专利名称：一种分离纯化β-葡萄糖苷酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种分离纯化P-葡萄糖苷酶的新方法，具体涉及一种以微晶纤维素作为亲和柱层析介质，利用酶与底物的特异性吸附，高效纯化e-葡萄糖苷酶的方法。技术背景P-葡萄糖苷酶(EC3.2. 1.21)，也称P-D-葡萄糖苷酶，它能够水解结合于末端非还原性的e-D-葡萄糖苷键，同时释放出葡萄糖和相应的配基。葡萄糖 苷酶存在于自然界许多植物、昆虫、酵母、霉菌及细菌体内，它参与生物体的糖 代谢，对维持生物体正常生理功能起着重要作用。在食品工业中，常用e-葡萄 糖苷酶来改善饮料、果酒及茶叶等的风味，其机理是将某些风味前体物质水解为 具有浓郁天然风味的香气物质。在医药工业中，则利用e-葡萄糖苷酶的生物转 化功能，将某些广泛存在的天然产物转化为在自然界稀有甚至不存在的药物。如 有研究利用特定的人参皂苷e -葡萄糖苷酶，能够将在人参中含量丰富的人参皂苷Rbl转化为具有抗肿瘤活性的Rg3、 Rh2或CK等。因此，0 -葡萄糖苷酶是一类极 其重要的酶。然而，目前该类酶的分离纯化过程仍局限一般的蛋白纯化过程，拘 泥于多种传统柱色谱的组合应用，如离子交换柱、疏水柱和分子筛柱等，纯化步 骤复杂且成本高，这已成为制约有关科学研究及其工业应用的瓶颈问题。因此， 建立一种高效经济的纯化方法是3 -葡萄糖苷酶研究及应用过程中一个迫切需要 解决的重要问题。微晶纤维素为天然纤维素经稀酸水解并经一系列处理后得到的极限聚合度 的产物，它是一种无臭、无味、极细微的白色短棒状或无定形结晶粉末，广泛应 用于医药、食品、化妆品、化工、农业等各生产领域。微晶纤维素可作为健康食 品的食用纤维，具有加强肠道蠕动，预防动脉硬化和吸附肠内毒素等功能；微晶 纤维素在冷冻食品中充当物理性阻碍物，防止晶粒聚集在一起成为大的晶体；将 微晶纤维素加在酸奶酪中可以一定程度避免乳清分离的现象，保证制品的稳定 性。在医药领域内，微晶纤维素常常被用作药品生产中的赋型剂和缓释剂。然而，
至今为止，未见有利用微晶纤维素来分离纯化e -葡萄糖苷酶的报道。 发明内容本发明的目的是提供一种新的分离纯化p -葡萄糖苷酶的方法，该方法高效 而经济。本方法以微晶纤维素作为e -葡萄糖苷酶的亲和柱层析介质，在低温和微酸 性条件下，将e-葡萄糖苷酶上样并特异性吸附于微晶纤维素柱，然后通过增加 Naci浓度的方法将该酶洗脱，实现高效并经济的分离纯化e -葡萄糖苷酶。微晶纤维素为葡萄糖的聚合体，作为的天然酶解底物，它在低温和微酸性条 件下能特异性的吸附p -葡萄糖苷酶，而这种吸附在高离子浓度条件下可以被解 析。本发明微晶纤维素的特性，采用微晶纤维素作为e-葡萄糖苷酶的亲和柱层 析介质，用于该类酶的高效纯化，具有成本低和纯化效率高的优点。本发明方法包括下述步骤1、 制备微晶纤维素层析柱将微晶纤维素(市购商品化产品)经过表面活性洗涤剂处理，再用蒸馏水彻底冲洗干净，除去其本身带有的杂质，然后装柱，用不含NaCl的微酸性缓冲液充 分平衡；2、 分离纯化P-葡萄糖苷酶用于分离纯化的粗酶液先在平衡缓冲液中透析， 然后上样于已平衡好的微晶纤维素柱，用平衡缓冲液洗脱后，逐步增加缓冲液中 的NaCl浓度，至目标P-葡萄糖苷酶被洗脱下来；3、 产品纯度鉴定按常规方法收集具P -葡萄糖苷酶活性的部分，在SDS-PAGE 蛋白胶上鉴定蛋白纯度。本发明方法在低温(0-l(TC)下进行，优选温度为4-6'C。 本发明方法使用过的微晶纤维素柱， 一般直接采用高浓度(0.8-1.0 M)的 NaCl溶液清洗后可重复使用；或用表面活性洗涤剂处理并用蒸馏水冲洗及高浓度 (0.8-1.0 M)的NaCl溶液清洗柱子后，重复使用。本发明方法中，所采用的微晶纤维素在低温和微酸性条件下，能特异性的吸 附0-葡萄糖苷酶，同时可能非特异性的吸附其它杂蛋白。所述的非特异性吸附 的杂蛋白在较低的NaCl浓度下能很容易的被洗脱，而特异性吸附的e -葡萄糖苷 酶则需要较高浓度的NaCl溶液条件下才能被洗脱。因此，微晶纤维素作为亲和
层析介质，在分离纯化3 -葡萄糖苷酶时具有分离过程简单和纯化效率高的优点。 与现有技术的柱层析方法相比，本方法分离纯化P -葡萄糖苷酶纯化效率高， 成本低廉。突出体现在由于酶和底物的吸附具有选择性高的特点，所以纯化效 率比一般的蛋白分离层析方法要高得多；同时，所采用的微晶纤维素是一种极经 济易得的工业化材料，因此操作成本十分低廉。
图i是实施例2的e-葡萄糖苷酶I的纯化结果，其中，1:菌体破壁，2: 90%饱和(NH》2S(V沉淀， 3: Q-S印harose FF洗脱Peak I ， 4:微晶纤维素柱0.2M NaCl洗脱， 5:蛋白分子量标准。 图2是实施例3的e-葡萄糖苷酶II的纯化结果，其中，1:菌体破壁，2: 90%饱和(NH丄S04沉淀，3: Q-S印harose FF洗脱Peak III,4:微晶纤维素柱0.2M NaCl洗脱，5:蛋白分子量标准。 图3是实施例3中采用现有方法纯化e -葡萄糖苷酶II的结果，其中，1:菌体破壁，2: 90%饱和(NH》2S04沉淀，3: Q-S印harose FF洗脱Peak III，4: phenyl-sepharose CL-4B洗脱，5: CHT ceramic hydroxyapatite洗脱，6: sephacryl S-300 HR洗脱，7:蛋白分子量标准品。
具体实施例方式
实施例l制备微晶纤维素亲和层析柱称取15-20g微晶纤维素粉末(上海恒信化学试剂有限公司)，悬浮于200ral 含表面活性洗涤剂的水溶液中，置于磁力搅拌器上搅拌1-2 h，静止片刻，弃去 悬浮杂质，用蒸馏水充分冲洗干净，然后悬浮于200 ml醋酸缓冲液(pH 4.0， 0.01M)，置于4-6'C环境中装柱，以相同的缓冲液彻底平衡柱子，待用。实施例2分离纯化e-葡萄糖苷酶I分离纯化过程在4-6'c环境下进行。采用含有多种e -葡萄糖苷酶的拟青霉菌sp.229 (中国专利申请号:200410018000.0，
发明者钦 严, 冯美卿, 伟 周, 珮 周, 李幸慰 申请人:复旦大学