一种检测载脂蛋白a5以诊断高甘油三酯血症的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测载脂蛋白A5(ApoA5)以诊断高甘油三酯血症的试剂盒，包含有二株未标记抗ApoA5的单克隆抗体和酶标抗ApoA5的单克隆抗体、封闭液、酶底物溶液、包被缓冲液、终止液、洗涤液、酶标板；二株未标记抗ApoA5单克隆抗体包被于酶标板作捕获抗体，酶标抗ApoA5单克隆抗体为检测抗体，包被缓冲液为0.05mol/l、pH9.6的碳酸盐缓冲液，其中1升溶液中含1.59g?Na2CO3和2.93g?NaHCO3，封闭液为质量浓度1％牛血清白蛋白；酶底物溶液为60μg/ml的3，3’，5，5’四甲替联苯胺和质量浓度为0.05％H2O2的0.1mol/l、pH6.0磷酸盐缓冲液；终止液为1mol/lH2SO4溶液。本发明用二株单克隆抗体包被于酶标板以捕捉人体血液中的ApoA5，提高抗体捕获能力，提高测定的灵敏度和准确度及线性范围，达到检验与临床要求。
【专利说明】一种检测载脂蛋白A5以诊断高甘油三酯血症的试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及载脂蛋白A5(ApoA5)作为高甘油三酯血症(HTG)诊断的生化指标，抗ApoA5抗体对的制备技术，酶标记显色免疫反应技术和利用ApoA5的抗体来诊断高甘油三酯血症(HTG)的【技术领域】，特别涉及一种定量检测ApoA5以诊断高甘油三酯血症(HTG)的试剂盒。
【背景技术】
[0002]临床上检测血脂的项目有很多，各医院普遍检查的基本项目有总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、载脂蛋白(Apo)B、Apo Al、脂蛋白(a) [Lp (a)]等。调查资料研究表明，高甘油三酯、高胆固醇、低的高密度脂蛋白-C(HDL-C)和高的低密度脂蛋白-C(LDL-C)共同构成了冠心病的危险因素。载脂蛋白(Apo)异常与冠心病和中风密切相关。尽早进行正确诊断，有利于早期防治这些严重的疾病。载脂蛋白检测试剂的开发，有助于冠心病和中风的有效防治。
[0003]血清ApoAI可以代表HDL水平，与HDL-C呈正相关，其临床意义也大体相似。但是，HDL是一系列颗粒大小与组成不均一的脂蛋白，病理状态下HDL亚类与组成往往会发生变化，故ApoAI的升降不一定与HDL-C变化完全成比例。Ap0BlOO大约有有90%的比例分布在LDL中，所以血清ApoB主要代表LDL水平，它与血清LDL-C水平呈明显正相关，ApoB水平高低的临床意义也与LDL-C相似。但是，在少数情况下，可出现高ΑροΒΙΟΟ血症而LDL-C浓度正常的情况，所以这两种载脂蛋白可靠性和准确性都不十分令人满意。
[0004]ApoA5属于ApoAI/CIII/AIV基因群，在肝脏表达，与HDL/VLDL有关。ApoA5基因启动子的单核苷酸变异(SNP)直接影响甘油三酯水平。实验研究表明，在表达人类ApoA5转基因的小鼠的血浆中甘油三酯的浓度下降为对照鼠的三分之一，而在缺少该基因的小鼠中却增加了 4倍。ApoA5作为高甘油三酯血症的病因诊断指标具有很高的敏感性和特异性。
