGGATTGATGGCAA 719-1: GGTTGATGCTTTTGAAGAA 719-2: CAATCTGCAAGACACATAG(2) 设计以下ASPE引物序列组B，用以扩增含突变位点的序列，同时引进用于基因检测定 位的标记序列，以便与芯片上相应的定位探针杂交，从而获得检测结果。238-G 238-C 460-G 460-A 719-A 719-G-CAATTCATTTCATTCACAATCAATTTTATGCAGGTTTG-CAATATACCAATATCATCATTTATTTTATGCAGGTTTC-TCAATCATCTTTATACTTCACATGGGATAGAGGAG-CTTTTTCAATCACTTTCAATATTTGGGATAGAGGAA陽CAATTTACTCATATACATCACTTTCTTTTTGAAAAGTTATA-CTACTAATTCATTAACATTACTATCTTTTTGAAAAGTTATG4. PCR扩增待测片断并引入生物素标记。用引物序列组A扩增含待测突变位点的序列，用 ASPE引物序列组B扩增含突变位点的序列，扩增时加入含生物素标记的dCTP，同此引入对样 本产物检测所需的生物素标记。5. 杂交检测按以下步骤对得到的相应样本产物进行杂交检测(1) 将扩增得到的标记产物与杂交液(5XSSC，0.2%SDS)以1:6的比例混合，加入反应 区域，50ul。(2) 42'C保温保湿反应60分钟。(3) 用洗液(2XSSC，0.1%SDS)洗涤4-6次，每次2分钟，振动。(4) 加入HRP标记的亲和素反应液，50ul。(5) 在42。C反应15-20min。(6) 用洗液(2XSSC，0.1%SDS)洗涤4-6次，每次2分钟，晃动。(7) 加检测液20ul/孔，使检测液均匀分布于反应区域。(8) CCD检测，视发光信号强度曝光30-60秒。6. 结果判定依据不同指标的CutOff值，参考标准品梯度曲线，判定样本的阴阳性。 与此同时，用常规方法对测试的样本进行常规检测。结果表明，用本发明的试剂盒得出 的测试结果与常规方法相同。序列表238-1: TGAAACCCTATGAACCTG238-2: TCCAGGAATTTCGGTGT460-1: GTTGAAGTACCAGCATG460-2: CCTGGATTGATGGCAA719-1: GGTTGATGCTTTTGAAGAA719-2: CAATCTGCAAGACACATAG238-G:5，-ATTTTATGCAGGTTTG238-C:5'-ATTTTATGCAGGTTTC460-G:5'-GGATAGAGGAG460-A:5'-GGGATAGAGGAA719-A:5'-TCTTTTTGAAAAGTTATA719-G:5，-TCTTTTTGAAAAGTTATG238-G: 5' -CAATTCATTTCATTCACAATCAATTTTATGCAGGTTTG238-C: 5' -CAATATACCAATATCATCATTTATTTTATGCAGGTTTC460-G: 5' -TCAATCATCTTTATACTTCACATGGGATAGAGGAG460-A: 5' -CTTTTTCAATCACTTTCAATATTTGGGATAGAGGAA719-A: 5' -CAATTTACTCATATACATCACTTTCTTTTTGAAAAGTTATA719-G: 5' -CTACTAATTCATTAACATTACTATCTTTTTGAAAAGTTATGPOS-1: ATTGATTGTGAATGAAATGAATTG POS-2: GTAAATGATGATATTGGTATATTG POS-3: ATTGTGAAGTATAAAGATGATTGA POS-4: ATGAATTGAAAGTGATTGAAAAAG POS-5: AAAGTGATGTATATGAGTAAATTG POS-6: GTAGTAATGTTAATGAATTAGTAG
权利要求
1.一种嘌呤类药物敏感基因芯片检测试剂盒，包括抽提液、杂交缓冲液、洗液、扩增液、Taq酶、基因芯片；其特征在于，所含的扩增液含有扩增巯基嘌呤甲基转移酶(TPMT)基因上3个突变位点序列的引物，3个突变位点分别是238，460和719。
2. 根据权利要求1所述的嘌呤类药物敏感基因检测试剂盒，其特征在于，所述的扩增液可以 包含以下一组序列的引物238-1: TGAAACCCTATGAACCTG 238-2: TCCAGGAATTTCGGTGT 460-1: GTTGAAGTACCAGCATG 460-2: CCTGGATTGATGGCAA 719-1: GGTTGATGCTTTTGAAGAA 719-2: CAATCTGCAAGACACATAG
3. 根据权利要求1或2所述的嘌呤类药物敏感基因芯片检测试剂盒，其特征在于，还可以包 括扩增液B，扩增液B可以包含如下一组序列的ASPE (Allele-Specific Primer Extension, 即等位基因特特性引物延伸)弓l物238-G: 5' -ATTTTATGCAGGTTTG 238-C: 5' -ATTTTATGCAGGTTTC 460-G: 5' -GGATAGAGGAG 460-A: 5' -GGGATAGAGGAA 719-A: 5' -TCTTTTTGAAAAGTTATA 719-G: 5' -TCTTTTTGAAAAGTTATG
4. 根据权利要求3所述的嘌呤类药物敏感基因芯片检测试剂盒，其特征在于，所述的扩增液 B中包含的ASPE引物还可以是含有5'-端检测定位序列的如下序列238-G: 5' -CAATTCATTTCATTCACAATCAATTTTATGCAGGTTTG 238-C: 5' -CAATATACCAATATCATCATTTATTTTATGCAGGTTTC 460-G: 5'陽TCAATCATCTTTATACTTCACATGGGATAGAGGAG 460-A: 5' -CTTTTTCAATCACTTTCAATATTTGGGATAGAGGAA 719-A: 5' -CAATTTACTCATATACATCACTTTCTTTTTGAAAAGTTATA 719-G: 5' -CTACTAATTCATTAACATTACTATCTTTTTGAAAAGTTATG
5. 根据权利要求3或4所述的嘌呤类药物敏感基因芯片检测试剂盒，其特征在于，所述的扩 增液B含有生物素标记的dCTP。
6. 根据权利要求4所述的嘌呤类药物敏感基因芯片检测试剂盒，其特征在于，所含的基因芯 片上的探针序列可以是以下一组序列POS-1: ATTGATTGTGAATGAAATGAATTG POS-2: GTAAATGATGATATTGGTATATTG POS-3: ATTGTGAAGTATAAAGATGATTGA POS-4: ATGAATTGAAAGTGATTGAAAAAG POS-5: AAAGTGATGTATATGAGTAAATTG POS-6: GTAGTAATGTTAATGAATTAGTAG 。
全文摘要
本发明提供一种嘌呤类药物敏感基因芯片检测试剂盒，属于临床检测的基因芯片技术领域，可用于平行经济地检测与嘌呤类药物敏感的相关基因。该试剂盒包括抽提液、杂交缓冲液、洗液、扩增液、Taq酶、基因芯片，所述的扩增液含有扩增巯基嘌呤甲基转移酶(TPMT)上3个突变位点基因的引物，3个突变位点分别是238，460和719。嘌呤类药物用于治疗急性淋巴细胞白血病，本发明可用于检测对嘌呤类药物敏感的TMPT基因上述3个位点突变情况。
文档编号C12Q1/68GK101333560SQ20071004322
公开日2008年12月31日 申请日期2007年6月29日 优先权日2007年6月29日
发明者杜喜玲, 汪宁梅, 穆海东 申请人:上海裕隆生物科技有限公司