专利名称：TGF-β诱导的调节T细胞及其形成方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学领技术领域，具体涉及一种治疗自身免疫性疾病(如系统性红斑狼 疮，类风湿性关节炎等等)有关的调节T细胞，以及该调节T细胞的形成方法和应用。
背景技术：
目前国内外对系统性红斑狼疮，类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的治疗依赖于激素类 或非激素类的免疫抑制剂。这些药物的治疗虽然能够控制部分病人的症状，但是，远期疗效 有限。更重要的是，长期使用这些药物，常常会产生严重的并发症，或者继发严重的感染， 甚至会诱导肿瘤的发生。另外花费巨大的医疗资源也是一个缺陷。
二十世纪九十年代中后期，免疫学家发现正常动物和人体内存在着少量的CD4+CD25+细 胞(大约占正常人体CD4+细胞的百分之二)。如果缺乏这种细胞，动物和人体会产生各种自身 免疫性疾病的症状。试验证明这群细胞来源于胸腺，因为切除胸腺的动物缺乏CM+CD25+细 胞，并且发展自身免疫性疾病。如果注射CD4+CD25+细胞到胸腺切除的小鼠，能够预防小鼠 发生自身免疫性疾病。这群细胞现在被称为"自然的CD4+调节T细胞"。缺乏自然的CD4+CD25+细胞与自身免疫性疾病的关系首先在自身免疫性试验动物模型中 得到证实。如BWF1和SNF1小鼠，均在出生22周左右发生自发性的狼疮样疾病，现在的研 究证明发病的小鼠体内(外周血和脾脏)CD4+CD25+细胞的数量是下降的。相反，静脉注射 CD4+CD25+细胞到这个小鼠，的确能够延缓狼疮疾病的发生和发展。
上述CD4+调节T细胞的性质变化与人的SLE发生和发展也有密切的关系。最初的几个研 究小组首先发现活动期的SLE病人的CD4+CD25+细胞数量有明显降低。最近发现，Foxp3基 因和蛋白可特异性地表达在CD4+调节T细胞中，并且与CD4+调节T细胞的发育和功能有密 切关系。这样，鉴定Foxp3+而不是CD25+细胞的数量，就能够精确的反映自然的CD4+调节T 细胞的水平。实际上，我们最近发现活动期SLE病人的CD4+CD25+Foxp3+细胞的数量是下降 的，并且这种下降与疾病的活动程度成反比。另一些人最近也报导了 SLE病人的CD4+CD25+ 细胞的抑制功能是下降的。既然自然的CD4+调节T细胞明显地影响着SLE疾病的发生和发展，人们试图考虑用 CD4+调节T细胞来治疗SLE。由于CD4+CD25+Fo邓3+阳性细胞的数量非常有限，研究人员考
虑用扩增的方法，来提高CD4+CD25+Foxp3+细胞的数量。虽然几个研究小组证明了扩增的 CD4+调节T细胞仍然能够维持免疫调节功能和表型，并且在预防和治疗急性移植物抗宿主反 应中起了一定程度的作用，但是，另外一个欧洲的研究小组发现反复扩增的自然CD4+调节T 细胞会失去免疫抑制效果。另外，扩增的CD4+调节T细胞容易发生激活诱导的淋巴细胞死 亡，这也限制了这个细胞的治疗价值。最近，仅仅一个研究小组(美国加州大学旧金山分校，BLUESTONE教授)使用了扩增的 CD4+CD25+细胞来治疗动物(BWF1)小鼠的LUPUS疾病。无论如何，这个效果是非常有限的。 并且，他们使用的细胞是扩增的正常的动物CD4+CD25+细胞而不是狼疮疾病来源的 CD4+CD25+细胞，因为狼疮和SLE疾病的CD4+CD25+细胞可能发生了内在的缺陷。因此，是否 能够扩增这些细胞来治疗SLE和另外一些自身免疫性疾病仍然不清楚。可见，这个发现对 SLE病人的调节T细胞治疗仍然是有限的。 发明内容本发明的目的在于提出一种针对自身免疫性疾病(如系统性红斑狼疮，类风湿性关节炎 等)的TGF一P诱导的调节T细胞及其形成方法和应用。