专利名称：心脑血管疾病易感基因芯片检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于临床检测的基因芯片技术领域，具体地说涉及一种心脑血管疾病易感基因芯 片检测试剂盒。
背景技术：
与心脑血管疾病相关的易感基因比较多，通过査阅文献，挑选出13个相关性较强的基因， 分别是Enos基因，ADD1基因，AP0B-2515基因，AT1R基因，APOB-3500基因，APOB-4181 基因，eNOS-894基因，FgB-148基因，APOE基因，GNB3基因，AGT基因，FVII基因， MTHFR基因。用以对心脑血管疾病易感基因进行相关研究。目前用于对心脑血管疾病易感基因研究的平行性没有达到13个基因以上的，本试剂盒的 易感基因概括全面。另外对心脑血管疾病易感基因相关基因点突变的检测方法主要有测序 法，这是最直接，最准确的方法;荧光定量PCR法，和单碱基延伸法。这些方法所需要的设 备仪器都价格昂贵，技术复杂，从经济上考虑不适于用作常规方法加以推广。发明内容为了对心脑血管疾病易感的相关基因进行平行检测，对大量样本进行同时分析，并考虑 经济推广的可行性，本发明提供一种心脑血管疾病易感基因芯片检测试剂盒，包括抽提液、 杂交缓冲液、洗液、扩增液、Taq酶、基因芯片；其特征在于，所含的扩增液含有扩增13个 含突变位点的基因，分别是Enos基因，ADD1基因，AP0B-2515基因，AT1R基因，APOB-3500 基因，APOB-4181基因，eNOS-894基因，FgB-148基因，APOE基因，GNB3基因，AGT 基因，FVII基因，MTHFR基因。所述的心脑血管疾病易感基因芯片检测试剂盒，扩增液可以包含以下一组序列的引物- :Enos-l: CCAGATGCCCAGCTAG Enos-2: GACATTAGGGTATCCCTT ADD1-1: CACAGGTTACTCCTTTGCTA ADD1陽2: GGTTTCACGTGATCGTGT APOB-2515-l: AACCAAGGCCACAGTTGC APOB-2515-2: CTCTACCAATGCTTTCATA AT1R陽1: CATGTTCGAAACCTGTCCA AT1R-2: TCGAGTTTCTGACATTGTTC APOB-3500-1: AATGTCAGCTCTTGTTCAGG APOB-3500-2: CCAGCTTTAGGAAATCC APOB-4181 -1: GGCCATTAGGCAAATTGAT APOB-4181-2: CCTCCCTTATGAACATAGT eNOS-894-l: ATTCAGCACGGCTGGA eNOS-894-2: TGCAGGCCCTTCTTGA FgB-148-l: CGGAGCTTGTGTAGTTTCFgB-148-2: TGGAAGCTCCAAGAAACC APOE-h CGAGACCATGAAGGAGTT APOE-2: CTGCCCATCTCCTCCA GNB3-1: GATCCCTGACCCACTTG GNB3-2: TTACCCACACGCTCAGAC AGT-1: GTTGCTGCTGAGAAGATT AGT-2: CCATCTCCAAGGCCTG FVII-1: TCATGGTCCTCAACGT FVII-2: TTTCTCTCCACAGGCC MTHFR-1: CCTGAAGCACTTGAAGG MTHFR-2: GGGTGGAGGGAGCTTA所述的心脑血管疾病易感基因芯片检测试剂盒，还可以包括扩增液B，扩增液B可以包 含如下一组序列的ASPE (Allele-Specific Primer Extension,即等位基因特特性引物延伸)引物Enos-丁 agctcttccctggcT Enos-G: agctcttccctggcC ADD1-G: aagcttccgaggaaG ADD1陽T: aagcttccgaggaaT APOB-2515-C: aaattccgagagacC APOB-2515-T: aattccgagagacT AT1R-A: ttcactaccaaatgagcA AT1R-C: ttcactaccaaatgagcC APOB-3500-G: atggaaaaatgaagtccG atggaaaaatgaagtccA ggtacgagttactcaaG ggtacgagttactcaaA eNOS-894國G: aggccccagatgaG eNOS陽894-T: aggccccagatgaT FgB-148-C: gtatgacaagtaaataagC FgB-148-T: gtatgacaagtaaataagT APOE-陽Pl: acatggaggacgtgT APOE-P2: gacatggaggacgtgC APOE- P3: gatgacctgcagaagC APOE-P4: gacctgcagaagT GNB3-C: ctgcggcatcacgtcC GNB3-T: ctgcggcatcacgtcT AGT-T: ctggctgctccctgaT AGT-C: ctggctgctccctgaC FVII-G: