一种人β珠蛋白基因及其重组腺相关病毒载体的制作方法

专利名称：一种人β珠蛋白基因及其重组腺相关病毒载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医学领域，特别涉及一种含有人3珠蛋白基因启动子的 人e珠蛋白基因及含有其的重组腺相关病毒载体，以及该重组载体的制备方 法和在e地中海贫血的基因治疗中的应用。
背景技术：
P地中海贫血(海洋性贫血)是一组以血红蛋白的P珠蛋白肽链合成减 少或缺失为特征的遗传性血液病。该病在地中海流域及东南亚发病率高达
10%。我国广东、广西地区检出率可达3-4%。重型P-地中海贫血严重威胁 患儿生命，目前临床治疗主要依靠输血，而长期输血易引起体内铁负荷过度， 过多吸收的铁超出血清转铁蛋白的能力沉积脏器，引起多器官病变，且不能 达到根治的目的。造血干细胞移植虽能医治部分患者，但受供体来源及移植 后并发症等影响，难于广泛应用。因此寻找有效治疗手段是临床医生和患者 的急切愿望。
将P-珠蛋白基因导入患者的造血干细胞是最有希望的治疗形式之一。 已有研究报道用逆转录病毒载体介导外源3珠蛋白基因转入小鼠体内，可检 测到外源P珠蛋白基因的低表达，相继有报道，逆转录病毒载体整合具有随 机性，可导致插入突变，激活原癌基因或抑癌基因失活引发恶性肿瘤 (尸rac.廳.y4cad 园，1995， 92: 6728~6732; Sc/e"ce，2003， 302:415-419)。 近年来，有研究报道用慢病毒载体能高效介导外源P珠蛋白基因在小鼠体内 稳定长期表达，但其生物安全性仍有待改进(iVa^w .2000,406:82-86)。
腺相关病毒(AAV)是细小病毒家族的一员，为无包膜的线性单链DNA 病毒。由于AAV具有长期潜伏于人体而不具有任何明显致病性等优点，人
们对AAV作为一种理想的基因治疗载体给予了很大期望。但是，近来发现，
这类载体在应用上有许多明显的缺陷，包括某些细胞膜上病毒受体数量极
少，重组AAV载体位点特异性整合不足，AAV衣壳成分和转基因产物引起 宿主的免疫反应，载体容量小(Cw^Tbp.M/cra6/o/./附mw"o/. 1996,218:1 -23; 尸rac.A^L4cad t/5^,1990,87:2211-2215)，装载的目的基因片段大小受一 定的限制等等。因此，能否将P-珠蛋白基因导入腺相关病毒载体并获得稳 定的表达还是个未知数。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种能在体内稳定长期表达，生物安全 性更高的重组腺相关病毒载体及其制备方法，以及适于该载体的含有人P珠 蛋白基因启动子的人3珠蛋白基因。
由于用病毒载体介导外源正常的P -珠蛋白基因转导造血干/祖细胞，随 造血干/祖细胞在体内的增殖和分化使外源P-珠蛋白基因得到持久而稳定的 表达，以纠正血红蛋白P珠蛋白肽链合成减少或缺失，是3地中海贫血基因 治疗的策略。本发明人曾选用与人类疾病无相关性、生物安全性较好的腺相 关病毒作为载体，构建了包括腺相关病毒的反向末端重复序列ITR，人P-珠蛋白基因簇增强子核心序列HS2、 HS3和HS4片段(HS234)，以及含有 人e珠蛋白基因启动子的人P珠蛋白基因序列(e-globin)的重组腺相关病 毒载体。将上述重组腺相关病毒载体转染e地中海贫血小鼠的骨髓造血干/ 祖细胞，并将其移植入受体小鼠，在该小鼠体内可检测到外源人P-珠蛋白 基因并有表达，可持续12个月(参见Tan Mengqun, Qing Keyun， Zhou Shangzhen， et al. Adeno-associated virus 2-mediated transduction and erythroid lineage-restricted long-term expression of the human beta-globin gene in hematopoietic cells from homozygous beta-thalassemic mice. Mol Ther, 2001,3(6):940~946.)。然而，该重组载体中的P-globin序列，以及HS234核
苷酸序列均克隆自含有其的质粒，这些质粒并非商业质粒，公众不能取得； 且由于带有适于质粒的修饰片段，上述核苷酸序列，特别是e-globin序列较 长(>3kb)，表达效率低。
本发明人在上述试验基础上，直接从人0 -珠蛋白基因Genomic DNA中 分别克隆了 HS2、 HS3和HS4核苷酸序列，以及含有人P珠蛋白基因启动 子的P-globin序列，将其导入腺相关病毒构建重组载体。本发明人惊奇地发 现，由于导入的P-globin序列〈3kb，为2472kb，更适合现有腺相关病毒载 体。将该重组载体转染缺乏人3-珠蛋白基因表达的K562细胞株，可检测到 外源人P -珠蛋白基因在该细胞的表达；用该重组腺相关病毒载体转染P地 中海贫血小鼠的骨髓造血干/祖细胞或流产3地中海贫血胎儿造血细胞，将其 移植入受体小鼠，在该小鼠体内可检测到外源人P -珠蛋白基因并有表达， 且持续稳定表达一年以上。