本发明提出的针对自身免疫性疾病的TGF一p诱导的调节T细胞，是由TGF—(3和IL—2两个 细胞因子相结合，通过体外诱导自身免疫性疾病患者的CD4+细胞而获得，具体记为 004++0025+ ( 口3+调节T细胞，这里FoxP3为FoxP3基因或蛋白。上述CD4+CD25+Foxp3+调节T细胞的形成方法如下(1) 从自身免疫性疾病(如SLE)患者静脉中抽取外周血，用FIC0LL技术分离淋巴细胞； 再用单克隆抗体(例如抗单核细胞抗体，B细胞抗体，CD8+细胞抗体和记忆细胞抗体等)和阴 性技术分离NAIVE一CD4+细胞；(2) 对分离出的NAIVEj:D4+细胞，用抗CD3/CD28抗体包裹的微粒珠子进行刺激；然后加 入3-10ng/ml的TGF—(3和15-30unit/ml的IL—2，培养5-6天；3、然后对CD4+细胞中的CD25阳性细胞用MACS微粒珠子进行分离。具体步骤为用 PE—CD25抗体去结合CD4+细胞，再用抗PE的MACS微粒珠子进行阳性分离，即得到所需的 CD4+CD25+Foxp3+调节T细胞。由上述方法得到的CD4+CD25+Foxp3+调节T细胞，可作为一种药物制剂，用于治疗自身 免疫性(如SLE)疾病患者的疾病。具体方法如下
将上述方法诱导获得的CD4+CD25+Foxp3+调节T细胞注射给患者，注射量为5-102°个上 述调节T细胞。为了获得更好的治疗效果，可以先给活动期(如SLE)患者进行常规药物(如用常规的免疫 抑制剂等)治疗一个疗程，然后注射上述CD4+CD25+Foxp3+调节T细胞。由于上述调节T细胞在动物体内存活周期大约为一个月，因此，本发明可对患者一月 注射一次。另外，本发明也可将上述调节T细胞与常规的免疫抑制剂和激素等结合起来使用。在这 个过程中，可降低激素和免疫抑制剂的使用剂量。 本发明具有如下优点1、 CD4+CD25+F0XP3+调节T细胞具有明显的抑制T细胞的增生、细胞因子的产生和细胞 毒活性；2、 CD4+CD25+F0XP3+调节T细胞具有明显的抑制B细胞产生抗体的能力。3、 CD4+CD25+F0XP3+调节T细胞具有明显的体内预防狼疮病发生，控制狼疮病发展的能力。3、 CD4+CD25+F0XP3+调节T细胞具有体内长期的保护作用能力。4、 CD4+CD25+F0XP3+调节T细胞本身没有明显的毒副作用。5、 CD4+CD25+F0XP3+调节T细胞可以代替免疫抑制剂和激素或者减少免疫抑制剂和激素 的使用剂量，结合使用，改善SLE等自身免疫性疾病患者的治疗并且确定毒副作用。
图1.TGF-p能够诱导NalveCD4+CD25阴性细胞发展成为CD4+CD25+Foxp3+细胞图 示。来自正常C57BL/6小鼠的Na'iVe CD4+CD25阴性细胞被抗CD3/CD28抗体贴附的微粒珠 子(按每10个细胞一个微粒珠子浓度)进行刺激5天
。IL-2(20u/ml)或/和TGF-p(2ng/ml)被加到刺激的细胞中。CD25， CD4和细胞内Foxp3的表达水平通过流式细胞仪进 行检测。图示是5个分开的试验之代表。图2.TGF-p能够诱导Na'iVe CD4+CD25阴性细胞发展成为表达Foxp3信息RNA的 CD4+CD25+细胞。来自正常C57BL/6小鼠的Na'iVe CD4+CD25阴性细胞被抗CD3/CD28抗 体贴附的微粒珠子(按每10个细胞一个微粒珠子浓度)进行刺激5天。IL-2(20u/ml)或/和TGF-(3(2ng/ml)被加到剌激的细胞中。培养5天后的CD4+，被进一步通过流式细胞仪进行细胞分
