专利名称：分枝杆菌菌种检测膜条及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分枝杆菌菌种检测领域，尤其涉及一种分枝杆菌菌种检测膜条及试剂
品.O
背景技术：
根据国际分枝杆菌分类工作组研究确定，将分枝杆菌分为三大类(Rimyon分类 法)一、缓慢生长菌群1.结核菌群包括人型结核杆菌，牛型结核杆菌，非洲分枝杆菌，田鼠分枝杆菌。2. I群光产色菌。特点是在暗处培养时菌落颜色不明显，在增殖期接触光线1小时 后菌落呈林柠檬色。如堪萨斯、海分枝杆菌等。3. II群暗产色菌。特点是在暗处培养时菌落呈橘黄色，S型。长期暴光则呈赤橙 色。如瘰疠、戈氏分枝杆菌。4. III群不产色菌。特点是一般无色素产生。如鸟型、胞内、溃疡分枝杆菌等。二、迅速生长菌即IV群菌，特点是快速生长。包括偶发、龟、耻垢分枝杆菌等。三、需要特殊营养菌包括麻风分枝杆菌、鼠麻风分枝杆菌、副结核分枝杆菌。Rimyon分类法中的I、II、III、IV群分枝杆菌又称为非结核分枝杆菌 (nontuberculosis mycobacteria NTM)。结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌以外的非结核分枝杆菌(NTM)引起的疾病称为非 结核分枝杆菌病，可累及淋巴结、皮肤、软组织和肺。非结核分枝杆菌感染肺脏，引起肺部病 变称为非结核分枝杆菌肺病。非结核分枝杆菌(NTM)在世界上报道的有150多种，其中命 名了 54种，有致病性的分枝杆菌有37种，中国境内分离出了 20多种。NTM是一种环境分枝杆菌，大部分是腐物寄生菌，主要存在于自然环境中，现在普 遍被接受的观点是，人可从环境中感染NTM而患病，水和土壤是重要的传播途径，人与人之 间传播尚未得到证实，但可以通过动物传染给人。世界各国由于地理、环境、气候的不同，各国经济、文化水平、医疗技术水平的差异 和对疾病的调查方法、标准不同，NTM病流行情况千差万别，但目前几乎是结核病倾向减少， NTM病有逐渐增加趋势。1979年我国第一次结核病流行病学抽样调查显示，8省市52万人痰菌培养阳性 681份，经菌种鉴定29株为NTM，分离率为4. 3%。1990年第三次全国结核病流行病学抽样 调查结果显示，NTM感染率为15. 35%，浙江省最高为44. 89%。2000年全国流调中NTM菌 株占11. 1%。非结核分枝杆菌致病性有如下特点(1)老年人身患多种疾病易发病。非结核分枝杆菌通常作为继发性或伴随性疾病，感染具有机会性是此菌致病性的一个显著特点。往往在慢性阻塞性肺疾病、老年人、恶性 肿瘤病人、肾透析、脏器移植时接受免疫抑制剂以及应用肾上腺皮质激素者，本病发生率增 加。(2)致病性低。一般认为NTM对人类的致病性比结核分枝杆菌低。刘敬东认为，全 国感染NTM者估计在1亿以上，但发病者仅百余例。我病区同时期有9例患者使用呼吸机， 其中8例患者从痰中检测到抗酸杆菌，通过结核菌培养加菌种鉴定，其中7例患者无结核复 合群。这8例患者中仅1例有明确的肺部阴影。(3)临床症状差异较大。一般认为NTM引起的肺部病变与肺结核十分相似，症状 大多较轻，缺少特征性。一般表现为咳嗽、咳痰、低热和疲乏或偶有咯血，有些患者无明显临 床症状和体征。因多数患者有肺部基础疾病，蓁咳嗽、咳痰的症状往往被误诊为基础疾病所 致。(4)艾滋病及HIV感染者多发。在美洲和欧洲艾滋病病人中，发现50%患者感染 分枝杆菌，其中10% 15%为鸟-胞内复合群分枝杆菌。(5)耐药率高。有报道非结核分枝杆菌的耐药率为95. 9% ；耐多药率为83. 7%。由于分支杆菌耐药率高，在疾病检测过程中菌种鉴定的作用尤为重要，鉴定所感 染菌种可以更好的指导用药。目前国内外的分枝杆菌菌种检测试剂盒主要存在检测范围偏小，容易漏检的缺
点o
发明内容
为解决上述问题，本发明的主要目的在于提供一种可一次检测23中分枝杆菌类 型，且检测时间短，结果准确可信的分枝杆菌菌种检测膜条。为达到上述目的，本发明采用如下技术方案—种分枝杆菌菌种检测膜条，包括一基底，和固定于所述基底上的特异性寡核苷 酸探针，所述特异性寡核苷酸探针包括1)用于检测耻垢分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO :1或 SEQ ID NO 26-28任意一项所示；2)用于检测胞内分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 2或 SEQ ID NO 29-31任意一项所示；3)用于检测堪萨斯分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 3 或SEQ ID NO 32-33任意一项所示；4)用于检测龟分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID N0:4或 SEQ ID NO 34-38任意一项所示；5)用于检测海分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO :5或 SEQ ID NO 39-41任意一项所示；6)用于检测偶发分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 6或 SEQ ID NO 42-45任意一项所示；7)用于检测土分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO :7或 SEQ ID NO 46-48任意一项所示；
8)用于检测不产色分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 8 或SEQ ID NO 49-50任意一项所示；9)用于检测结核分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 9或 SEQ ID NO 51-53任意一项所示；10)用于检测鸟分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO :10或 SEQ ID NO 54-56任意一项所示；11)用于检测瘰疬分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 11 或SEQ ID NO 57-58任意一项所示；12)用于检测脓肿分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 12 或SEQ ID NO 59-61任意一项所示；13)用于检测蟾蜍分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 13 或SEQ ID NO 