因此，本发明提供的一种含有人e珠蛋白基因启动子的人e珠蛋白基 因，其核苷酸序列如SEQIDNO.l所示。
而本发明的一种重组腺相关病毒载体，其在腺相关病毒的反向末端重复 序列ITR之间插入有人P -珠蛋白基因簇增强子核心序列HS2、 HS3和HS4 片段(HS234)，以及上述含有人P珠蛋白基因启动子的人P珠蛋白基因的 核苷酸序列。
较佳地，所述HS2、 HS3和HS4片段也分别从人P -珠蛋白基因Genomic DNA中直接克隆得到，HS2的核苷酸序列如SEQIDN0.2所示(386bp)， HS3片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示(225bp) ， HS4片段的核苷酸 序列如SEQIDN0.4所示(279bp)。
根据本发明，所述的腺相关病毒选用现常用的AAV2型。 而本发明一较佳实施例的重组腺相关病毒载体的制备方法，可以包括下 列步骤
①将人e-珠蛋白基因簇增强子核心序列HS2、 HS3和HS4片段依次插
入pCRlI-TOPO载体，构成载体pCRlI-HS234;
② 将含有人P珠蛋白基因启动子的人P珠蛋白基因序列(e-globin)插 入经EcoRI酶切的质粒pBSII-SK，构建成载体pBSII-hP-globin;
③ 用EcoR V与Not I将P -globin从pBS II -h P -globin上切出，与用同 样酶切的pCRlI-HS234连接，构建成载体pCRlI-HS234- P -globin;
④ 用Sac I与Not I将人P -珠蛋白基因簇增强子核心序列1 234片段及 e-globin序列(HS234-P-globin)从pCRlI-HS234-P画globin上切出，与质 粒pAAV-IRES-hrGFP用Not I酶切后形成的片段连接，构建成质粒 pAAV-HS234-h P -globin，即重组腺相关病毒载体pAAV/ 3 -globin;
上述构建过程如图1所示。
其中，步骤①、②中的载体还可以选择其它适用的载体，可以是根据文 献自行构建，也可以是商业化产品，主要考虑酶切位点，便于插入即可；而 步骤④中的腺相关病毒载体可以是现有任何含有反向末端重复序列ITR的 AAV载体，特别是AAV2，如pAAV-rGFP等。
同常规，本发明制备方法还包括包装纯化该重组腺相关病毒载体pAAV/ 3 -globin的步骤将pAAV/e -globin及辅助质粒pAAV-RC、 pHelper共三 种质粒共转染至包装细胞，经常规氯化铯超速离心纯化方法制得纯化病毒载 体rAAV/P-globin。
根据本发明，所述的包装细胞可以是现有技术中常用的包装细胞，例如 人胚肾细胞HEK293或者金黄地鼠胚胎肾细胞BHK-21等，本发明以前者为 例。
而所述的转染优选采用磷酸药共沉淀法。
本发明重组腺相关病毒载体转染缺乏人e-珠蛋白基因表达的K562细 胞株，可检测到外源人e-珠蛋白基因在该细胞的表达；用该重组腺相关病 毒载体转染P地中海贫血小鼠的骨髓造血干/祖细胞或流产P地中海贫血胎 儿造血细胞，将其移植入受体小鼠，在该小鼠体内可检测到外源人3-珠蛋
白基因并有表达，且持续稳定表达一年以上。
因此，本发明重组腺相关病毒载体可以用于制备基因疗法治疗P地中海 贫血的药物。
另外，本发明还提供一种转染有上述重组腺相关病毒载体的造血干/祖细 胞。较佳地，造血干/祖细胞在转染前采用羟基脲预处理过，可明显地提高表 达效率。所述的造血干/祖细胞可移植入患体，用于治疗e地中海贫血，故而 可用于制备治疗P地中海贫血的药物。


图1为本发明重组腺相关病毒载体pAAV/P -globin的构建图。
图2显示本发明重组AAV DNA拯救、复制的经0.8%琼脂糖胶电泳印迹
杂交放射自显影图。
图3显示了用slot blot检测纯化重组病毒载体rAAV/P -globin的滴度。 图4显示了用PCR和RT-PCR检测导入的外源P -globin基因在K562
细胞的表达。
图5显示了用PCR和RT-PCR检测经ex vivo途径转入小鼠体内的人0 -globin基因。
具体实施例方式
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。
下面实施例中所采用的分子生物学技术可参见J.萨母布鲁克等编的《分 子克隆实验指南》；所使用的工具酶均购自New England Biolab公司，具体 的反应条件和使用的方法均参考商品说明书；所使用的胶回收试剂盒购自博 大泰克生物基因公司，使用方法参考商品说明书。
实施例1 构建重组腺相关病毒载体pAAV-HS234-h P -globin
(1)HS234片段
根据现有HS2、HS3及HS4片段序歹u(Nucl Acid Res 1994. 22:1006-1011;
EMBO J 1993. 12:1077-1085; Nucl Acid Res 1990. 9:2159-2167; Nucl Acid