tgccacccactaccGAPOB-3500陽A APOB-4181-G APOB-4181-AFVII-A: tgccacccactaccA MTHFR-C: GGTGTCTGCGGGAGC MTHFR-T: GGTGTCTGCGGGAGT所述的心脑血管疾病易感基因芯片检测试剂盒，所述的扩增液B中包含的ASPE引物还 可以是含有5'-端检测定位序列的如下序列Enos-tagT: CTTTAATCTCAATCAATACAAATCagctc加cctggcTEnos-tagC: CTTTATCAATACATACTACAATCAagctcttccctggcCADDl-tagG: TACACTTTATCAAATCTTACAATaagcttccgaggaaGADD 1 -tagT: TAC ATTACC AATAATCTTC AAATCaagcttccgaggaaTAPOB-2515陽tagC: CAATTCAAATCACAATAATCAATCaaattccgagagacCAPOB-2515-tagT: TCAACAATCTTTTACAATCAAATCaattccgagagacTAT 1 R-tagA: CAATTCATTTACCAATTTACCAATttcactaccaaatgagcAATlR-tagC: AATCCTTTTACATTCATTACTTACttcactaccaaatgagcCAPOB-3500-tagG: TAATCTTCTATATCAACATCTTACatggaaaaatgaagtccGAPOB-3500-tagA: ATCATACATACATACAAATCTACAatggaaaaatgaagtccAAPOB-4181 -tagG: TACAAATCATCAATCACTTTAATggtacgagttactcaaGAPOB-4181 -tagA: CAATAAACTATACTTCTTCACTAAggtacgagttactcaaAeNOS-894國tagG: CTACTATACATCTTACTATACTTTaggccccagatgaGeNOS-894-tagT: ATACTTCATTCATTCATCAATTCAcaggccccagatgaTFgB-148-tagC: AATCAATCTTCATTCAAATCATCAgtatgacaagtaaataagCFgB-148-tagT: AATCCTTTCTTTAATCTCAAATCAgtatgacaagtaaataagTAPOE-tag-Pl: TTACTCAAAATCTACACTTTTTCAacatggaggacgtgTAPOE-tag-P2: CTACAAACAAACAAACATTATCAAgacatggaggacgtgCAPOE-tag-P3: TTCACTTTTCAATCAACTTTAATCgatgacctgcagaagCAPOE-tag-P4: TCAATTACTTCACTTTAATCCTTTgacctgcagaagTGNB3-tagC: CAATTCATTTCATTCACAATCAATctgcggcatcacgtcCGNB3-tagT: CAATATACCAATATCATCATTTACctgcggcatcacgtcTAGT-tagT: TCAATCATCTTTATACTTCACAATctggctgctccctgaTAGT-tagC: CTTTTTCAATCACTTTCAATTCATctggctgctccctgaCFVII-tagG: CAATTTACTCATATACATCACTTTtgccacccactaccGFVII-tagA: CTACTAATTCATTAACATTACTACtgccacccactaccAMTHFR-tagC: CTTTAATCCTTTATCACTTTATCAGGTGTCTGCGGGAGCMTHFR-tagT: TC AATC AATTACTTACTC AA ATACGGTGTCTGCGGGAGT所述的心脑血管疾病易感基因芯片检测试剂盒，扩增液B含有生物素标记的dCTP。所述的心脑血管疾病易感基因芯片检测试剂盒，所含的基因芯片上的探针序列可以是以下序列POS-1: GATTTGTATTGATTGAGATTAAAG POS陽2: TGATTGTAGTATGTATTGATAAAG POS陽3: GATTGTAAGATTTGATAAAGTGTAPOS-4: GATTTGAAGATTATTGGTAATGTA POS-5: GATTGATTATTGTGATTTGAATTG POS-6: GATTTGATTGTAAAAGATTGTTGA POS-7: ATTGGTAAATTGGTAAATGAATTG POS-8: GTAAGTAATGAATGTAAAAGGATT POS-9: GTAAGATGTTGATATAGAAGATTA POS-10: TGTAGATTTGTATGTATGTATGAT POS-11: GATTAAAGTGATTGATGATTTGTA POS墨12: TTAGTGAAGAAGTATAGTTTATTG POS-13: AAAGTATAGTAAGATGTATAGTAG POS-14: TGAATTGATGAATGAATGAAGTAT POS-15: TGATGATTTGAATGAAGATTGATT POS-16: TGATAAAGTGATAAAGGATTAAAG POS-17: GTATTTGAGTAAGTAATTGATTGA POS-18: TGATTTGAGATTAAAGAAAGGATT POS-19: TGAAAAAGTGTAGATTTTGAGTAA POS-20: TTGATAATGTTTGTTTGTTTGTAG POS-21: GATTAAAGTTGATTGAAAAGTGAA POS-22: AAAGGATTAAAGTGAAGTAATTGA POS-23: ATTGATTGTGAATGAAATGAATTG POS-24: GTAAATGATGATATTGGTATATTG POS-25: ATTGTGAAGTATAAAGATGATTGA POS-26: ATGAATTGAAAGTGATTGAAAAAG POS-27: AAAGTGATGTATATGAGTAAATTG POS-28: GTAGTAATGTTAATGAATTAGTAG该试剂盒通过将与心脑血管疾病相关的13个易感基因的检测结合在一起，达到对相关基 因进行平行检测的目的。另外通过将ASPE法与化学发光法相结合，检测单位点突变，优点在 于(1)结果准确，(2)通量大，(3)背景低，(4)操作简便，(5)无需大型仪器。
图1为芯片检测试剂盒应用流程2为试剂盒中所含心脑血管疾病易感基因检测芯片示意图具体实施方式
下面结合附图和举例说明本发明目的的实施。实施例子1. 样本处理用口腔粘膜脱落细胞作为样本来源，进行基因组DNA抽提。抽提使用博大泰克的细胞 基因组抽提试剂盒。2. 芯片制备，将文献中已有标记定位探针在超平玻片上点样，探针序列如下POS-l: GATTTGTATTGATTGAGATTAAAG POS-2: TGATTGTAGTATGTATTGATAAAG POS-3: GATTGTAAGATTTGATAAAGTGTA POS-4: GATTTGAAGATTATTGGTAATGTA POS-5: GATTGATTATTGTGATTTGAATTG POS-6: GATTTGATTGTAAAAGATTGTTGA POS陽7: ATTGGTAAATTGGTAAATGAATTG POS-8: GTAAGTAATGAATGTAAAAGGATT POS-9: GTAAGATGTTGATATAGAAGATTAPOS-10:TGTAGATTTGTATGTATGTATGATPOS-ll:GATTAAAGTGATTGATGATTTGTAPOS-12:TTAGTGAAGAAGTATAGTTTATTGPOS-13:AAAGTATAGTAAGATGTATAGTAGPOS-14:TGAATTGATGAATGAATGAAGTATPOS-15:TGATGATTTGAATGAAGATTGATTPOS-16:TGATAAAGTGATAAAGGATTAAAGPOS-17:GTATTTGAGTAAGTAATTGATTGAPOS陽18:TGATTTGAGATTAAAGAAAGGATTPOS-19:TGAAAAAGTGTAGATTTTGAGTAAPOS陽20:TTGATAATGTTTGTTTGTTTGTAGPOS-21:GATTAAAGTTGATTGAAAAGTGAAPOS-22:AAAGGATTAAAGTGAAGTAATTGAPOS-23:ATTGATTGTGAATGAAATGAATTGPOS陽24:GTAAATGATGATATTGGTATATTGPOS-25:ATTGTGAAGTATAAAGATGATTGAPOS-26:ATGAATTGAAAGTGATTGAAAAAGPOS-27:AAAGTGATGTATATGAGTAAATTGPOS-28:GTAGTAATGTTAATGAATTAGTAG3.引物设计(1)设计以下引物序列组A,用以扩增与心脑血管疾病易感性相关的，含突变位点的13个基因片断Enos-l: CCAGATGCCCAGCTAG Enos-2: GACATTAGGGTATCCCTT ADD 1 -1: CACAGGTTACTCCTTTGCTA ADD1陽2: GGTTTCACGTGATCGTGTAPOB-2515-1: AACCAAGGCCACAGTTGC APOB-2515-2: CTCTACCAATGCTTTCATA AT1R-1: CATGTTCGAAACCTGTCCA AT1R-2: TCGAGTTTCTGACATTGTTC APOB-3500-1: AATGTCAGCTCTTGTTCAGG APOB-3500-2: CCAGCTTTAGGAAATCC APOB-4181-1: GGCCATTAGGCAAATTGAT APOB-4181-2: CCTCCCTTATGAACATAGT eNOS-894-l: ATTCAGCACGGCTGGA eNOS-894-2: TGCAGGCCCTTCTTGA FgB-148-1: CGGAGCTTGTGTAGTTTC FgB-148-2: TGGAAGCTCCAAGAAACC APOE-l: CGAGACCATGAAGGAGTT APOE-2: CTGCCCATCTCCTCCA GNB3-1: GATCCCTGACCCACTTG GNB3-2: TTACCCACACGCTCAGAC AGT-1: GTTGCTGCTGAGAAGATT AGT-2: CCATCTCCAAGGCCTG FVII-1: TCATGGTCCTCAACGT FVII-2: TTTCTCTCCACAGGCC MTHFR-1: CCTGAAGCACTTGAAGG MTHFR陽2: GGGTGGAGGGAGCTTA (2)设计以下ASPE引物序列组B，用以扩增含突变位点的序列，同时引进用于基因检测定 位的标记序列，以便与芯片上相应的定位探针杂交，从而获得检测结果。 