专利名称：重组人载脂蛋白ai米兰突变体在毕赤酵母中的表达方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种人载脂蛋白AI米兰突变体 (Aoplipoproteinl-milano,AIM)的基因工程表达方法。
技术背景人载脂蛋白AI米兰突变体(AIM)是ApoAI的天然突变体，首次发现于意大利米兰 地区一个村庄的部分居民中，其血浆中HDL上的ApoAI发生变异，即第173位的Arg突 变成Cys。迄今已发现该家族有40余名AIM携带者，尽管这些居民血浆中HDL水平很低， 甘油三酯水平相当高，却很少患心血管疾病，而且很长寿。研究发现含有AIM的HDL能 提高胆固醇反向转运(RCT)效率。在HDL上70XCys形成键间二硫键，30% Cys的巯 基仍以游离态存在。AIM通过键间二硫键的形成，能导致同源二聚体载脂蛋白AIM/AIM 或异源二聚体载脂蛋白AIM/ApoAII的产生。AIM二聚体的形成使得分子间交联折叠，形 成一个新的结构域，结合脂的能力大大增强，且AIM 二聚体与ApoAI单体相比，其紧密 型和稳定性更好，在血浆中的半衰期也更长。由AIM与磷脂结合形成的HDL与天然的HDL 相比较，前者对LCAT的激活作用还稍有增强。迄今为止大量的动物和临床试验显示，重组AIM具有比ApoAI更强的抗动脉粥样硬 化的功能，有可能成为治疗和预防动脉粥样硬化症的新药，具有临床应用前景。2006年美 国洛杉矶Cedars—Sinai医学中心的研究者，通过对ApoE和ApoAI双缺陷型小鼠进行骨髓 移植，使之可表达ApoAI或者AIM，之后小鼠被喂食高胆固醇食物，24周后经解剖观察 到能表达AIM的小鼠动脉粥样硬化斑块减少了 65% ，而表达野生型ApoAI的仅减少25 % 。 另据报道美国Esperion公司为治疗和预防动脉粥样硬化症而研制的药物ETC-216(即重组AiM/磷脂复合物)，已进入m期临床试验。我国有近1亿人口患有动脉粥样硬化疾病，而美国和欧洲则有多达1/3的人口患有此 病，该病已成为全世界发病率最高、预防和治疗花费最多的病种之一，因此抗动脉粥样硬 化的药物研究正在引起重视。由于AIM不能从血浆中提取，必须依赖基因工程方法进行生 产。然而由于AIM的C末端序列对蛋白酶极其敏感，因此用基因工程方法表达重组人 AIM(Raim)时，极易发生该蛋白C末端的部分降解。国内有人尝试用大肠杆菌表达系统来 表达rAIM，但表达的rAIM蛋白主要的以包涵体形式存在，而且会发生降解而得不到全长 rAIM，从而失去其重要的生物功能。毕赤酵母表达系统具有真核生物的翻译后加工的特点，
且发酵条件简单，表达水平高，表达产物活性好，因此本发明选用毕赤酵母分泌表达系统 进行rAIM的表达研究，通过对酵母工程菌摇瓶培养条件的优化，使rAIM的降解得到有 效抑制，其表达水平约为70mg/L发酵液，其中全长rAIM所占比例约为80%。目前在国 内外均未见采用毕赤酵母表达rAIM的报道。 发明内容本发明目的是提供一种用基因工程技术高效表达rAIM的方法。本发明提出的用基因工程技术高效表达rAIM的方法，具体是采用DNA定点突变和 DNA重组技术构建毕赤酵母重组工程菌株，经摇瓶培养和诱导，SDS-PAGE、 Western blot 鉴定，证明工程菌能高效分泌表达rAIM;对工程菌的摇瓶培养基和培养条件进行优化后， 发酵上清液中有明显的rAIM表达，且rAIM的降解得到有效控制；用冷丙酮沉淀法部分 纯化了工程菌发酵液中的表达产物rAIM，并验证了其与磷脂结合的活性。本发明的具体操作步骤如下1重组表达质粒的构建采用重组PCR法对pPIC9k-apoAI质粒(详见生物工程学报，2004,20(6):906-9")进行 定点突变得到重组表达质粒pPIC9k-apoAI-milano，使apoAI cDNA的第173位Arg的密 码子(CGC)突变成Cys的密码子(TGT)。2酵母工程菌株的筛选重组表达质粒pPIC9K-apoAI-milano经Sgr/ll酶切线性化后，电转化到毕赤酵母 GS115。转化子经G418抗性筛选，获得高抗性菌株。