Res 1991. 19:1413-1419; PNAS 1995. 92:6728-6732)分别设计引物①、②和③。
弓i物①P5: 5，-ttaaataagcttcagtttttccttagttcc-3 ，(如SEQ ID NO.5所示)，
P3: 5，-tctagaatatgtcacattctgtct-3,(如SEQ ID NO.6所示)；
弓i物②P5: 5，-tggtgtgccagatgtgtctatcag-3，(如SEQ ID NO.7所示)，
P3: 5，-gatatcgctgctatgctgtgcctccccca画3，(如SEQ ID NO.8所示)； EcoRV
弓i物③P5: 5，画ggaccccagtacacaagaggggacgca-3 ，(如SEQ ID NO.9所示)，
P3: 5,-g§^ggaatgggagggagagtctctg-3，(如SEQ ID NO. 10所示)。 EcoRV
从来源于正常人外周血单个核细胞提取的人P -珠蛋白基因Genomic DNA[基因库登录号U01317,提取工艺来自Molecule Biology( the second edition): 9.16 Analysis and Cloning of Eukaryatic Genomic DNA]中，用弓i物①、 ②、③经PCR方法分别获得相应产物HS2(386bp，如SEQ ID NO.2所示)、 HS3(去除3，端引物带入的EcoRV酶切位点，225bp,如SEQ IDNO.3所示)、 HS4(去除3，端引物带入的EcoRV酶切位点，279bp，如SEQIDN0.4所示) 片段。其中PCR体系和条件为模板DNA (100ng) l)il， 10XBuffer 5^1， dNTP 4(il， primerl l(xl， primer2 1jj!， H20 37|al， Tag enzyme 0.5-1 pi; 94°C 5min， (94。C 30s， 60°C 40s， 72°C 40s)30次，72°C 10min， 4。C。将HS2用T/A 克隆方法插入用EcoR I酶切的pCRlI-TOPO载体(购自Invitrogen)，构建 成载体pCRH-HS2;将在3'端带有EcoRV酶切位点的HS3插入用EcoRV 酶切的pCRlI-HS2，构建成载体pCRlI-HS23，再将同样3'端带有EcoRV 酶切位点的HS4插入用EcoRV酶切的pCRlI-HS23，构建成载体pCRlI -HS234。
(2)含有P -globin启动子的P -globin基因片段 用引物
上、游:5 ，-ccaaatattacgtaaatacac-3 ，(如SEQ ID NO. 11所示)， 下游:5,-tgaaagagtgatagttccggga-3 ，(如SEQ ID NO. 12所示)； 从人P -珠蛋白基因Genomic DNA经PCR扩增获得含有人P珠蛋白基 因启动子的人P珠蛋白基因序列(P-globin)产物(2472bp，如SEQIDNO.l 所示)。其中，PCR体系DNA (lOOng) 0.5-1 |il， 10X Advantage Genomic LA buffer 2.5(xl, dNTP ljil， primerl l(il， primer2 lpl， H2018.5(il， Advantage Genomic LA Polymerase Mix 0.25;条件94。C 3min，(94。C lmin、68。C 3min、 94°C lmin)30次，68°C 10min， 4°C。将P-globin引物在5，磷酸化后获得 的产物直接插入经EcoR I酶切的pBSlI-SK载体质粒(购自Stratagene)，构 建成载体pBSlI-hP-globin。
(3)用EcoR V与Not I将P -globin从pBS II - P -globin上切出，与用同样 EcoRV与Notl酶切的pCRlI-HS234连接，构建成载体pCRlI-HS234-P -globin 。
(4)用Sac I与Not I将HS234- P -globin从pCR II-HS234- P -globin上 切出，亚克隆至用Notl酶双切的载体pAAV-IRES-hrGFP(购自Stratagene) 中，构建成重组腺相关病毒载体pAAV-HS234-hP-globin，简称pAAV/P -globin 。
上述构建过程如图l所示。
采用人胚肾HEK293细胞(购自ATCC)2X 106/皿来验证重组AAV DNA 的复制用磷酸钙共沉淀法，同时转染重组AAV载体质粒(pAAV-HS234-h P -globin 10吗)和辅助质粒pAAV2-kC (购于Stratagene公司)、pHelper (购 于Stratagene公司)各10吗，分别于24、 48、 72小时后收集细胞，用Hirt's 溶液提取小分子量DNA，经DpnI消化，0.8%琼脂糖凝胶电泳，Southern 转移至硝酸纤维素滤膜，然后与"P标记P-globin基因探针进行杂交，结果 如图2所示，检测到基因组的两种复制形式(单体型M、 二倍体型D)，表 明pAAV-HS234-h P -globin结构完整，能够在细胞内有效介导病毒基因组的
