一种用于诊断高甘油三酯血症的检测试剂板的制作方法

一种用于诊断高甘油三酯血症的检测试剂板的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于诊断高甘油三酯血症(HTG)的检测试剂板，利用载脂蛋白A5(ApoA5)作为HTG诊断的生化指标，制备抗ApoA5的单克隆抗体对，在一步法检测试剂板上固定胶体金标记的ApoA5单克隆抗体作为捕获抗体；精确呈横条状分布于免疫层析膜上的未标记ApoA5单克隆抗体用作检测抗体，通过显示免疫层析膜上的条纹，来检测判定样品中ApoA5的含量，从而应用于HTG的病因诊断，以助冠心病和中风等心血管疾病的有效防治。本发明提供的试剂板使用简便、快速，每份试剂单独包装，可存放于室温下，便于保存。与胶体金显色定量检测仪配合使用，并与预设的Cutoff值进行比较并报告检测结果，实现ApoA5胶体金快速定量检测分析，避免胶体金显色用肉眼判断引起的漏判误判，提高ApoA5检测的灵敏性。
【专利说明】一种用于诊断高甘油三酯血症的检测试剂板

【技术领域】
[0001] 本发明涉及载脂蛋白A5(Ap〇A5)作为高甘油三酯血症（HTG)诊断的生化指标， Ap〇A5单克隆抗体对的制备技术，胶体金标记显色的免疫层析反应技术和利用Ap〇A5的 抗体来诊断高甘油三酯血症（HTG)的【技术领域】，特别涉及一种用于诊断高甘油三酯血症 (HTG)的检测试剂板。 技术背景
[0002] 临床上检测血脂的项目有很多，各医院普遍检查的基本项目有总胆固醇（TC)、甘 油三酯（TG)、载脂蛋白（Apo)B、Apo AI、脂蛋白（a)[Lp(a)]等。调查资料研究表明，高甘油 三酯、高胆固醇、低的高密度脂蛋白-C(HDL-C)和高的低密度脂蛋白-C(LDL-C)共同构成了 冠心病的危险因素。载脂蛋白（Apo)异常与冠心病和中风密切相关。尽早进行正确诊断， 有利于早期防治这些严重的疾病。载脂蛋白检测试剂的开发，有助于冠心病和中风的有效 防治。
[0003] 血清ΑροΑΙ可以代表HDL水平，与HDL-C呈正相关，其临床意义也大体相似。但是， HDL是一系列颗粒大小与组成不均一的脂蛋白，病理状态下HDL亚类与组成往往会发生变 化，故4?^1的升降不一定与册1^-(：变化完全成比例。4? 〇8100大约有90%的比例分布在 LDL中，所以血清ΑροΒ主要代表LDL水平，它与血清LDL-C水平呈明显正相关，ΑροΒ水平高 低的临床意义也与LDL-C相似。但是，在少数情况下，可出现高ΑροΒΙΟΟ血症而LDL-C浓 度正常的情况，所以这两种载脂蛋白可靠性和准确性都不十分令人满意。
[0004] ApoA5属于ApoAI/CIII/AIV基因群，在肝脏表达，与HDL/VLDL有关。ApoA5基因启 动子的单核苷酸变异（SNP)直接影响甘油三酯水平。实验研究表明，在表达人类Ap 〇A5转 基因的小鼠的血浆中甘油三酯的浓度下降为对照鼠的三分之一，而在缺少该基因的小鼠中 却增加了 4倍。Ap〇A5作为高甘油三酯血症的病因诊断指标具有很高的敏感性和特异性。