高抗性菌株经摇瓶培养和诱导， SDS-PAGE鉴定，证明能高效分泌rAIM。3酵母工程菌株的摇瓶培养将高表达的酵母工程菌株接种于BMGY培养基中，培养后分别转入常规的BMMY培 养基或经过优化的BMMY培养基中进行甲醇诱导。4 rAIM的SDS-PAGE、 Western blot鉴定取发酵上清液作SDS-PAGE、 Western blot鉴定，证明发酵上清液中有明显的rAIM 表达。5 rAIM的部分纯化采用冷丙酮沉淀法部分纯化酵母工程菌发酵上清液中的表达产物rAIM。 6rAIM与磷脂结合能力的分析通过rAIM与脂质DMPC (1,2-豆蔻酰磷脂酰胆碱)结合试验，证明酵母工程菌表达
的rAIM具有磷脂结合活性。鉴于人载脂蛋白Al米兰突变体具有比ApoAI更强的抗动脉粥样硬化的功能，有广阔 的临床应用前景，因此采用毕赤酵母分泌表达系统成功表达rAIM，为今后用基因工程方法 生产rAIM积累了经验。
图1为本发明的重组表达质粒pPIC9K-apoAI-milano经Xhol、 EcoRI双酶切后DNA 电泳鉴定1、化b ladder; 2、 pPIC9K-apoAI陽milano经Xhol、 EcoRI双酶切。图2为本发明apoAI-milano cDNA在毕赤酵母染色体上AOX1位点的双交换整合。图3为本发明的rAIM rAIM用常规方法(a)和优化方法(b)表达的SDS-PAGE,Western blot鉴定1.人血浆ApoAI; 2.酵母工程菌的发酵上清液3. GS115发酵上清液。图4本发明的rA頂与脂质匿PC的结合曲线。
具体实施方式
实施例l重组表达质粒的构建和鉴定重组质粒pPIC9k-apoAI-milano是采用重组PCR法对pPIC9k-apoAI质粒进行定点突 变后得到，使cDNA的第173位Arg的密码子(CGC)突变成Cys的密码子(TGT),突变序列经 过测序验证。突变后的apoAI-milano cDNA插在pPIC9k的X/ o1、 EcoRI位点上，大小约为 747bp。实施例2酵母工程菌株的筛选和鉴定重组表达质粒pPIC9K-apoAI-milano DNA经Sg/ll酶切后，与毕赤酵母GS115感受态细 胞混合，在电压1300V，电阻200Q,电容25uF条件下电击转化，涂布RDB平板，30°C 培养3天，得到1500多个转化子。转化子经G418抗性筛选，获得在含G418 4mg/ml平板上 仍能生长的高抗性转化子23个。通过摇瓶培养和SDS-PAGE鉴定，从G418高抗性转化子 筛选得到能分泌表达rAIM的酵母工程菌20株。实施例3酵母工程菌的诱导表达按常规方法，将酵母工程菌株接种于3ml BMGY培养基的试管中，3CTC振荡培养 18h 。将取1m睹养物种接于含50ml BMGY培养基中，3CTC振荡培养24h，于室温6000r/min 离心6min，收集菌体。将菌体转移到15ml BMMY培养基中，3CTC振荡培养72h，每隔24h 补加一次甲醇。取发酵上清液作SDS-PAGE和Western blot鉴定，发现工程菌按常规方法 培养和诱导，其表达产物rAIM会发生部分降解，它的分子量比人血浆ApoAI (28.3KD)稍 小，约23KD。进一步，本发明还对BMMY培养基和培养条件的进行优化，即用KOH将BMM丫培养基
的pH调节到6.9-7.1，蛋白胨的用量从原来占培养基质量的20/。增加到3.9%-4.1%，并添加 原培养基体积0.8-1.2。/。的Arg和Ala(w/v)以及4.5-.5.5mmol/L的EDTA，诱导时将温度从原来 的30。C降低至24-26。C，诱导时间为70-75小时。结果rAIM的表达水平可达到70mg/L左右， 其中全长rAIM (28.3KD)所占比例约80%， rAIM的降解得到有效控制。通过SDS — PAGE 和Westem blot鉴定，初步证明rAIM的分子质量与人血浆提取ApoAI相同。 实施例4 rAIM的Westem blot鉴定将电泳后的SDS — PAGE凝胶剥离，电转移到PVDF膜上，PVDF膜用5X脱脂牛奶封 闭；加入一抗(Rabbit anti—Human ApolipoproteinAI)， 37。