拯救、复制。
实施例2纯化重组腺相关病毒载体rAAV/ P -globin的获得 将HEK293细胞作为包装细胞，用DMEM培养液、10%新生牛血清传 代培养，细胞生长至80%-85%融合，采用磷酸钙共沉淀法将实施例1制得的 pAAV-HS234-0-globin和辅助质粒pAAV2-RC、 pHelper共三质粒共转染 HEK293细胞，各质粒10pg/皿(10cm)，取5 ml的1.5mol/L的CaCl2，加 水至20ml，混匀，逐滴加2x Buffer A (50mM Hepes， 1.5mM Na2HP04， 280rnM NaCl， pH7.05)25ml，混匀静置5分钟，出现白色云雾状，即开始转染293 细胞，2ml/皿，继续置二氧化碳培养箱5%C02、 37°C、饱和湿度培养65-70 小时，收集细胞放入-7(TC冰箱冻存。接下来进行纯化，将冻存的细胞物从-70 "C取出置37t:水浴箱中30分钟，反复冻溶两次，加氯化铯用超速离心(速 度35，000转/分，15°C、 48小时)，分离出重组病毒，再经透析(透析袋型号 10000 MWCO)、浓縮离心管10000 MWCO (millipore.com)离心获取纯化 重组病毒rAAV/ 3 -globin。
用32P标记的P -globin为探针通过狭缝杂交(slot blotting)检测rAAV/ 0-globin滴度(见图3)。具体操作以AAV2标准质粒为对照，待测纯化 重组病毒rAAV/ P -globin计微升数(pl)上样，分别以1: 2对倍稀释连续上样 于硝酸纤维素膜上，用^P标记P-globin基因为探针进行杂交。图中第l、 2 排为对照组，上样浓度第1排按顺序依次为10ng/^d、 5ng4d、 2.5ng年l……递 减，第2排按顺序依次为lng/W、 0.5ng/|al、 0.25ng一 递减；第3、 4排
为本发明纯化重组病毒rAAV/ P -globin样品1 ，第3排上样量按顺序依次为 1(^1、 5^1、 2.5^1 递减，第4排上样量按顺序依次为lpl、 0.5^1、 0.25^1……
递减；第5、 6排为本发明纯化重组病毒rAAV/e-globin样品2，上样顺序同 样品1，可见，样品1和2滴度相差较大，样品2未作进一步离心浓縮处理。 记算结果如图可见本发明纯化的重组腺相关病毒载体rAAV/e -globin滴度 第4排第1号相当于第一排第二号；5ng/l^ilX2X108particles4il =1.0 x10 particles./ml o
实施例3 用PCR和RT-PCR检测导入的外源P -globin基因在K562细
胞中的表达
无菌条件下，取12X 106个悬浮于含10%新生牛血清的RPMI 1640培养 液中生长状态良好的K562细胞，分为未经预处理对照组(8乂106细胞)与 用羟基脲预处理组(4X1()S细胞)，未经预处理对照组加适量用于溶解羟基 脲的溶液1XPBS;预处理组加入终浓度为15mmol/L羟基脲，置二氧化碳培 养箱5%<:02、 37°C、饱和湿度培养4小时，分别收集细胞，用1XPBS洗细 胞一次，未预处理对照组又分为对照组与实验组，分别用无血清RPMI1640 培养液150-200^1重悬细胞，对照组加16plRPMI 1640培养液、实验组与预 处理组分别加16^1 (相当于50MOI)实施例2获得的重组腺相关病毒载体 rAAV/P-globin，在上述条件下培养，每隔10-15分钟摇匀一次，转染2小 时后，用1XPBS洗细胞，再用含10。/。新生牛血清的RPM 11640培养液重悬 细胞，继续在上述条件下培养72小时，收集细胞分别提取DNA和RNA， 完成PCR和RT-PCR检测(具体步骤参见Tan Mengqun, Qing Keyun, Zhou Shangzhen, et al. Adeno-associated virus 2-mediated transduction and erythroid lineage-restricted long-term expression of the human beta-globin gene in hematopoietic cells from homozygous beta-thalassemic mice. Mol Ther， 2001，3(6):940~946.)。结果如图4所示，图中泳道1、 5号为对照K562细胞 组，2、 3、 4、 6、 7、 8号为K562细胞被rAAV/e-globin转染组，其中4、 8 号为加羟基尿预处理再转染组。结果提示K562细胞存在3 -globin但不表达， 转染后的K562细胞，能检测到外源3 -globin的表达，并且羟基尿预处理可 提高表达效率。