选，然后分离出CD25+和CD25阴性亚型，常规制备RNA和反转录成为cNDA，通过RT-PCR扩增Foxp3和看家基因HPRT。图示是5个分开的试验之代表。图3.IL-2在TGF-p诱导Foxp3+细胞中起关键的作用图示。NaiVe CD4+CD25阴性细胞从 IL-2基因敲除的小鼠中制备，然后用图l相似的方法进行刺激。在有些培养孔中加入外源性 重组的白介素IL-7(100ng/ml)，或IL-15(100ng/ml)，或IL-2(50u/ml)。流式细胞仪技术决定 Foxp3+的表达。这个结果被重复了三次，并且具有相似的结果。注假如缺乏IL-2， TGF-f3 诱导Foxp3表达的能力消失了 。为排除缺乏IL-2不能够诱导Foxp3的表达是因为缺乏CD25 的表达，研究者也加了IL-7，或IL-15， 二者均能够诱导CD25的表达，但是仍然不能够使 TGF-P诱导Foxp3+。只有在加外源性IL-2，才能够恢复Foxp3的表达。图4. IL-2和TGF-(3在诱导和扩增Foxp3+中起协同作用图示。来自正常C57BL/6小鼠 NaWeCD4+CD25阴性细胞被萤光染料CFSE进行标记，然后，用图l相似的方法进行刺 激。不同的是，在有些培养孔中，中和IL-2的抗IL-2抗体(2ug/ml)被加入了。为决定中和 IL-2抗体的特异性作用，同分异构体的对照IgG也被加入。FoxP3的表达和扩增情况通过 CFSE的稀释和细胞内的Foxp3的水平按照不同的时间(见图)来决定。结果是4个独立的试验 代表；图5、 AIL-2和TGF-p诱导的CD4+CD25+细胞有明显的体外抑制效果。NaiVe CD4+CD25阴性被图1相似的方法进行刺激，然后，对照CD4+(Tcon)以及IL-2和TGF-p诱 导的CD4+细胞(Treg)中的CD25+和CD25阴性细胞被进一步用流式细胞仪进行细胞分选。这 些细胞按1: 4的比例加到CFSE标记的T反应细胞和抗原呈递细胞中进行共培养(可溶性抗 CD3抗体刺激)3天。CD4+细胞的增生比例通过CFSE稀释的程度进行计算。结果是4个分 开的试验代表。图5、 BIL-2和TGF-p诱导的CD4+CD25+细胞有明显的体外抑制效果。Naiive CD4+CD25阴性被图1相似的方法进行剌激，然后，对照CD4+(Tcon)^l及IL-2和TGF-P诱 导的CD4+细胞(Treg)中的CD25+和CD25阴性细胞被进一步用流式细胞仪进行细胞分选。这 些细胞按一定的比例(见图示)加到CFSE标记的T反应细胞和抗原呈递细胞中进行共同培养 (用可溶性抗CD3抗体刺激)3天。总的CD4+细胞增生情况通过增生百分比乘以培养细孔中 的细胞总数来决定(B) 。 B是4个试验的均值加标准差。图6、静脉注射IL-2和TGF-(3诱导的BDA/2T细胞到D2B6F1小鼠能够预防D2T细胞诱 导的狼疮样疾病。20x106， DBA/2小鼠新鲜T细胞(D2)，或D2细胞加2(^106被异种抗原和
IL-2刺激的T细胞(D2+Tc。n)，或D2细胞加20xl()s被异种抗原，IL-2和TGF-P刺激的T细胞 (D2+Ttctp)分別被注射到D2B6F1小鼠中，抗IgG抗体，抗dsDNA抗体(注射后1-4周)和蛋 白尿(8周)被ELISA和蛋白尿检测法检测。注IL-2和TGF-p诱导的T细胞，而不是对照细 胞，明显地预防了D2新鲜T细胞诱导狼疮疾病的能力。图7。静脉注射IL-2和TGF-P诱导的BDA/2T细胞明显改善已经发生狼疮疾病小鼠的症状和存 活。20x106， DBA/2小鼠新鲜T细胞(D2)，被静脉注射到D2B6F1小鼠中。二周以后(小鼠已经发 病)，5到20xl()S被异种抗原，IL-2和TGF-(3刺激的T细胞(T叫)分别被注射到D2B6F1小鼠中，抗dsDNA 抗体(图7A, 注射后2-12周)和蛋白尿(图7B， 4-12周)被ELISA和蛋白尿检测法检测。小鼠的 存活也被监测直到死亡(图7C)。