[0005]高水平甘油三酯可使小密低密度脂蛋白(sLDL)浓度升高，具有较强的致动脉粥样硬化作用。甘油三酯水平越高，低密度脂蛋白中的胆固醇酯越多。人们已经证实，动脉粥样硬化斑块中的胆固醇主要来自于低密度脂蛋白，低密度脂蛋白既是血浆中含胆固醇最多的，也是致动脉粥样硬化性最强的脂蛋白。另外，流行病学研究表明，高水平甘油三酯使高密度脂蛋白浓度下降，高密度脂蛋白浓度受甘油三酯水平的影响，两者呈负相关。近来研究表明，血甘油三酯水平异常与体内凝血因子异常密切相关，血浆甘油三酯水平升高可以导致体内凝血因子水平升高，从而促进血凝，并可使组织型纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)合成增加，抑制纤维蛋白溶解，形成高凝状态，促进冠心病的发生。有实验结果表明，甘油三酯浓度上升lmmol/L，心血管意外发生率男性上升32 %，女性为76 %。在校正高密度脂蛋白的影响后，危险率男性上升14%，女性为37%。这些结果表明血清甘油三酯浓度升高是心血管疾病的重要危险因素。
[0006]高甘油三酯血症患者常同时有高血压和胰岛素抵抗。胰岛素抵抗通常指患者有倾向于非胰岛素依赖糖代谢异常，该类患者常较早地形成冠状动脉疾病。通常将脂质三联症、高凝状态、高血压、胰岛素抵抗称为代谢综合征。已证实高甘油三酯血症患者常合并有代谢综合征中的其它异常。高甘油三酯血症的临床意义在于此。而作为直接影响甘油三酯水平的指标ApoA5显得尤为重要，ApoA5的单核苷酸多态性有望作为风险指示标和降低血脂浓度的治疗靶点。
[0007]本发明就是将ApoA5通过ELISA实验应用于临床实践以达到高甘油三酯血症的病因诊断，以及冠心病和中风等心血管疾病有效防治的目的。
[0008]ApoA5的酶联免疫定量测定，绝大部分运用了二株抗体，如专利200610018747.5，一株单克隆抗体为捕获抗体，另一株单克隆抗体(或多克隆抗体)为标记抗体，形成酶联夹心法测定ApoA5。但这一方法测定ApoA5的线性范围窄，因此其测定灵敏度和准确度都受到限制。
【发明内容】
[0009]本发明的目的为了克服现有ApoA5的酶联免疫定量测定运用二株抗体存在的缺点，而提供一种检测ApoA5以诊断高甘油三酯血症的试剂盒，本发明结合三明治抗体技术以及针对ApoA5的抗体对开发技术研制出了三抗法定量测定ApoA5试剂盒，用二株单克隆抗体替代传统方法中的一株单克隆抗体为捕获抗体，提高了抗体捕获能力，提高了测定的灵敏度和准确度，以及线性范围，使在普通酶标仪上定量检测ApoA5，达到检验与临床要求。本发明利用ApoA5作为HTG诊断的生化指标，制备抗ApoA5的单克隆抗体对，以及利用改进了的酶联免疫法(ELISA)定量测定人血清中ApoA5的浓度，而对高甘油三酯血症进行病因诊断，从而达到冠心病和中风等心血管疾病的有效防治。
[0010]本发明的目的是通过如下技术方案实现的:
[0011]—种检测ApoA5以诊断高甘油三酯血症的试剂盒,试剂盒内包含有二株未标记抗ApoA5的单克隆抗体和另一株酶标抗ApoA5的单克隆抗体、封闭液、酶底物溶液、包被缓冲液、终止液、洗涤液、酶标板；其特征在于:以二株未标记抗ApoA5的单克隆抗体均匀包被于单位面积的酶标板上作为捕获抗体，以另一株酶标抗ApoA5的单克隆抗体为检测抗体，包被缓冲液为0.05mol/l、pH9.6的碳酸盐缓冲液，其中I升溶液中含1.59gNa2C03和2.93gNaHCO3,封闭液为质量浓度I %牛血清白蛋白；酶底物溶液为60 μ g/ml的3，3’，5，5’四甲替联苯胺(TMB)和质量浓度为0.05% H2O2的0.lmol/1、pH6.0磷酸盐缓冲液；终止液为Imol/IH2SO4 溶液。