[0005] 高水平甘油三酯可使小密低密度脂蛋白（sLDL)浓度升高，具有较强的致动脉粥 样硬化作用。甘油三酯水平越高，低密度脂蛋白中的胆固醇酯越多。人们已经证实，动脉粥 样硬化斑块中的胆固醇主要来自于低密度脂蛋白，低密度脂蛋白既是血浆中含胆固醇最多 的，也是致动脉粥样硬化性最强的脂蛋白。另外，流行病学研究表明，高水平甘油三酯使高 密度脂蛋白浓度下降，高密度脂蛋白浓度受甘油三酯水平的影响，两者呈负相关。近来研究 表明，血甘油三酯水平异常与体内凝血因子异常密切相关，血浆甘油三酯水平升高可以导 致体内凝血因子水平升高，从而促进血凝，并可使组织型纤溶酶原激活物抑制剂（PAI)合 成增加，抑制纤维蛋白溶解，形成高凝状态，促进冠心病的发生。有实验结果表明，甘油三酯 浓度上升lmmol/L，心血管意外发生率男性上升32 %，女性为76 %。在校正高密度脂蛋白的 影响后，危险率男性上升14%，女性为37%。这些结果表明血清甘油三酯浓度升高是心血 管疾病的重要危险因素。
[0006] 高甘油三酯血症患者常同时有高血压和胰岛素抵抗。胰岛素抵抗通常指患者有倾 向于非胰岛素依赖糖代谢异常，该类患者常较早地形成冠状动脉疾病。通常将脂质三联症、 高凝状态、高血压、胰岛素抵抗称为代谢综合征。已证实高甘油三酯血症患者常合并有代谢 综合征中的其它异常。高甘油三酯血症的临床意义在于此。而作为直接影响甘油三酯水平 的指标Ap〇A5显得尤为重要，Ap 〇A5的单核苷酸多态性有望作为风险指示标和降低血脂浓 度的治疗靶点。
[0007] 本发明就是将Ap〇A5通过单克隆抗体对的制备技术和胶体金免疫层析技术应用 于临床实践以达到高甘油三酯血症的病因的快速诊断，以及冠心病和中风等心血管疾病有 效防治的目的。
[0008] 三明治双抗体技术是建立在单克隆抗体技术之上的生物【技术领域】较新的后抗体 技术。双抗体夹心法应用抗体对识别抗原的两个位点来捕捉抗原，避免了抗体与抗原的同 一位点的竞争结合，减少了抗原决定簇的空间位阻现象，所以较一般的抗原捕捉法更敏感， 特异性更强，重复性更好，尤其适用于抗原含量很少的标本的检测。本发明结合此技术开发 的针对ApoA5的抗体对，对检测HTG病人血液中微量生化指标（抗原）更突显其重要意义。


【发明内容】

[0009] 本发明的目的是提供一种用于诊断高甘油三酯血症的检测试剂板，利用载脂蛋白 A5(Ap 〇A5)作为高甘油三酯血症（HTG)诊断的生化指标，制备Ap〇A5的单克隆抗体对以及相 应的胶体金免疫层析快速检测试剂板，检测时间仅8 - 12分钟，通过测定人血液中的ApoA5 的浓度，而对高甘油三酯血症（HTG)进行病因诊断，从而达到冠心病和中风等心血管疾病 的有效防治。
[0010] 本发明的目的是这样实现的：
[0011] 一种用于诊断高甘油三酯血症的检测试剂板，包括胶体金标记的Ap〇A5单克隆抗 体及未标记的ApoA5单克隆抗体、羊抗鼠 IgG抗体、聚乙烯板、聚氯乙烯衬膜、滤膜、玻璃纤 维纸、聚酯膜、免疫层析膜和吸水纸组成。检测试剂板水平面自下而上依次为：样品吸收 区、金标单抗区、固相化抗体区和吸水区，样品吸收区铺设的为在聚乙烯板及聚氯乙烯衬膜 上铺设滤膜和玻璃纤维纸，吸水区为吸水纸，其特征在于：金标单抗区为：将胶体金标记的 Ap〇A5单克隆抗体均匀喷洒于单位面积的聚酯膜上；固相化抗体区为：将未标记的Ap〇A5单 克隆抗体和羊抗鼠 IgG抗体固定在单位面积的免疫层析膜上。