接受D2细胞，但是未接受Treg细胞注射者为阳性对照组，未接受D2 细胞的D2B6F1小鼠为正常对照组。注IL-2和TGF-(3诱导的T细胞，明显地降低了已经发病小鼠的 抗体ds-DNA和蛋白尿的水平，并二倍地延长了狼疮病小鼠的存活。图8、静脉注射IL-2和TGF-p诱导的BDA/2T细胞到D2B6F1小鼠并不诱导狼疮样疾 病。20x106， DBA2小鼠新鲜T细胞(D2)，或被异种抗原和IL-2刺激的T细胞(D2-T加d)，或 被异种抗原，IL-2和TGF-p剌激的T细胞(D2-TTCTp)分别被注射到D2B6F1小鼠中，抗IgG 抗体，抗ds-DNA抗体(注射后1-4周)和蛋白尿(Proteinuria, 8周)被ELISA和蛋白尿检测法检 测。注IL-2和TGF-P处理的T细胞失去了诱导狼疮疾病的能力，各种指标与没有接受注射 DBA/2T细胞的正常小鼠相似。图9、 IL-2和TGF-p诱导的DBA/2T细胞体内存活更长。10x106， CFSE标记的DBA/2 小鼠新鲜T细胞(图中标记为Fresh)，或被异种抗原，IL-2刺激T细胞(Tcon)，或者被异种抗 原，IL-2和TGF-P剌激的T细胞(TTGFbeta)分别被注射到D2小鼠中，在注射后的第l， 7， 14 天，检查各个组别小鼠脾脏中的CFSE+CD3+T细胞的数量。园圈表示CFSE+CD3+阳性细 胞，右上数字表示CFSE的强度，左下数字表总的CFSE+CD3+细胞。图10、结合IL-2和TGF-p能够诱导幼龄和老龄BWF1小鼠的CD4+细胞表达Foxp3。来 自8禾Q 22周龄的BWF1小鼠的Naifve CD4+CD25阴性细胞被图1相似的技术进行5天刺激。 流式细胞仪技术决定CD4+细胞的FoxP3表达。注结合IL-2和TGF-(3能够诱导己经发生了 狼疮病的老龄BWF1小鼠的CD4+细胞表达Foxp3，虽然表达水平略低于幼龄小鼠。图11、 IL-2和TGF-p从22周BWF1小鼠中诱导的CD4+CD25+细胞能够抑制狼疮样疾 病的发生和发展。lxl(^来自22周B/WF1小鼠纯化的B细胞或/和10xl()s纯化的CD4+细胞 被注射到8周接受了 350拉得剂量的放射性照射的B/WF1小鼠中。在有些组别，也接受了5xl()6纯化的来自对照细胞(Tcon)和IL-2+TGF-p诱导(Treg)的CD4+CD25+亚型细胞。1个月 后血清抗ds-DNA的浓度，4个月后蛋白尿的水平按照图5相似的方法决定。每个组别包含 4-6个小鼠。图12、 IL-2和TGF-p能够诱导活动期SLE病人的CD4+发展成为CD4+Foxp3+调节T细 胞。Nalvej:D4+CD25阴性细胞从正常人和活动期SLE病人中常规制备，这些细胞被抗人的 CD3/CD28抗体剌激。在有些组别，IL-2(20u/ml)或/和TGF-p被加入培养细胞中。FACS技术 决定细胞内Foxp3的表达(A)，值代表IO个试验的均值和标准差。(B).这些细胞按l: 6的比 例加入到CFSE标记的新鲜T细胞中去检测抑制活性，具体方法与图4相似)。
具体实施方式
本发明是用细胞因子TGF-(3和IL-2结合诱导外周血产生与自然CD4+调节细胞相似的一 群调节T细胞。本发明建立了一种全新的诱导CD4+调节T细胞方法，代替扩增自然的 CD4+CD25+调节T细胞的方法，用于SLE或者另外一些自身免疫性疾病的治疗。本发明发现 TGF-p和IL-2 二个细胞因子能够诱导正常的动物和人的CD4+细胞发展成为CD4+Foxp3+调节T 细胞，并且，这二个细胞因子也有能力诱导患狼疮动物和SLE病人的CD4+细胞发展成为 CD4+Foxp3+调节T细胞。