Enos誦tagT: CTTTAATCTCAATCAATACAAATCagctcttccctggcT Enos-tagC: CTTTATCAATACATACTACAATCAagctcttccctggcC ADD 1 -tagG: TACACTTTATCAAATCTTACAATaagcttccgaggaaG ADDl-tagT: TACATTACCAATAATCTTCAAATCaagcttccgaggaaT APOB-2515-tagC: CAATTCAAATCACAATAATCAATCaaattccgagagacC APOB-2515-tagT: TCAACAATCTTTTACAATCAAATCaattccgagagacT ATlR-tagA: CAATTCATTTACCAATTTACCAATttcactaccaaatgagcA ATlR-tagC: AATCCTTTTACATTCATTACTTACttcactaccaaatgagcC APOB-3500國tagG: TAATCTTCTATATCAACATCTTACatggaaaaatgaagtccG APOB-3500-tagA: ATCATACATACATACAAATCTACAatggaaaaatgaagtccA APOB陽4181 -tagG: TACAAATCATCAATCACTTTAATggtacgagttactcaaG APOB-4181隱tagA: CAATAAACTATACTTCTTCACTAAggtacgagttactcaaA eNOS-894-tagG: CTACTATACATCTTACTATACTTTaggccccagatgaG eNOS-894-tagT: ATACTTCATTCATTCATCAATTCAcaggccccagatgaT FgB-148-tagC: AATCAATCTTCATTCAAATCATCAgtatgacaagtaaataagCFgB-148-tagT: AATCCTTTCTTTAATCTCAAATCAgtatgacaagtaaataagT APOE-tag-Pl: TTACTCAAAATCTACACTTTTTCAacatggaggacgtgT APOE-tag-P2: CTACAAACAAACAAACATTATCAAgacatggaggacgtgC APOE-tag-P3: TTCACTTTTCAATCAACTTTAATCgatgacctgcagaagC APOE-tag-P4: TCAATTACTTCACTTTAATCCTTTgacctgcagaagT GNB3-tagC: CAATTCATTTCATTCACAATCAATctgcggcatcacgtcC GNB3-tagT: CAATATACCAATATCATCATTTACctgcggcatcacgtcT AGT-tagT: TCAATCATCTTTATACTTCACAATctggctgctccctgaT AGT-tagC: CTTTTTCAATCACTTTCAATTCATctggctgctccctgaC FVII-tagG: CAATTTACTCATATACATCACTTTtgccacccactaccG FVII-tagA: CTACTAATTCATTAACATTACTACtgccacccactaccA MTHFR國tagC: CTTTAATCCTTTATCACTTTATCAGGTGTCTGCGGGAGC MTHFR-tagT: TCAATCAATTACTTACTCAAATACGGTGTCTGCGGGAGT4. PCR扩增待测片断并引入生物素标记。用引物序列组A扩增含待测突变位点的序列，用ASPE 引物序列组B扩增含突变位点的序列，扩增时加入含生物素标记的dCTP，以此引入对样本产 物检测所需的生物素标记。5. 杂交检测按以下步骤对得到的相应样本产物进行杂交检测(1) 将扩增得到的标记产物与杂交液(5XSSC，0.2%SDS)以1:6的比例混合，加入反应 区域，50ul。(2) 42'C保温保湿反应60分钟。(3) 用洗液(2XSSC，0. 1%SDS)洗涤4-6次，每次2分钟，振动。(4) 加入HRP标记的亲和素反应液，50ul。(5) 在42。C反应15-20min。(6) 用洗液(2XSSC，0. 1%SDS)洗涤4-6次，每次2分钟，晃动。(7) 加检测液20ul/孔，使检测液均匀分布于反应区域。(8) CCD检测，视发光信号强度曝光30-60秒。6. 结果判定依据不同指标的CutOff值，参考标准品梯度曲线，判定样本的阴阳性。 与此同时，用常规方法对测试的样本进行常规检测。