[0012]所述的二株未标记抗ApoA5单抗隆抗体按1:0.1 一 9混匀，同时均匀包被于单位面积的酶标板孔上。
[0013]所述的二株未标记抗ApoA5的单克隆抗体记为Abl+Ab2 ;另一株抗ApoA5的单克隆抗体记为Ab3，Ab3标记辣根过氧化物酶HRP后记为Ab3-HRP ;从而有Abl+Ab2与ApoA5结合，ApoA5与Ab3-HRP结合，先后形成Abl+Ab2?ApoA5?Ab3_HRP反应链，此为本发明三抗法定量测定ApoA5试剂盒的核心。Abl、Ab2、Ab3要求作用于ApoA5抗原的不同位点，Abl+Ab2与Ab3分别配对后对ApoA5抗原有较好的结合力及较高的特异性，先后形成Abl+Ab2?ApoA5?Ab3-HRP反应链，HRP使显色底物四甲基联苯胺(TMB)显色，再通过酶标仪测定OD值，根据标准曲线计算求得待测样品ApoA5的含量。
[0014]所述抗ApoA5的抗体为单克隆抗体对。
[0015]所述抗ApoA5单克隆抗体用纯化的ApoA5免疫BALB/c小鼠，得到抗原刺激的脾脏细胞，融合该脾脏细胞和小鼠的骨髓瘤细胞系SP2/0 ;利用HAT选择培养基选择杂交瘤细胞，并利用ELISA方法筛选鉴定产生抗ApoA5抗体的细胞；进行三次克隆化后得到分泌高特异性的单克隆抗体的细胞株，保存所筛选到的产生与ApoA5高特异性结合的单抗的细胞株，通过小鼠腹水生产抗ApoA5的单抗。再利用Protein A-SePharose亲和层析柱进一步纯化腹水中抗ApoA5的单抗，ELISA及Western-Blot鉴定分离纯化的单抗。
[0016]抗ApoA5单抗隆抗体对的筛选，主要采用抑制法筛选高亲和力的亚克隆，进而在多次克隆化和ELISA相加实验结果的基础上进行竞争抑制表位分析和亲和力的测定，得到不同表位的单抗细胞株，进一步生产腹水并纯化得到多量抗体，进行单株标记，采用ELISA直接法进行标记抗体的工作浓度滴定，然后采用ELISA竞争抑制法进行单标抗体表位测定，从而筛选出高效亲和力的三明治抗体对。
[0017]酶标抗ApoA5的单克隆抗体采用的是过碘酸钠法辣根过氧化物酶标记抗体。以Na14先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与ApoA5的单克隆抗体即免疫球蛋白上的氨基相结合，进一步用NaBH4还原生成稳定的酶标记抗体。透析纯化后离心去除沉淀，上清即为酶-抗体结合物。
[0018]将二株未标记抗ApoA5单抗隆抗体按1:0.1 — 9均匀包被于单位面积的酶标板孔上，包被缓冲液为0.05mol/l、pH9.6的碳酸盐缓冲液，即I升溶液中含1.59g Na2CO3和
2.93g NaHCO30封闭液为质量浓度I %牛血清白蛋白；酶底物溶液为60 μ g/ml的3，3’，5，5’四甲替联苯胺(TMB)和质量浓度为0.05% H2O2的0.lmol/l、pH6.0磷酸盐缓冲液；终止液为ImoVlH2SO4溶液。
[0019]与现有检测指标和技术及产品相比，本发明有突出的优点和实用性:
[0020]1、检测特异性强而实用。ApoA5属于ApoAI/CIII/AIV基因群，在肝脏表达，与HDL/VLDL有关。ApoA5基因启动子的单核苷酸变异(SNP)直接影响甘油三酯水平。ApoA5作为高甘油三酯血症的病因诊断指标具有很高的敏感性和特异性。本发明避免了目前市场上的同类产品只能单纯表现结果，却不能明确说明病因的缺点。高甘油三酯血症一经查出是ApoA5基因突变原因引起，即可针对病因进行相应治疗，从而从根本上解决高甘油三酯血症及其引发的相关疾病的预防和治疗。
[0021]2、检测灵敏度和准确度高，以及线性范围大。人血液中ApoA5的浓度范围变化很大，约为20-410ng/ml很低，平均约为215ng/ml。本发明结合三明治双抗体技术以及针对ApoA5的抗体对开发技术研制出了三抗法定量测定ApoA5试剂盒，用二株单克隆抗体替代传统方法中的一株单克隆抗体为捕获抗体，提高了抗体捕获能力，提高了测定的灵敏度和准确度，以及线性范围，使在普通酶标仪上定量检测ApoA5达到检验与临床要求。
[0022]本发明实验结果及分析:
[0023]ELISA检测不同样品中ApoA5的浓度，利用所制备的抗ApoA5的单克隆抗体对，采用三抗ELISA方法，测定不同样品中ApoA5的浓度。结果如下表和图1。
[0024]抗体:抗ApoA5, 0.1 μ g/ml, 100 μ I/孔；封闭液:1% BSA。由测定结果可见,三抗ELISA方法对ΑροΑ5的检测下限即灵敏度为30ng/ml左右，接近高加索白人血清的ApoA5浓度的最低值(24ng/ml),远低于亚洲人ApoA5浓度的最低值(91ng/ml),以及远远低于人血液中ApoA5的平均浓度(215ng/ml)。
[0025]
阴性约照50100200?00800
-挑稀释1? BSAng/iing/iilng/nilηκ* mlngfml
L 1:3(100 O* IBl 0.!79 0,510 §,530 O, §62 0,948 L 301 1.299 L 803 1.79? 2.20? 2.19SB, 1:4000 0.1^2 0.tHH 0.η 0,551 0._ 0.901 L 322 L 338 1.THH 1.772 阳 2-1-1?
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1为本发明的ΑροΑ5浓度与不同二抗稀释度的吸光度的曲线图。
【具体实施方式】
[0027]高甘油三酯血症(HTG)诊断试剂盒的生产方法:
[0028]1、ΑροΑ5的单克隆抗体对的制备
[0029]用纯化的ΑροΑ5作为抗原分别免疫BALB/c小鼠，间隔21天免疫第二次，以后每间隔10天免疫一次，共免疫3 — 4次，然后取出免疫小鼠的脾脏细胞，用PEG将该脾脏细胞与小鼠的骨髓瘤细胞系SP2/0进行融合，利用HAT选择性培养基在96孔细胞培养板上筛选杂交瘤细胞，用ELISA方法鉴定抗ApoA5的细胞株，进行三次克隆化后得到稳定分泌高特异性单克隆抗体的细胞株，在相同抗原包被板上采用ELISA抑制法，即参照组中加入细胞培养上清，在抑制组加入细胞培养上清和抗原混合物，比较两组OD值差异从而筛选出高亲和力的亚克隆。然后在间接ELISA实验上进行相加法表位分析，即参照组中分别加入两个单株细胞培养上清，测定组中同时加入两株细胞培养上清，比较两组OD值(Al、A2和A1+2)，通过下面公式计算:
9 Λ.