因此，本发明计划从51^等自身免疫性疾病患者中获得外周血004+ 细胞，然后在体外经过TGF-p和IL-2诱导培养后，分离CD25+细胞群，得到 CD4+CD25+Foxp3+调节T细胞。最后，根据体表面积的计算，用109个左右体外诱导的 CD4+CD25+Foxp3+调节T细胞到注射到病人体内。根据TGF-p诱导的CD4+CD25十Foxp3+调节T 细胞的体内动力学和存活周期，本发明将每个月给病人静脉注射一次CD4+CD25+Foxp3+调节 T细胞。为保证取得最佳效果，在CD4+CD25+Foxp3+调节T细胞治疗之前，先用免疫抑制剂治疗一个疗程。具体内容分介绍如下,rc-々虔^诱导o w潘^^分众成为a^+a^5^mpj+^梦r潘應。实际上，调节T细胞是同质异源性的。CD4+调节T细胞包括胸腺来源的自然CD4+调节T 细胞和外周血诱导的获得性CD4+调节T细胞。我们首先发现TGF-p有能力诱导正常动物和正 常人外周血的CD4+CD25-细胞发展成为CD4+调节T细胞。这些细胞与自然的CD4+细胞有相 似的表型特征，如均表达CD25， CD122, CTLA-4， GITR等。由于最近鉴定的Foxp3基因和蛋 白仅仅被发现在自然的CD4+CD25+调节T细胞中，而常规激活的CD4+CD25+细胞并不表达 Foxp3，这样，Fo邓3就成为调节T细胞的一个特异性标志。
我们发现细胞因子TGF-P能够在TCR剌激情况下，诱导Na'ive CD4+CD25阴性细胞表达 Foxp3蛋白禾口 mRNA(郑颂国等，J Immunol. 2002 169: 4183-4189)。所有的Foxp3蛋白(图1)和 信息RNA(mRNA，蛋白质合成的调节者，图2)定位于CD25+细胞群。另外，TGF-p诱导Foxp3 也需要有IL-2的存在。如果内源性IL-2被抗体中和之后，TGF-p并不能够诱导CD4+细胞表 达Foxp3。如果用IL-2基因敲除小鼠的CD4+细胞，TGF-p诱导Fo邓3表达的能力也消失了 (图3)。更多的试验证明IL-2和TGF-p在诱导和扩增CD4+Foxp3+调节T细胞中起了一个协同 作用(图4)。2 7^-"该导游^^T潘應激移滞粼7潘應游潜主、潘應尿f游产生浙凝麽发疯。 TGF-(3和IL-2不仅诱导Foxp3的表达，而且新诱导的CD4+CD25+细胞转变成为免疫抑制 细胞。在一个标准的体外免疫抑制试验中，本发明的结果显示TGF-p和IL-2诱导的CD4+细 胞有很强的免疫抑制功能。这群体外诱导的CD4+细胞能够明显地抑制T细胞的增生，包括对 T细胞增生率的抑制(图5A)和总的T细胞增生数量(图5B)，另外，他们也能够抑制T细胞 的细胞因子(包括IFN，和IL-2)的产生(结果未显示)。因为体外的免疫抑制并不能够绝对说明体内也有相似的免疫抑制功能。为了阐明这个问 题，本发明进一步分析了是否体外TGF-p和IL-2诱导的CD4+细胞有体内免疫抑制功能。本 发明采用了一个慢性狼疮疾病模型。静脉注射20亿个DBA/2小鼠的脾脏T细胞进入 DBA/2xC57BL/6Fl杂交小鼠中，二周以后，Fl小鼠出现典型的高滴度的抗IgG和抗核抗体， 6到8周开始出现蛋白尿和狼疮肾炎，16周之后小鼠开始死亡。本发明显示,如果在疾病诱 导的同时注射TGF-P和IL-2诱导的调节T细胞，可明显地预防疾病的发生(图6)。另外，本 发明也进一步观察了这群调节T细胞对已经发病了的狼疮模型的保护作用，研究显示，如果 在已经发病的F1小鼠中注射5到20亿个细胞，能够明显地控制疾病的进展，特别是能够显 著地延长狼疮小鼠的存活(图7A， B和C)。3. "遂导游谐梦7潘應才^并没有毒副作用。注射DBA/2小鼠的脾脏细胞或者T细胞到Fl小鼠中会诱导Fl小鼠发生狼疮样综合征。 本发明也研究了是否这群细胞(IL-2和TGF-p诱导的T细胞)对Fl的致病作用。