62-64任意一项所示；14)用于检测浅黄分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 14 或SEQ ID NO 65-67任意一项所示；15)用于检测草分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO :15或 SEQ ID NO 68-70任意一项所示；16)用于检测戈登分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 16 或SEQ ID NO 71-73任意一项所示；17)用于检测次要分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 17 或SEQ ID NO 74-75任意一项所示；18)用于检测金色分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 18 所示或SEQ ID NO 76-78任意一项所示；19)用于检测胃/溃疡分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ IDN0 19或SEQ ID NO 79-80任意一项所示；20)用于检测母牛分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 20 或SEQ ID NO 81-82任意一项所示；21)用于检测苏尔加分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ IDN0 21或SEQ ID NO 83-84任意一项所示；22)用于检测迪氏分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 22 或SEQ ID NO 85-86任意一项所示；23)用于检测猿猴分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 23 或SEQ ID NO 87-89任意一项所示；上述所有序列可由其碱基互补序列替换。所述基底为尼龙膜。一种分枝杆菌菌种检测试剂盒，所述试剂盒包括1)用于检测耻垢分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO :1或 SEQ ID NO 26-28任意一项所示；2)用于检测胞内分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 2或 SEQ ID NO 29-31任意一项所示；
3)用于检测堪萨斯分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 3 或SEQ ID NO 32-33任意一项所示；4)用于检测龟分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO :4或 SEQ ID NO 34-38任意一项所示；5)用于检测海分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO :5或 SEQ ID NO 39-41任意一项所示；6)用于检测偶发分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 6或 SEQ ID NO 42-45任意一项所示；7)用于检测土分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO :7或 SEQ ID NO 46-48任意一项所示；8)用于检测不产色分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 8 或SEQ ID NO 49-50任意一项所示；9)用于检测结核分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 9或 SEQ ID NO 51-53任意一项所示；10)用于检测鸟分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO :10或 SEQ ID NO 54-56任意一项所示；11)用于检测瘰疬分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 11 或SEQ ID NO 57-58任意一项所示；12)用于检测脓肿分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 12 或SEQ ID NO 59-61任意一项所示；13)用于检测蟾蜍分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 13 或SEQ ID NO 62-64任意一项所示；14)用于检测浅黄分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 14 或SEQ ID NO 65-67任意一项所示；15)用于检测草分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO :15或 SEQ ID NO 68-70任意一项所示；16)用于检测戈登分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 16 或SEQ ID NO 71-73任意一项所示；17)用于检测次要分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 17 或SEQ ID NO 74-75任意一项所示；18)用于检测金色分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 18 所示或SEQ ID NO 76-78任意一项所示；19)用于检测胃/溃疡分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ IDN0 19或SEQ ID NO 79-80任意一项所示；20)用于检测母牛分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 20 或SEQ ID NO 81-82任意一项所示；21)用于检测苏尔加分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ IDN0 21或SEQ ID NO 83-84任意一项所示；22)用于检测迪氏分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 22或SEQ ID NO 85-86任意一项所示；23)用于检测猿猴分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 23 或SEQ ID NO 87-89任意一项所示；上述所有序列可由其碱基互补序列替换；24)特异性扩增分枝杆菌16S rRNA和23S rRNA之间插入序列的引物，其碱基序列 如 SEQ ID NO 24-25 所示。