[0030]Al= -...............-...............-.........:......-..................4 X 100%
Λ； +Λ:
[0031]在比较计算结果的基础上进行表位分析和亲和力的测定，Al值小于50%为相加阴性，即两细胞株分泌的抗体识别抗原的表位相同，Al值大于50%为相加阳性，表示两细胞株之间无竞争，即两细胞株分泌的抗体识别抗原的两个不同的表位，从而初步得到针对抗原不同表位的单抗细胞株。进一步将得到的单抗细胞株分别注射入小鼠腹腔进行腹水生产，利用Protein A-Sepharose亲和层析柱纯化腹水得到多量单克隆抗体,用HRP酶对纯化的抗体进行单株标记，用ELISA直接法进行标记抗体的工作浓度滴定，然后用ELISA竞争抑制法在参照组中加入酶标抗体，在测定组中加入酶标抗体和未标记待测抗体混合物，比较两组OD值，参照组OD值大于测定组OD值的表示存在竞争抑制，视为两抗体识别抗原的表位相同。反之，两抗体不存在竞争抑制时视为两抗体识别抗原的表位不同，从而最终筛选得到高效亲和力的三明治抗体对。
[0032]2、酶标记抗ApoA5单克隆抗体的方法
[0033]酶标抗ApoA5的单克隆抗体采用的是过碘酸钠法辣根过氧化物酶标记抗体。称取HRP溶解蒸馏水中。加入新配的0.lmol/1、Na14溶液，室温下避光搅拌20分钟。Na14先将HRP表面的糖分子氧化成醛基。上述溶液装入透析袋中，加Im mol/l、PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4°C过夜。加0.2mol/l、PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化HRP的pH升高到9.0?9.5,然后立即加入ApoA5的单克隆抗体,在0.0lmol/1碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。待醛化的HRP与ApoA5的单克隆抗体即免疫球蛋白上的氨基相结合后，再加新配的4mg/ml NaBH4液，置4°C 2小时，NaBH4将其还原生成稳定的酶标记抗体。上述液装入透析袋中，在0.15mol/l、pH7.4PBS透析，4°C过夜。透析纯化后离心去除沉淀，上清即为酶一抗体结合物(Ab3-HRP)。
[0034]3、各种缓冲液及试剂的配制方法
[0035]①包被缓冲液:0.05mol/l、ρΗ9.6 的 Na2CO3-NaHCO3 =Na2CO3(MW105.99) 1.59g 和NaHCO3(MW84.01)2.93g，加蒸馏水至 1000ml。
[0036]②封闭液:1%牛血清白蛋白(BSA)溶液:牛血清白蛋白Ig;加磷酸盐缓冲液(PBS)(配制如下)至100ml。
[0037]0.01mol/l、ρΗ7.4 的 PBS 溶液:NaCI (MW58.44) 8.0g，KCl (MW74.55) 0.2g，KH2PO4 (MW136.09)0.24g, Na2HPO4.12H20 (MW358.14)3.6g，加蒸馏水至 1000ml。
[0038]③洗涤液:ρΗ7.4 的 PBS — Tween-20，在 100ml0.0lmol/1、ρΗ7.4 的 PBS 溶液中加
0.5ml 吐温-20 (Tween-20)即可。
[0039]④酶底物3，3 ’，5，5 ’四甲替联苯胺(TMB)溶液:
[0040]i)四倍的底物缓冲液:称取35.8g Na2HPO4.12H20 ;称取21.1g柠檬酸；各加超纯水至500ml即分别获得A母液B母液，取A液300ml，用B液调PH值至5.2即得，使用时四倍稀释。
[0041]ii)TMB浓缩液:准确称量粉剂TMB400mg加入1ml 二甲基亚砜(DMSO)中，使之完全溶解后即得四十倍的TMB底物浓缩液。
[0042]i i i)工作液配制:1ml底物缓冲液中加入0.025ml TMB浓缩液完全混匀后4 μ 130%的双氧水即可，临用前现配。
[0043]⑤终止液:lmol/1 H2SO4溶液:浓硫酸(95-98% )54.3ml，加蒸馏水至100rnl即可，配时将浓硫酸缓慢滴入蒸馏水中，边加边混匀。