结果表明，用本发明的试剂盒得出 的测试结果与常规方法相同。序列表Enos-l: CCAGATGCCCAGCTAG Enos-2: GACATTAGGGTATCCCTT ADD 1 -1: CACAGGTTACTCCTTTGCTA ADD 1-2: GGTTTCACGTGATCGTGT APOB-2515-1: AACCAAGGCCACAGTTGC APOB-2515-2: CTCTACCAATGCTTTCATA AT1R-1: CATGTTCGAAACCTGTCCA AT1R-2: TCGAGTTTCTGACATTGTTC APOB-3500-1: AATGTCAGCTCTTGTTCAGG APOB-3500-2: CCAGCTTTAGGAAATCC APOB-4181-1: GGCCATTAGGCAAATTGAT APOB-4181-2: CCTCCCTTATGAACATAGT eNOS-894-1: ATTCAGCACGGCTGGA eNOS-894-2: TGCAGGCCCTTCTTGA FgB-148-1: CGGAGCTTGTGTAGTTTC FgB-148-2: TGGAAGCTCCAAGAAACC APOE-1: CGAGACCATGAAGGAGTT APOE-2: CTGCCCATCTCCTCCA GNB3-1: GATCCCTGACCCACTTG GNB3-2: TTACCCACACGCTCAGAC AGT-1: GTTGCTGCTGAGAAGATT AGT-2: CCATCTCCAAGGCCTG FVII-1: TCATGGTCCTCAACGT FVII-2: TTTCTCTCCACAGGCC MTHFR-1: CCTGAAGCACTTGAAGG MTHFR-2: GGGTGGAGGGAGCTTAEnos-T: agctcttccctggcT Enos陽G: agctcttccctggcC ADD1-G: aagettccgaggaaG ADD 1 -T: aagcttccgaggaaT APOB-2515-C: aaattccgagagacC APOB-2515-T: aattccgagagacT AT1R-A: ttcactaccaaatgagcA AT1R-C: ttcactaccaaatgagcC APOB-3500-G: atggaaaaatgaagtccG APOB-3500-A: atggaaaaatgaagtccA APOB-4181-G: ggtacgagttactcaaG APOB-4181 -A: ggtacgagttactcaaA eNOS-894-G: aggccccagatgaG eNOS-894-T: aggccccagatgaT FgB-148-C: gtatgacaagtaaataagC FgB-148-T: gtatgacaagtaaataagT APOE—PI: acatggaggacgtgT APOE-P2: gacatggaggacgtgC APOE- P3: gatgacctgcagaagC APOE-P4: gacctgcagaagT GNB3 -C: ctgcggcatcacgtcC GNB3-T: ctgcggcatcacgtcT AGT隱T: ctggctgctccctgaT AGT-C: ctggctgctccctgaC FVII-G: tgccacccactaccG FVII-A: tgccacccactaccA MTHFR-C: GGTGTCTGCGGGAGC MTHFR-T: GGTGTCTGCGGGAGTEnos-tagT: CTTTA ATCTC AATC AATAC AAATCagctcttccctggcT Enos-tagC: CTTTATC AATAC ATACTACAATCAagctcttccctggcC ADD 1 -tagG: TAC ACTTTATC AAATCTTAC AATaagcttccgaggaaG ADD 1 -tagT: TAC ATTACC A ATAATCTTC AAATCaagcttccgaggaaT APOB-2515-tagC C AATTCAAATCACAATAATC AATCaaattccgagagacC APOB-2515-tagT: TCAAC AATCTTTTAC AATCAAATCaattccgagagacT AT 1 R-tag A: C AATTC ATTTACC AATTTACC AATttcactaccaaatgagc A ATlRtagC: AATCCTTTTACATTCATTACTTACttcactaccaaatgagcC APOB-3 500-tagG: TAATCTTCTATATC AAC ATCTTACatggaaaaatgaagtccG APOB3500-tagA: ATCATACATACATACAAATCTAC AatggaaaaatgaagtccA APOB-4181 -tagG: TAC A AATC ATC AATC ACTTTA ATggtacgagttactcaaG APOB-4181 -tagA: CAATAAACTATACTTCTTCACTAAggtacgagttactcaaA