实施例4用PCR和RT-PCR检测经ex vivo途径导入的外源人P -globin 基因在受体小鼠中的表达
处死5只P地中海贫血小鼠，冲取其四肢骨骨髓细胞，用淋巴细胞分离
液离心分离单个核细胞，用抗体标记(Sca-l+Lin-标记抗体B220、CD4、 CD8a Mac-l、 GR-1、 Fitc isotype 2a、 PE-Sca画l、 PE-isotype 2b)，经流式细胞仪分 选造血干/祖细胞(Pettersson et al祝o/. 2000 67 (3): 423,431)，将其 分为未预处理对照组与羟基脲预处理组，分别用50MOI rAAV/P -globin转染 2小时，收集细胞洗后悬浮于RPMI 1640培养液中，调整细胞浓度至8X 104/ml。经尾静脉注入受亚致死剂量(7.0Gy)照射的受体小鼠(与P地中海贫 血小鼠同品系)，用未预处理对照细胞与经羟基脲预处理细胞各5只，每只 注0.3ml含细胞2X 104，移植后3个月，取外周血来源的血细胞DNA，用 PCR扩增，人P-globin基因作探针，Southern blot分析其中5只阳性，未预 处理对照组2只，经羟基脲预处理组3只。移植后6个月同上检测，仍5只 阳性。处死各组阳性小鼠l只，提取骨髓细胞来源的DNA和RNA，用PCR 和RT-PCR检测示人P-globin基因存在，且有表达。移植后一年仍维持有3 只阳性小鼠，处死后检测人P-globin基因存在且发现有红系特异性表达，结 果如图5所示。
序列表
<uo>谭孟群
<120> —种人P珠蛋白基因及其重组腺相关病毒载体
<130〉 P4-071217C
<160> 12
<170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 2472
<212> DNA
<213> 人(human)
<400> 1
ccaaatattacgta犯tac3cttgc犯aggsggatgttttt3gt3gC犯tttgtax:tgat60
ggtatggggcc犯gagatatatcttagsggg郷gctgagggtttg卿tccaactccta120
已gccagtgccaggac鄉tacggctgtcatcacttagacctcaccctgtg180
gagccacaccct鄉gttggccaatctactcccaggagcagggagggcaggagccagggc240
agtcagggcagagccatctattgcttacatttgcttctgacacaactgtg300
ttcactagcaacctcaaacagaC3CC3tggtgcacctgactcctg鄉sgaagtctgccg360
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<212> DNA
<213> 人(human)
<400〉 3
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<210> 4
<2U> 279
<212> DNA
<213> 人(human)
<400> 4
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tgtgagaata agaatagcca
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cttgccctgc ctctctacta ggctgactca ctccaaggcc 180
tcagggcttt gatagcacta tctgcagagc cagggccgag 240
tctccctccc attccccga 279
<210> <211> <212> <213>
30
DNA
人工序列(Artificial)
<220>
<223> 引物
<400> 5
ttaaataagc ttcagttttt ccttagttcc
30
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial) <220>
<223> 引物
<400> 6
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24
<210> 7 <211> 24<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial) <220>
<223> 引物
<400> 7
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<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial) <220>
<223> 引物
<400> 8
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<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial) <220>