[0044]高甘油三酯血症(HTG)诊断试剂盒的操作步骤:
[0045]1、制定标准曲线
[0046]将二株纯化的未标记抗ApoA5单克隆抗体溶液Abl与Ab2按1:1比例混匀，然后用包被缓冲液稀释到0.1μ g/ml，加入到96孔酶标板中，每孔100 μ 1，37°C包被I小时或4°C过夜；洗涤液洗板3次，甩干，加入I % BSA封闭，每孔200 μ 1，37°C封闭I小时；不洗，甩干，分别加入0、50、100、200、400、800ng/ml的ApoA5标准抗原，每孔100μ 1，37°C孵育I小时；洗涤液洗板3次，甩干，加入酶标记的抗ApoA5单抗(Ab3-HRP)溶液(用洗涤液稀释到
0.1 μ g/ml)，每孔100 μ 1，37°C孵育I小时；洗涤液洗板3次，甩干，加入酶底物(TMB)工作液，每孔100 μ 1，避光显色5分钟，加入终止液，每孔50 μ I。利用酶标仪在450nm波长测定光吸收值(A450nm)，以浓度(ng/ml)为横坐标，A450nm为纵坐标，绘制标准曲线。
[0047]2、测定血清中的ApoA5浓度
[0048]将纯化的二株未标记抗ApoA5的单克隆抗体溶液Abl与Ab2按1:1比例混匀，单克隆抗体混合液(Abl+Ab2)用包被缓冲液稀释到0.1 μ g/ml，加入到96孔酶标板中，每孔ΙΟΟμ 1，37°C包被I小时或4°C过夜；洗涤液洗板3次，甩干，加入1% BSA封闭，每孔200μ 1，37°C封闭I小时；不洗，甩干，加入适当倍数稀释的待检测血清，每孔ΙΟΟμ 1，37°C孵育I小时或4°C过夜；洗涤液洗板3次，甩干，加入酶标记的抗ApoA5单抗溶液(Ab3_HRP)，用洗涤液稀释到0.1 μ g/ml，每孔ΙΟΟμ 1，37°C孵育I小时；洗涤液洗板3次，甩干，加入酶底物(TMB)工作液，每孔100 μ 1，避光显色5分钟，加入终止液，每孔50 μ I。利用酶标仪在450nm波长测定光吸收值(A450nm)，根据标准曲线，由所测得的A450nm值，计算求得血清中ApoA5的浓度。
[0049]3、结果判定
[0050]根据ApoA5作为高甘油三酯血症(HTG)病因诊断指标的截断值(cut off值)215ng/ml,浓度低于该值的可判定为ApoA5缺乏,有高甘油三酯血症的危险；或可判定ApoA5基因突变为高甘油三酯血症的主要病因。
【权利要求】
1.一种检测载脂蛋白A5(ApoA5)以诊断高甘油三酯血症的试剂盒，试剂盒内包含有二株未标记抗ApoA5的单克隆抗体和另一株酶标抗ApoA5的单克隆抗体、封闭液、酶底物溶液、包被缓冲液、终止液、洗涤液、酶标板；其特征在于:以二株未标记抗ApoA5的单克隆抗体均匀包被于单位面积的酶标板上作为捕获抗体，以另一株酶标抗ApoA5的单克隆抗体为检测抗体，包被缓冲液为0.05mol/l、pH9.6的碳酸盐缓冲液，其中I升溶液中含1.59gNa2CO3和2.93g NaHCO3，封闭液为质量浓度1%牛血清白蛋白；酶底物溶液为60 μ g/ml的3，3，，5，5，四甲替联苯胺(TMB)和质量浓度为0.05% H2O2的0.lmol/1、pH6.0磷酸盐缓冲液；终止液为ImoVlH2SO4溶液。
2.根据权利要求1所述检测ApoA5以诊断高甘油三酯血症的试剂盒，其特征在于:所述的二株未标记抗ApoA5单抗隆抗体按1:0.1 — 9混匀，同时均匀包被于单位面积的酶标板孔上。
3.根据权利要求1所述检测ApoA5以诊断高甘油三酯血症的试剂盒，其特征在于:所述的二株未标记抗ApoA5的单克隆抗体记为Abl+Ab2 ;另一株抗ApoA5的单克隆抗体记为Ab3，Ab3标记辣根过氧化物酶HRP后记为Ab3-HRP ;从而有Abl+Ab2与ApoA5结合，ApoA5与Ab3-HRP结合，先后形成Abl+Ab2?ApoA5?Ab3_HRP反应链，此为本发明三抗法定量测定ApoA5试剂盒的核心。
【文档编号】G01N33/577GK104165992SQ201410362427
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年7月28日 优先权日:2014年7月28日
【发明者】钱金宏, 廖园园, 廖伟 申请人:武汉璟泓万方堂医药科技股份有限公司