[0012] 所述的胶体金标记ApoA5单克隆抗体的制备方法：分别取适量半径为20-60nm的 胶体金及相应的ApoA5单克隆抗体，在pH7. 2-9. 2的条件下通过磁力搅拌振荡使结合，加入 质量浓度为2-4%牛血清白蛋白BSA作为稳定剂，采用离心法除去未结合的单克隆抗体和 未稳定的胶体金颗粒及凝集物，在离心管底部的深红色沉淀为胶体金一 Ap〇A5单克隆抗体 复合物。
[0013] 所述抗ApoA5的抗体为单克隆抗体对。
[0014] 所述抗Ap〇A5单克隆抗体用纯化的Ap〇A5免疫BALB/c小鼠，得到抗原刺激的脾 脏细胞，融合该脾脏细胞和小鼠的骨髓瘤细胞系SP2/0 ;利用HAT选择培养基选择杂交瘤细 胞，并利用ELISA方法筛选鉴定产生抗Ap〇A5抗体的细胞；进行三次克隆化后得到分泌高 特异性的单克隆抗体的细胞株，保存所筛选到的产生与Ap 〇A5高特异性结合的单抗的细胞 株，通过小鼠腹水生产抗ApoA5的单抗。再利用Protein A-SePharose亲和层析柱进一步 纯化腹水中抗ApoA5的单抗，ELISA及Western-Blot鉴定分离纯化的单克隆抗体。
[0015] 抗Ap〇A5单抗隆抗体对的筛选，主要采用抑制法筛选高亲和力的亚克隆，进而在 多次克隆化和ELISA相加实验结果的基础上进行竞争抑制表位分析和亲和力的测定，得到 不同表位的单抗细胞株，进一步生产腹水并纯化得到多量抗体，进行单株标记，采用ELISA 直接法进行标记抗体的工作浓度滴定，然后采用ELISA竞争抑制法进行单标抗体表位测 定，从而筛选出高效亲和力的三明治抗体对。
[0016] 本发明所提供的用于诊断高甘油三酯血症（HTG)检测试剂板，是以Ap〇A5作为生 化指标来诊断HTG。这包括制备上述Ap 〇A5的单克隆抗体对的方法，以及利用胶体金标记 抗体和免疫层析方法来检测血液或血清中的Ap〇A5的浓度。具体来说，就是利用金标记 抗ApoA5单抗作为第一抗体，用来捕捉抗原；精确呈横条状分布于免疫层析膜上的未标记 Ap 〇A5单克隆抗体用来识别抗原，通过显示免疫层析膜上的条纹，结合胶体金定量检测仪， 来判定检测样品中的Ap 〇A5的含量，从而筛选和诊断HTG。
[0017] 与现有指标和技术相比，本发明有突出的优点和实用性：
[0018] 1、检测特异性强而实用。Ap〇A5属于ApoAI/CIII/AIV基因群，在肝脏表达，与HDL/ VLDL有关。Ap 〇A5基因启动子的单核苷酸变异（SNP)直接影响甘油三酯水平。载脂蛋白A5 作为高甘油三酯血症的病因诊断指标具有很高的敏感性和特异性。本发明避免了目前市场 上的同类产品只能单纯表现结果，却不能明确说明病因的缺点。高甘油三酯血症一经查出 是Ap 〇A5基因突变原因引起，即可针对病因进行相应治疗，从而从根本上解决高甘油三酯 血症及其引发的相关疾病的预防和治疗。
[0019] 2、检测定量而快速。本发明根据胶体金颗粒在特定的波长下，对光的吸收和散射 与胶体金颗粒的量相关这一特性，通过仪器中的光电传感器检测胶体金颗粒对光的吸收和 散射，从而获得待检样本中的抗原含量，从而实现检测试剂由传统的定性、半定量提升为全 定量产品。本系统整个检测时间较国内其他定量检测大为缩短，从仪器的启动到采血到出 结果输出，可在15分钟内完成，随后医生可对患者做出诊断及治疗方案。