结果显示， 如果没有经过TGF-(3的处理，这群用C57BL/6非T细胞刺激的DBA/2小鼠的T细胞仍然能够 诱导狼疮样疾病。但是，如果经过IL-2和TGF-p等细胞因子的处理，这群T细胞就不再诱导 Fl小鼠发生狼疮样疾病(图8)。另外，我们也注射经过抗CD3/CD28抗体刺激的，IL-2和TGF-p诱导的CD4+CD25+细胞到同种DBA/2小鼠，发现这些接受CD4+CD25+细胞的小鼠没有任 何副作用，重要脏器，如肺、肝、肾、心和脑等脏器，经过活检并没有发现如何病理性变化 (结果未显示)。4 7^-々遂导游像萝,潘應仗赏謝激薪游0^潘應存更长游沐力存薪^菊。 本发明通过对TGF-p和IL-2诱导的T细胞进行炭氧萤光素双乙酸脂(carboxy fluoresceindiacetate succinimidyl ester, CFSE)标记，然后再注射到同种动物体内，通过追踪分析，发现 它们在体内至少能够存活达半个月以上(图9)。在另外的试验研究中，用同种动物不同源 (Congenic)标志研究，发现注射的调节T细胞能够存活至少一个月(结果未显示)。5 7^-"潔^遂导5//^7 V、嵐效0^潘應发展成力^^r潘應。虽然TGF-p和IL-2能够诱导正常的动物和人的CD4+细胞发展成为CD4+调节T细胞，本 发明进一步研究了是否这二个细胞因子能够诱导患有自身免疫疾病的个体如狼疮小鼠的 CD4+细胞发展成为调节T细胞。因为B/WF1小鼠能够自发性的发生狼疮，分别从8周(尚未 发病)和22周(已经发病)的B/WF1小鼠中制备出Naive CD4+细胞，我们观察到，TGF-p和 IL-2能够诱导二种小鼠的Na'ive CD4+细胞发展成为Foxp3+细胞，TGF-p诱导22周小鼠的 CD4+细胞发展成为Foxp3+细胞的能力稍微弱于8周小鼠(图10)。进一步研究发现，TGF-p和 IL-2诱导的22周小鼠的CD4+细胞在注射到BWF1小鼠中之后，能够明显地降低B/WF1小鼠 的疾病的进展(图11)。《7^-"虔^遂导5Zf谅乂游6P^潘蘑,展成为^梦f潘應。因为本发明的最终目标是用TGF-p和IL-2这二个细胞因子诱导SLE等自身免疫性疾病患 者的CD4+细胞发展成为调节T细胞，然后回输给该病人，希望用这个无毒副作用或者毒副作 用较小的调节T细胞代替并且临床上正在使用的激素和非激素类的免疫抑制剂，来治疗SLE 等自身免疫疾病。在这个发明研究中，活动期SLE病人外周血的na'ive CD4+CD25-细胞被制备后，用抗 CD3/CD28抗体进行刺激，试验组加TGF-p和IL-2，对照组仅仅加IL-2。 5到6天后，对照组 和试验组细胞的Foxp3蛋白的表达被检测到，如图12显示。TGF-p和IL-2能够明显地诱导 激活的活动期SLE病人的Naive CD4+细胞表达Fo邓3蛋白，并且TGF-p和IL-2诱导的CD4+ 细胞也能够抑制SLE病人的T细胞的增生。具体操作步骤归纳如下 1. 从SLE病人中静脉抽取外周血，用淋巴细胞分离液(Ficoll)技术分离淋巴细胞。用 单克隆抗体(如抗单核细胞抗体，B细胞抗体，CD8+细胞抗体和记忆细胞抗体等)加上阴性 筛选技术来分离出NaiVe CD4+细胞。2. 对SLE病人NaYve CD4+细胞，用抗CD3/CD28抗体包裹的微粒珠子进行刺激。在24孔 板的培养皿中，力n 2xl()6个na'ive CD4+细胞，2"05个抗CD3/CD28抗体包裹的微粒珠子和重 组的细胞因子白介素IL-2(20u/ml)共一周。在诱导调节T细胞的过程中，我们加0.5-10ng/ml的TGF-(3。根据我们的预初实验结果，我们发现5ng/ml的TGF-p是最理想的条件。 为了排除抗原呈递细胞对体外诱导调节T细胞和随后的体内注射所产生的副作用，本发明不 用抗原呈递细胞。