<223> 引物
<400> 9
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<210> 10
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<212> DNA
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<223> 引物
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<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial) <220>
<223> 引物
<400> 11
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<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial) <220>
<223> 引物
<400> 12
tgaaagagtg atagttccgg ga 2权利要求
1、一种含有人β珠蛋白基因启动子的人β珠蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2、 一种重组腺相关病毒载体，其在腺相关病毒的反向末端重复序列ITR 之间插入有人e-珠蛋白基因簇增强子核心序列HS2、 HS3和HS4片段，以 及如权利要求1所述的人P珠蛋白基因的核苷酸序列。
3、 如权利要求2所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于所述的HS2 片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，HS3片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，HS4片段的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。
4、 如权利要求2或3所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于所述的 腺相关病毒为AAV2型。
5、 一种如权利要求4所述的重组腺相关病毒载体的制备方法，其包括 下列步骤-① 将人P-珠蛋白基因簇增强子核心序列HS2、 HS3和HS4片段依次插 入pCRlI-TOPO载体，构成载体pCRH-HS234;② 将含有人P珠蛋白基因启动子的人P珠蛋白基因的核苷酸序列插入 经EcoRl酶切的质粒pBSII-SK，构建成载体pBSlI-he-globin;③ 用EcoRV与Notl将人e珠蛋白基因的核苷酸序列从pBSlI-he -globin上切出，与用同样酶切的pCRlI-HS234连接，构建成载体pCRlI -HS234- P -globin;④ 用Sac I与Not I将人P -珠蛋白基因簇增强子核心序列HS2、 HS3和 HS4片段，以及人e珠蛋白基因的核苷酸序列从pCRlI-HS234-P -globin上 切出，与质粒pAAV-IRES-hrGFP用Notl酶切后形成的片段连接，构建成质 粒pAAV-HS234-h P -globin，即重组腺相关病毒载体pAAV/ e -globin;上述构建过程如图1所示。
6、 如权利要求5所述的制备方法，其特征在于其还包括包装纯化该重 组腺相关病毒载体pAAV/ 0 -globin的步骤将pAAV/ P -globin及辅助质粒 pAAV-RC、 pHelper共三种质粒共转染至人胚肾细胞HEK293包装，经常规 纯化方法，制得纯化病毒载体rAAV/ P -globin。
7、 如权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述的转染采用磷酸,丐 共沉淀法。
8、 如权利要求2~4任一项所述的重组腺相关病毒载体在制备基因疗法 治疗P地中海贫血的药物中的应用。
9、 一种转染有权利要求2~4任一项所述的重组腺相关病毒载体的造血 干/祖细胞。
10、 如权利要求9所述的造血干/祖细胞，其特征在于其在转染前采用羟 基脲预处理过。
全文摘要
本发明公开了一种含有人β珠蛋白基因启动子的人β珠蛋白基因及含有其的重组腺相关病毒载体，以及该重组载体的制备方法。该重组腺相关病毒载体在腺相关病毒的反向末端重复序列ITR之间插入有人β-珠蛋白基因簇增强子核心序列HS2、HS3和HS4片段，以及该含有人β珠蛋白基因启动子的人β珠蛋白基因序列。该重组载体转染效率高，介导的外源基因可在体内长期表达，且安全性好，可用于β地中海贫血的基因治疗。
文档编号C12N15/12GK101348786SQ200710044040
公开日2009年1月21日 申请日期2007年7月20日 优先权日2007年7月20日
发明者谭孟群 申请人:谭孟群