eNOS-894-tagG: CTACTATAC ATCTTACTATACTTTaggccccagatgaG eNOS-894-tagT: ATACTTC ATTC ATTC ATCAATTCAcaggccccagatgaT FgB-148-tagC: AATC A ATCTTC ATTC AA ATC ATC AgtatgacaagtaaataagC FgB-148-tagT: AATCCTTTCTTTAATCTCAAATC AgtatgacaagtaaataagT APOE-tag-Pl: TTACTCAAAATCTACACTTTTTCAacatggaggacgtgT APOEtag-P2: CTACAAAC AAAC AAAC ATTATC AAgacatggaggacgtgC APOE-tag-P3: TTCACTTTTCAATCAACTTTAATCgatgacctgcagaagC APOE-tag-P4: TC AATTACTTC ACTTTAATCCTTTgacctgcagaagT GNB3-tagC: CAATTCATTTCATTCAC AATCAATctgcggcatcacgtcC GNB3-tagT: CAATATACCAATATCATCATTTACctgcggcateacgtcT AGT-tagT: TC AATC ATCTTTATACTTC AC A ATctggctgctccctgaT AGT-tagC: CTTTTTC AATC ACTTTC A ATTC ATctggctgctccctgaC FVII-tagG: CAATTTACTCATATACATCACTTTtgccacccactaccG FVII-tagA: CTACTAATTC ATTAAC ATTACTACtgccacccactacc A MTHFR-tagC: CTTTAATCCTTTATCACTTTATCAGGTGTCTGCGGGAGC MTHFR-tagT: TC AATC AATTACTTACTC A AATACGGTGTCTGCGGGAGTPOS-1: GATTTGTATTGATTGAGATTAAAG POS-2: TGATTGTAGTATGTATTGATAAAG POS-3: GATTGTAAGATTTGATAAAGTGTA POS-4: GATTTGAAGATTATTGGTAATGTA POS-5: GATTGATTATTGTGATTTGAATTG POS-6: GATTTGATTGTAAAAGATTGTTGA POS-7: ATTGGTAAATTGGTAAATGAATTG POS-8: GTAAGTAATGAATGTAAAAGGATT POS-9: GTAAGATGTTGATATAGAAGATTA POS-10: TGTAGATTTGTATGTATGTATGAT POS-11: GATTAAAGTGATTGATGATTTGTA POS-12: TTAGTGAAGAAGTATAGTTTATTG POS-13: AAAGTATAGTAAGATGTATAGTAG POS-14: TGAATTGATGAATGAATGAAGTAT POS-15: TGATGATTTGAATGAAGATTGATT POS-16: TGATAAAGTGATAAAGGATTAAAG POS-17: GTATTTGAGTAAGTAATTGATTGA POS-18: TGATTTGAGATTAAAGAAAGGATT POS-19: TGAAAAAGTGTAGATTTTGAGTAA POS-20: TTGATAATGTTTGTTTGTTTGTAG POS-21: GATTAAAGTTGATTGAAAAGTGAA POS-22: AAAGGATTAAAGTGAAGTAATTGA POS-23: ATTGATTGTGAATGAAATGAATTG POS-24: GTAAATGATGATATTGGTATATTG POS-25: ATTGTGAAGTATAAAGATGATTGA POS-26: ATGAATTGAAAGTGATTGAAAAAG POS-27: AAAGTGATGTATATGAGTAAATTG POS-28: GTAGTAATGTTAATGAATTAGTAG
权利要求
1.一种心脑血管疾病易感基因芯片检测试剂盒，包括抽提液、杂交缓冲液、洗液、扩增液、Taq酶、基因芯片；其特征在于，所含的扩增液含有扩增13个含突变位点的基因，分别是Enos基因，ADD1基因，APOB-2515基因，AT1R基因，APOB-3500基因，APOB-4181基因，eNOS-894基因，FgB-148基因，APOE基因，GNB3基因，AGT基因，FVII基因，MTHFR基因。