[0020] 本发明将两项高科技技术（检测试剂+定量仪器）有效结合，实现了 P0CT(Point-0f-Care Testing床边检测）快速"定量"的目标，实现了测试数据的有效、准 确统计分析和临床应用，填补国内空白，且可完全替代进口。
[0021] 3、本发明改变了对HTG筛选和诊断必须由专业人员或专用仪器才能进行检测的 局限性。试剂板操作简单，样本可为全血、血清或血浆，即可直接用指血检测；胶体金定量检 测仪携带方便、操作简便。

【专利附图】

【附图说明】
[0022] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
[0023] 图1为本发明的平面结构区域图。
[0024] 图2为本发明的纵切面结构图。
[0025] 图中：1、样品吸收区；2、金标单抗区；3、固相化抗体区；4、吸水区；5、底板和一层 PVC片材；6、固相化Ap 〇A5单抗免疫层析膜；7、金标Ap〇A5单抗复合物的聚酯膜；8、样品吸 收区，8a为一层玻璃纤维纸、8b为一层滤膜；9、一层吸水纸组成的吸水区。
[0026] 图3为本发明的ApoA5浓度与胶体金显色条纹强度的曲线图。

【具体实施方式】
[0027] 结合附图对本发明作进一步的描述。
[0028] 如图1、图2所示，一种用于诊断高甘油三酯血症的检测试剂板，包括胶体金标记 的载脂蛋白A5(ApoA5)单克隆抗体及未标记的ApoA5单克隆抗体、羊抗鼠IgG抗体、聚乙烯 板、聚氯乙烯衬膜、滤膜、玻璃纤维纸、聚酯膜、免疫层析膜和吸水纸组成。
[0029] 如图1所示，检测试剂板水平面自下而上依次为：样品吸收区1、金标单抗区2、 固相化抗体区3,和吸水区4 ;如图2所示，由聚乙烯板及聚氯乙烯衬膜组成的底板和一层 PVC片材5,由一层玻璃纤维纸8a和一层滤膜8b组成的样品吸收区8, 一层吸水纸组成的 吸水区9,其特征在于：金标单抗区为：将胶体金标记的Ap〇A5单克隆抗体均匀喷洒于单位 面积的聚酯膜上组成的金标一 Ap〇A5单抗复合物的聚酯膜7 ;固相化抗体区为：将未标记的 ApoA5单克隆抗体和羊抗鼠IgG抗体固定在单位面积的免疫层析膜上组成的固相化ApoA5 单抗免疫层析膜。
[0030] 实施例一，高甘油三酯血症（HTG)诊断检测试剂板的生产方法：
[0031] 1、ΑροΑ5的单克隆抗体对的制备
[0032] 用纯化的ApoA5作为抗原分别免疫BALB/c小鼠，间隔21天免疫第二次，以后每间 隔10天免疫一次，共免疫3 - 4次，然后取出免疫小鼠的脾脏细胞，用PEG将该脾脏细胞与 小鼠的骨髓瘤细胞系SP2/0进行融合，利用HAT选择性培养基在96孔细胞培养板上筛选杂 交瘤细胞，用ELISA方法鉴定抗Ap 〇A5的细胞株，进行三次克隆化后得到稳定分泌高特异性 单克隆抗体的细胞株，在相同抗原包被板上采用ELISA抑制法，即参照组中加入细胞培养 上清，在抑制组加入细胞培养上清和抗原混合物，比较两组0D值差异从而筛选出高亲和力 的亚克隆。然后在间接ELISA实验上进行相加法表位分析，即参照组中分别加入两个单株 细胞培养上清，测定组中同时加入两株细胞培养上清，比较两组0D值（心、4和4 +2)，通过 下面公式计算：
[0033] AI= 2Al + 2 -1 X 100% Αι+Α.