所述寡核苷酸探针固定于基底上。所述寡核苷酸探针固定于尼龙膜上。本发明根据不同的分枝杆菌的16S rRNA和23S rRNA之间的插入序列的不同，经 过大量的基因序列比对和筛选，对每种分枝杆菌设计了 3-6条探针，从这些探针种分别选 取一种效果最好的探针作为该分枝杆菌的鉴定检测探针。设计的探针如下 通过大量的不同探针之间的组合实验，最终确定优选的一种探针组合形式(从每 种探针种挑选一条探针作为最优的探针组合，每个组合有23条探针)，通过探针的筛选，不 仅能够消除探针之间的交叉反应而且又能准确区分每一种分枝杆菌。本发明所述引物的设计原则及筛选方法细菌rRNA按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。16S rRNA和23SrRNA 是细菌染色体上编码16S rRNA和23S rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌染色体基 因中，它的内部结构由保守区及可变区两部分组成。其分子内存在的可变区，显示出细菌不 同分类等级水平上的特异性。因此，可以根据分枝杆菌16S rRNA、23S rRNA及16S rRNA和23S rRNA之间的插入序列(ITS序列)的可变区的特异性来区分不同种的分枝杆菌，以达到 鉴定不同分枝杆菌菌种的目的。从原理上来讲这三个区域都可以作为分枝杆菌菌种区分鉴 定的可选区域，但是，16S rRNA区域上基因序列胶保守，不同分枝杆菌之间的差异较小，所 以存在有些分枝杆菌无法区分的情况，对于设计特异的检测探针有难度。而对于23S rRNA 的研究信息量较少，而且在该区域上的基因序列的变化差异较大，对于同种分枝杆菌的序 列差异也很大，所以在特异性探针设计上也存在难度。而16S rRNA和23S rRNA之间的插 入序列(ITS序列)的变异区可以充分区分各种分枝杆菌，是进行分枝杆菌的菌种鉴定最理 想的区域，因此，我们的产品也选取16S rRNA和23S rRNA之间的插入序列(ITS序列)作 为我们的目的基因片段。根据分枝杆菌的16S rRNA和23S rRNA之间的插入序列所处的特殊位置，我们选 取16S rRNA的保守区作为上游引物的设计区域，同时选取23S rRNA的保守区作为下游引 物的设计区域，根据公知技术引物设计原则分别设计四条上游引物和四条下游引物，通过 试验选取其中扩增效率最高的一对引物作为该专利技术使用引物。设计的四对引物如下 其中扩增效果最好的一对引物如下 本发明根据分枝杆菌16S rRNA和23S rRNA的保守区域来设计特异的扩增引物，根据不同的分支杆菌16S rRNA和23S rRNA之间的插入序列设计相应的探针，利用杂交进 行菌种检测。 本发明所述分枝杆菌菌种基因检测试剂盒采用PCR结合反向DNA杂交芯片检测技 术，能够在一天时间内同时鉴定23种分枝杆菌，该技术是目前能同时鉴定分枝杆菌种类最 多的，时间最短，检测结果最可靠的新技术。本发明所述试剂盒通过不同分枝杆菌的基因序 列的差异来区分分枝杆菌，从细菌的基因序列和分子结构水平来区分和鉴定，分类更准确， 更可靠。解决了传统鉴定方法中通过细菌的生长形态来鉴定所存在的鉴定所需时间长达 4-6周，结果无法判断，鉴定种类少和对部分分枝杆菌存在漏检的问题。
图1是耻垢分枝杆菌(MSM)检测结果图2是胞内分枝杆菌(MIN)检测结果图3是堪萨斯分枝杆菌(MKA)检测结果图4是龟分枝杆菌(MCH)检测结果图5是海分枝杆菌(MMA)检测结果图6是偶发分枝杆菌(MF0)检测结果图7是土分枝杆菌(MIE)检测结果图8是不产色分枝杆菌(MN0)检测结果图9是结合分枝杆菌(MTC)检测结果图10是鸟分枝杆菌(MAV)检测结果图11是瘰疬分枝杆菌(MSC)检测结果图12是脓肿分枝杆菌(MAB)检测结果图13是蟾蜍分枝杆菌(MXE)检测结果图14是浅黄分枝杆菌(MGI)检测结果图15是草分枝杆菌(MPH)检测结果图16是戈登分枝杆菌(MG0)检测结果图17是次要分枝杆菌(MTR)检测结果图18是金色分枝杆菌(MAU)检测结果图19是胃/溃疡分枝杆菌(MGA)检测结果图
图20是母牛分枝杆菌(MUA)检测结果图21是苏尔加分枝杆菌(MSZ)检测结果图22是迪氏分枝杆菌(MDI)检测结果图23是猿猴分枝杆菌(MSI)检测结果图。
具体实施例方式实施例1 一种分枝杆菌菌种检测膜条包括一基底，和固定于所述基底上的特异性寡核苷酸探针，所述特异性寡核苷酸 探针包括1)用于检测耻垢分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO :1所不；2)用于检测胞内分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO :2所 示；3)用于检测堪萨斯分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 3 所示；4)用于检测龟分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO :4所 示；5)用于检测海分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO :5所 示；6)用于检测偶发分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO :6所 示；7)用于检测土分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO :7所 示；8)用于检测不产色分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 8 所示；9)用于检测结核分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO :9所 示；10)用于检测鸟分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO :10所 示；11)用于检测瘰疬分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 11 