3. 培养5到6天之后，CD4+细胞中的CD25+细胞用符合GMP标准的德国Miltenyi公司的 微小磁珠来进行分离。具体是，收集培养的细胞之后，用CD25抗体进行染色，4nC， 20分钟 后，CD25将与CD4+细胞中的CD25+亚群相结合，然后，加Miltenyi公司的微小磁珠(按照 10ul与lxl(f个细胞的比例加磁珠的量)，由于CD25抗体上带有一个藻红蛋白 (Phycoerythrin, PE),而Miltenyi的微小磁珠上带有抗藻红蛋白的抗体，这样，所有的 CD25+细胞就与磁珠形成复合物。然后，通过一个有磁场的细胞洗脱柱子，阳性分离获得的 细胞就是CD4+CD25+F0XP3+调节T细胞。4. 根据体表面积的计算，本发明计划注射109个CD4+CD25+F0XP3+调节T细胞给SLE病 人。为保证获得最大效果，我们计划首先给活动期SLE病人进行常规药物治疗一个疗程，然 后，开始注射CD4+CD25+调节T细胞。5. 由于CD4+CD25+F0XP3+调节T细胞在动物体内的存活周期大约一个月，本发明计划每 一个月重复注射一次。6. 在调节T细胞治疗过程中，本发明除了需要观察病人的临床症状进展情况外，也需要 密切检测自身抗体的浓度和另外一些反映疾病程度和活动度的指标。7. 本发明也计划将CD4+CD25+F0XP3+调节T细胞与免疫抑制剂和激素结合使用来治疗 SLE，在这个过程中来降低激素和免疫抑制剂的剂量。
权利要求
1、一种针对自身免疫性疾病的TGF_β诱导的调节T细胞，其特征在于是由TGF_β和IL_2两个细胞因子相结合，通过体外诱导自身免疫性疾病患者的CD4+细胞而获得，具体记为CD4++CD25+Foxp3+调节T细胞，这里FoxP3为FoxP3基因或蛋白。
2、 一种针对自身免疫性疾病的TGF—p诱导的调节T细胞的形成方法，其特征在于具体步 骤如下(1) 从自身免疫性疾病患者静脉中抽取外周血，用淋巴细胞分离液技术分离淋巴细胞； 再用单克隆抗体和阴性技术分离NAIVE—CD4+细胞；(2) 对分离出的NAIVE—CD4+细胞，用抗CD3/CD28抗体包裹的微粒珠子进行刺激；然后加 入3-10ng/ml的TGF—p和15-30unit/ml的IL一2，培养5-6天；(3) 然后对CD4+细胞中的CD25阳性细胞用MACS微粒珠子进行分离，即得到所需的 CD4+CD25+Foxp3+调节T细胞。
3、 一种由如权利要求1所述的TGF—p诱导的调节T细胞作为制备治疗自身免疫性疾病患 者的药物制剂中的应用。
4、 根据权利要求3所述的应用，其特征在于TGFJ3诱导的调节T细胞一次用量为5-102°个，每月注射一次。
5、 根据权利要求3所述的应用，其特征在于自身免疫性疾病患者先用免疫抑制剂或治 疗一个疗程，然后使用TGFJ3诱导的调节T细胞，或者将TGFJ3诱导的调节T细胞与免疫抑 制剂或激素结合起来使用，并且相减少激素或免疫抑制剂的使用剂量。
全文摘要
本发明属于生物医学技术领域，具体为一种TGF-β诱导的调节T细胞及其形成方法和应用。本发明的调节T细胞由TGF_β和IL_2两个细胞因子相结合，通过体外诱导自身免疫性疾病患者的CD4+细胞而获得，记为CD4++CD25+Foxp3+调节T细胞，其中，FoxP3为FoxP3基因或蛋白。本发明的调节T细胞可作为一种药物制剂，用于自治疗自身免疫性(如SLE)患者的疾病。
文档编号C12N5/0783GK101126076SQ20071004371
公开日2008年2月20日 申请日期2007年7月12日 优先权日2007年7月12日
发明者徐建光, 戴维·赫威兹, 王菊华, 邹和建, 郑颂国 申请人:郑颂国;邹和建;徐建光;王菊华;戴维·赫威兹