[0034] 在比较计算结果的基础上进行表位分析和亲和力的测定，ΑΙ值小于50%为相加 阴性，即两细胞株分泌的抗体识别抗原的表位相同，ΑΙ值大于50%为相加阳性，表示两细 胞株之间无竞争，即两细胞株分泌的抗体识别抗原的两个不同的表位，从而初步得到针对 抗原不同表位的单抗细胞株。进一步将得到的单抗细胞株分别注射入小鼠腹腔进行腹水生 产，利用Protein A-Sepharose亲和层析柱纯化腹水得到多量单克隆抗体，用HRP酶对纯化 的抗体进行单株标记，用ELISA直接法进行标记抗体的工作浓度滴定，然后用ELISA竞争抑 制法在参照组中加入酶标抗体，在测定组中加入酶标抗体和未标记待测抗体混合物，比较 两组0D值，参照组0D值大于测定组0D值的表示存在竞争抑制，视为两抗体识别抗原的表 位相同。反之，两抗体不存在竞争抑制时视为两抗体识别抗原的表位不同，从而最终筛选得 到高效亲和力的三明治抗体对。
[0035] 2、胶体金标记抗ApoA5单克隆抗体的方法
[0036] 分别取适量半径为40nm的胶体金及相应的ApoA5单克隆抗体，在pH8. 0的条件下 通过磁力搅拌振荡使结合，加入质量浓度为3%的牛血清白蛋白BSA作为稳定剂，采用离心 法除去未结合的单克隆抗体和未稳定的胶体金颗粒及凝集物，在离心管底部的深红色沉淀 为胶体金一 Ap〇A5单克隆抗体复合物。
[0037] 3、将金标抗体复合物喷涂于聚酯膜上
[0038] 用聚乙二醇洗涤胶体金一单克隆抗体复合物，离心除去上清液，得到深红色沉淀， 纯化后的沉淀用缓冲液溶解，用喷涂设备涂于聚酯膜上，烘干。
[0039] 4、免疫层析膜的包被
[0040] 用纯化的抗ApoA5单克隆抗体对中的另一单抗溶液和羊抗鼠IgG抗体溶液用喷涂 设备于硝酸素纤维膜上划线，线的长度为3mm，每条线在3mm宽的硝酸素纤维膜上的滴加量 为5- 7ng。二种抗体由下至上分别为ApoA5和羊抗鼠IgG抗体，每条线间隔3mm。包被好 的免疫层析膜用质量浓度为3 % BSA溶液进行封闭。
[0041] 5、试剂板装备
[0042] 塑料聚乙烯板作为支撑载体，上面粘有一层聚氯乙烯片材作为衬膜，由下至上由 一层滤膜和一层玻璃纤维组成的样品吸收区，其次是三层吸附了胶体金一单抗复合物的聚 酯膜。然后是硝酸纤维膜，最上一层是吸水层，由一层滤纸组成，外面用特制胶带包封。
[0043] 实施例二，HTG诊断检测试剂板的使用方法：
[0044] 1、试剂板的使用
[0045] 对全血的检测：用滴管取指血100ul滴入检测板的孔中，8 - 12分钟观察结果。出 现两条带时为阳性。只有一条带时为阴性。一条带都无时表示检测板失效。
[0046] 对血清、血浆的检测：用滴管取离心好的血清、血浆100ul垂直滴入检测板的孔 中，8 - 12分钟观察结果。出现两条带时为阳性。只有一条带时为阴性。一条带都无时表 不检测板失效。
[0047] 2、上机定量检测，分即时和全时间两种方式：
[0048] 即时方式：血样滴入试剂板后，即把试剂板插到仪器中，手动启动应用程序进行 测试。
[0049] 全时间方式：血样放到试剂板后，操作员自己定时15分钟后。把血样试剂板插到 仪器中，自动启动应用程序进行测试。
[0050] 3、检测流程：
[0051] 1)把血样滴入试剂板，反应后的测试样品放入暗室；
[0052] 2)打开测试程序并输入相关信息然后点击即时测试或全时间测试；