2. 根据权利要求1所述的心脑血管疾病易感基因芯片检测试剂盒，其特征在于，所述的扩 增液可以包含以下一组序列的引物Enos-l: CCAGATGCCCAGCTAG Enos-2: GACATTAGGGTATCCCTT ADD 1 -1: CACAGGTTACTCCTTTGCTA ADD 1-2: GGTTTCACGTGATCGTGT APOB-2515-1: AACCAAGGCCACAGTTGC APOB-2515-2: CTCTACCAATGCTTTCATA AT1R-1: CATGTTCGAAACCTGTCCA AT1R-2: TCGAGTTTCTGACATTGTTC APOB-3500-1: AATGTCAGCTCTTGTTCAGG APOB-3500-2: CCAGCTTTAGGAAATCC APOB-4181-1: GGCCATTAGGCAAATTGAT APOB-4181-2: CCTCCCTTATGAACATAGT eNOS-894-1: ATTCAGCACGGCTGGA eNOS-894-2: TGCAGGCCCTTCTTGA FgB-148-1: CGGAGCTTGTGTAGTTTC FgB墨148-2: TGGAAGCTCCAAGAAACC APOE-1: CGAGACCATGAAGGAGTT APOE-2: CTGCCCATCTCCTCCA GNB3-1: GATCCCTGACCCACTTG GNB3陽2: TTACCCACACGCTCAGAC AGT-1: GTTGCTGCTGAGAAGATT AGT-2: CCATCTCCAAGGCCTG FVII -h TCATGGTCCTCAACGT FVII-2: TTTCTCTCCACAGGCC MTHFR陽l: CCTGAAGCACTTGAAGG MTHFR-2: GGGTGGAGGGAGCTTA
3. 根据权利要求1或2所述的心脑血管疾病易感基因芯片检测试剂盒，其特征在于，还可 以包括扩增液B，扩增液B可以包含如下一组序列的ASPE (Allele-Specific Primer Extension, 即等位基因特特性引物延伸)引物Enos-T: agctcttccctggcT Enos-C: agctcttccctggcC ADD 1 -G: aagcttccgaggaaGADD1-T: aagcttccgaggaaTAPOB-2515-C: aaattccgagagacCAPOB-2515-T: aattccgagagacTAT 1R-A: ttcactaccaaatgagcAAT1R-C: ttcactaccaaatgagcCAPOB-3500-G: atggaaaaatgaagtccGAPOB-3500-A: atggaaaaatgaagtccAAPOB-4181-G: ggtacgagttactcaaGAPOB隱4181 - A: ggtacgagttactcaaAeNOS-894-G: aggccccagatgaGeNOS-894-T: aggccccagatgaTFgB-148-C: gtatgacaagtaaataagCFgB-148陽T: gtatgacaagtaaataagTAPOE—Ph acatggaggacgtgTAPOE-P2: gacatggaggacgtgCAPOE- P3: gatgacctgcagaagCAPOE-P4: gacctgcagaagTGNB3 -C: ctgcggcatcacgtcCGNB3-T: ctgcggcatcacgtcTAGT-T: ctggctgctccctgaTAGT-C: ctggctgctccctgaCFVII-G: tgccacccactaccGFVII-A: tgccacccactaccAMTHFR-C: GGTGTCTGCGGGAGCMTHFR陽T: GGTGTCTGCGGGAGT
4.根据权利要求3所述的心脑血管疾病易感基因芯片检测试剂盒，其特征在于，所述的扩 增液B中包含的ASPE引物还可以是含有5'-端检测定位序列的如下序列Enos陽tagT: CTTTAATCTCAATCAATACAAATCagctc加cctggcTEnos-tagC: CTTTATCAATACATACTACAATCAagctcttccctggcCADD 1 -tagG: TACACTTTATCAAATCTTACAATaagcttccgaggaaGADDl-tagT: TACATTACCAATAATCTTCAAATCaagcttccgaggaaTAPOB-2515-tagC: CAATTCAAATCACAATAATCAATCaaattccgagagacCAPOB-2515-tagT: TCAACAATCTTTTACAATCAAATCaattccgagagacTATlR-tagA: CAATTCATTTACCAATTTACCAATttcactaccaaatgagcAATlR-tagC: AATCCTTTTACATTCATTACTTACttcactaccaaatgagcCAPOB-3500-tagG: TAATCTTCTATATCAACATCTTACatggaaaaatgaagtccGAPOB-3500-tagA: ATCATACATACATACAAATCTACAatggaaaaatgaagtccAAPOB-4181 -tagG: TACAAATCATCAATCACTTTAATggtacgagttactcaaGAPOB-4181 -tagA: CAATAAACTATACTTCTTCACTAAggtacgagttactcaaAeNOS-894-tagG: CTACTATACATCTTACTATACTTTaggccccagatgaG eNOS-894-tagT: ATACTTCATTCATTCATCAATTCAcaggccccagatgaT FgB-148-tagC: AATCAATCTTCATTCAAATCATCAgtatgacaagtaaataagC FgB-148-tagT: AATCCTTTCTTTAATCTCAAATCAgtatgacaagtaaataagT APOE-tag-Pl: TTACTCAAAATCTACACTTTTTCAacatggaggacgtgT APOE-tag-P2: CTACAAACAAACAAACATTATCAAgacatggaggacgtgC APOE-tag-P3: TTCACTTTTCAATCAACTTTAATCgatgacctgcagaagC APOE-tag-P4: TCAATTACTTCACTTTAATCCTTTgacctgcagaagT GNB3-tagC: CAATTC ATTTC ATTCAC AATC AATctgcggcatcacgtcC GNB3-tagT: C AATATACC AATATCATCATTTACctgcggcatcacgtcT AGT-tagT: TCAATCATCTTTATACTTCACAATctggctgctecctgaT AGT-tagC: CTTTTTCAATCACTTTCAATTCATctggctgctccctgaC FVII-tagG: CAATTTACTCATATACATCACTTTtgccacccactaccG FVII-tagA: CTACTAATTCATTAACATTACTACtgccacccactaccA MTHFR-tagC: CTTTAATCCTTTATCACTTTATCAGGTGTCTGCGGGAGC MTHFR陽tagT: TC A ATC AATTACTTACTC AAATACGGTGTCTGCGGG AGT
5. 根据权利要求3或4所述的心脑血管疾病易感基因芯片检测试剂盒，其特征在于，所述 的扩增液B含有生物素标记的dCTP。
6. 根据权利要求4所述的心脑血管疾病易感基因芯片检测试剂盒，其特征在于，所含的基 因芯片上的探针序列可以是以下序列POS-1: GATTTGTATTGATTGAGATTAAAG POS-2: TGATTGTAGTATGTATTGATAAAG POS-3: GATTGTAAGATTTGATAAAGTGTA POS-4: GATTTGAAGATTATTGGTAATGTA POS-5: GATTGATTATTGTGATTTGAATTG POS-6: GATTTGATTGTAAAAGATTGTTGA POS-7: ATTGGTAAATTGGTAAATGAATTG POS-8: GTAAGTAATGAATGTAAAAGGATT POS-9: GTAAGATGTTGATATAGAAGATTA POS-10: TGTAGATTTGTATGTATGTATGAT POS-11: GATTAAAGTGATTGATGATTTGTA POS-12: TTAGTGAAGAAGTATAGTTTATTG POS-13: AAAGTATAGTAAGATGTATAGTAG POS-14: TGAATTGATGAATGAATGAAGTAT POS-15: TGATGATTTGAATGAAGATTGATT POS-16: TGATAAAGTGATAAAGGATTAAAG POS-17: GTATTTGAGTAAGTAATTGATTGA POS-18: TGATTTGAGATTAAAGAAAGGATT POS-19: TGAAAAAGTGTAGATTTTGAGTAAPOS-20TTGATAATGTTTGTTTGTTTGTAGPOS-21GATTAAAGTTGATTGAAAAGTGAAPOS-22AAAGGATTAAAGTGAAGTAATTGAPOS-23ATTGATTGTGAATGAAATGAATTGPOS-24GTAAATGATGATATTGGTATATTGPOS-25ATTGTGAAGTATAAAGATGATTGAPOS-26ATGAATTGAAAGTGATTGAAAAAGPOS-27AAAGTGATGTATATGAGTAAATTGPOS-28GTAGTAATGTTAATGAATTAGTAG 。
全文摘要
本发明提供一种心脑血管疾病易感基因芯片检测试剂盒，属于临床检测的基因芯片技术领域，可用于平行经济地检测与心脑血管疾病易感性相关的13个基因。该试剂盒包括抽提液、杂交缓冲液、洗液、扩增液、Taq酶、基因芯片，所述的扩增液含有扩增含突变位点的13个基因的引物，13个基因分别是Enos基因，ADD1基因，APOB-2515基因，AT1R基因，APOB-3500基因，APOB-4181基因，eNOS-894基因，FgB-148基因，APOE基因，GNB3基因，AGT基因，FVII基因，MTHFR基因。与心脑血管疾病易感性相关的基因很多，本发明可用于平行检测相关的13个基因。
文档编号C12Q1/68GK101333561SQ20071004322
公开日2008年12月31日 申请日期2007年6月29日 优先权日2007年6月29日
发明者杜喜玲, 汪宁梅, 穆海东 申请人:上海裕隆生物科技有限公司