C振荡1h，洗涤2次;加入二 抗(Goat anti—Rabbit IgG， Alkaline phosphatase conjugated), 37。C振荡1h，洗涤1次； 用底物缓冲液洗涤1次；在10m喊性磷酸酶底物缓冲液中加入33ulBCIP和66ulNBT，将 PVDF膜浸入，37。C显色3min;用水冲洗终止反应。实施例5冷丙酮法部分纯化rAIM发酵上清液于《C， 10000r/min离心10min，加入一2(TC预冷的丙酮，使丙酮浓度(v/v) 达到60%。搅拌均匀后，在一20'C冰箱中静置过夜，于4。C， 12000r/min离心20min,收 集沉淀。沉淀用1/10原发酵上清液体积的0.5XPBS洗涤、吹打。室温12000r/min离心 20min，收集沉淀。将沉淀再用1/20原发酵上清液体积的0.5XPBS重复洗涤，收集上清液。实施例6 rAIM与磷脂结合能力的分析将DMPC干粉悬于0.5XPBS溶液中，在漩涡振荡器上剧烈振荡，以形成多层脂质体， 分别将rAIM和人血浆ApoAI样品用0.5XPBS溶解，使反应体系中载脂蛋白与DMPC的质量 比为1: 2。分别将载脂蛋白溶液与DMPC溶液在24。C水溶液中温育，然后立即混合液体， 室温下测定325nm的吸光值A325。每隔10min测定一次，连续测2h，重复3次。结果表明， 用优化方法表达后得到的rAIM，其与磷脂结合的量和人血浆ApoAI相比十分接近，这说明 在毕赤酵母中表达的rAIM具有磷脂结合活性。
权利要求
1.一种重组人载脂蛋白AI米兰突变体在毕赤酵母中分泌表达的方法，其特征是将apoAI-milano cDNA插入表达载体pPIC9k；经Bg/II酶切后电击导入毕赤酵母GS115中，获得重组工程菌株；在BMMY培养基中进行摇瓶培养和甲醇诱导，实现rAIM的分泌表达。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于具体操作步骤如下(1) 构建重组表达质粒通过重组PCR方法对pPIC9k-apoAI质粒进行定点突变得到重组表达质粒 pPIC9k-apoAI-milano，使apoAI cDNA的第173位Arg的密码子CGC突变成Cys的密码子 TGT，突变的DNA序列经测序验证；突变后的apoA卜milano cDNA插在pPIC9k的X/ o I 和Ecof I位点上，大小约为747bp;(2) 筛选酵母工程菌将重组表达质粒pPIC9k-apoAI-milano经Sg/n酶切，电击转化毕赤酵母GS115，在 RDB平板上获得转化子；转化子在含G418的YPD平板上进行G418抗性筛选，获得高抗性 菌株；通过摇瓶发酵和SDS — PAGE检测，筛选得到能分泌表达rAIM的酵母工程菌株；(3) 酵母工程菌株的诱导表达将高表达的酵母工程菌株接种于BMGY培养基中，培养后分别转入常规的BMMY培养 基或经过优化的BMMY培养基中进行甲醇诱导；这里所述优化的BMMY培养基中诱导;是指 用KOH将BMMY培养基的pH调节到6.9-7.1,蛋白胨的用量为BMMY培养基质量的 3.9-4.1%;并添加Arg和Ala以及EDTA，添加量Arg和Ala为BMMY的0.8-1.2。/。r W/V， EDTA 为4.5-5.5mmol/L，诱导温度为24-26"，诱导时间为70-75小时。
全文摘要
本发明属于生物工程技术领域，具体为一种重组人载脂蛋白AI米兰突变体(rAIM)在毕赤酵母中分泌表达的方法。将突变后的apoAI-milano cDNA插入表达质粒pPIC9k，电击导入毕赤酵母GS115，通过对摇瓶培养基和培养条件的优化，发酵上清液中有明显的rAIM表达，其分子量与人血浆中提取的ApoAI相同。纯化后的rAIM具有磷脂结合活性。
文档编号C12N1/19GK101126088SQ20071004402
公开日2008年2月20日 申请日期2007年7月19日 优先权日2007年7月19日
发明者宋大新, 彦 张, 赵志安, 江 钟 申请人:复旦大学