[0053] 3)系统分析，标记并计算测试样品试验数据；
[0054] 4)测试结果输出。
[0055] 4、制定标准曲线
[0056] 把含有0、31、63、125、250、5001^/1111的4?(^5标准抗原分别滴入试剂板，应用本公 司生产的胶体金定量检测仪（型号JH-2)，将试剂板放入暗室，打开测试程序并输入相关信 息然后点击即时测试，记录胶体金试剂板检测线的显色强度数据，以Ap 〇A5浓度（ng/ml)为 横坐标，条纹显色强度为纵坐标，绘制标准曲线。
[0057] 产品批量生产时，每批次的产品都须制备相应的标准曲线，提供给产品使用者。
[0058] 5、测定血清中的ApoA5浓度
[0059] 把适当倍数稀释的待检测血清滴入试剂板，应用本公司生产的胶体金定量检测仪 (型号JH-2)，将试剂板放入暗室，打开测试程序并输入相关信息然后点击即时测试，记录 胶体金试剂板检测线的显色强度数据，根据上述标准曲线，计算求得血清中Ap〇A5的浓度 值。如果设定为自动模式，检测仪将自动记录、计算，并打印报告检测结果。
[0060] 6、结果判定
[0061] 根据Ap〇A5作为高甘油三酯血症（FHTG)病因诊断指标的截断值（cut off 值）215ng/ml，浓度低于该值的可判定为ApoA5缺乏，有高甘油三酯血症的危险；或可判定 Ap〇A5基因突变为高甘油三酯血症的主要病因。在胶体金定量检测仪自动模式下，Ap 〇A5的 检测浓度值与预设的Cutoff值进行比较并自动报告高甘油三酯血症的判定结果。
【权利要求】
1. 一种用于诊断高甘油三酯血症的检测试剂板，包括胶体金标记的载脂蛋白 A5(ApoA5)单克隆抗体及未标记的ApoA5单克隆抗体、羊抗鼠IgG抗体、聚乙烯板、聚氯乙 烯衬膜、滤膜、玻璃纤维纸、聚酯膜、免疫层析膜和吸水纸组成。检测试剂板水平面自下而 上依次为：样品吸收区、金标单抗区、固相化抗体区和吸水区，样品吸收区铺设的为在聚乙 烯板及聚氯乙烯衬膜上铺设滤膜和玻璃纤维纸，吸水区为吸水纸，其特征在于：金标单抗区 为：将胶体金标记的Ap 〇A5单克隆抗体均匀喷洒于单位面积的聚酯膜上；固相化抗体区为： 将未标记的ApoA5单克隆抗体和羊抗鼠IgG抗体固定在单位面积的免疫层析膜上。
2. 如权利要求1所述的用于诊断高甘油三酯血症检测试剂板，其特征在于所述的胶体 金标记ApoA5单克隆抗体的制备方法：分别取半径为20-60nm的胶体金及相应的ApoA5单 克隆抗体，在PH7. 2-9. 2的条件下通过磁力搅拌振荡使结合，加入质量浓度为2-4%牛血清 白蛋白BSA作为稳定剂，采用离心法除去未结合的单克隆抗体和未稳定的胶体金颗粒及凝 集物，在离心管底部的深红色沉淀为胶体金一 Ap〇A5单克隆抗体复合物。
3. 如权利要求1所述的用于诊断高甘油三酯血症检测试剂板，其特征在于所述的检测 试剂板与胶体金显色定量检测仪配合使用，并与预设的Cutoff值进行比较并自动报告检 测结果，实现了 Ap〇A5胶体金快速定量检测分析，避免了胶体金显色用肉眼判断引起的漏 判误判，提高了 Ap〇A5检测的灵敏性。
【文档编号】G01N33/577GK104215764SQ201410362304
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年7月28日 优先权日:2014年7月28日
【发明者】钱金宏, 廖园园 申请人:武汉璟泓万方堂医药科技股份有限公司