所示；12)用于检测脓肿分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 12 所示；13)用于检测蟾蜍分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 13 所示；14)用于检测浅黄分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 14 所示；15)用于检测草分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO :15所 示；16)用于检测戈登分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 16 所示；17)用于检测次要分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 17 所示；18)用于检测金色分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 18 所示；19)用于检测胃/溃疡分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ IDN0 19所示；20)用于检测母牛分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 20 所示；
21)用于检测苏尔加分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ IDN0 21所示；22)用于检测迪氏分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 22 所示；23)用于检测猿猴分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 23 所示；探针固定方法将探针和1M NHS、1M DEC混合处理，利用DNA点样仪在芯片制作 程序的控制下进行点样，点样完毕后将探针可通过与尼龙膜表面经处理而含有的活性基团 (氨基、巯基)形成共价键的方法固定于尼龙膜上，探针固定量为是5uM的探针溶液点样 lul后风干。实施例2 —种分枝杆菌菌种检测试剂盒所述试剂盒包括固定有特异性寡核苷酸探针尼龙膜和特异性扩增分枝杆菌16S rRNA和23S rRNA之间插入序列的引物，其碱基序列如 SEQ IDNO 24-25 所示；尼龙膜条上固定的特异性寡核苷酸探针包括1)用于检测耻垢分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO :1所 示；2)用于检测胞内分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO :2所 示；3)用于检测堪萨斯分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 3 所示；4)用于检测龟分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID N0:4所 示；5)用于检测海分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID N0:5所 示；6)用于检测偶发分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO :6所 示；7)用于检测土分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO :7所 示；8)用于检测不产色分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 8 所示；9)用于检测结核分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO :9所 示；10)用于检测鸟分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO :10所 示；11)用于检测瘰疬分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 11 所示；12)用于检测脓肿分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 12 所示；
13)用于检测蟾蜍分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 13 所示；14)用于检测浅黄分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 14 所示；15)用于检测草分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO :15所 示；16)用于检测戈登分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 16 所示；17)用于检测次要分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 17 所示；18)用于检测金色分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 18 所示；19)用于检测胃/溃疡分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ IDN0 19所示；20)用于检测母牛分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 20 所示；21)用于检测苏尔加分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ IDN0 21所示；22)用于检测迪氏分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 22 所示；23)用于检测猿猴分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO 23 所示。实施例3用实施例2所述检测试剂盒对临床样品进行检测，所需试剂20XSSC pH 7. 0NaCl175. 3g柠檬酸钠88. 2g加吐0 750mL溶解，用pH计调pH至7. 0，最后定容至lOOOmL，并高压灭菌保存。10% SDS pH 7. 0SDS20g加H20 180mL 溶解，用 pH 计调 pH 至 7. 0，最后定容至200mL。A 液(1XSSC，0. SDS, pH 7. 4)20XSSC 100mL10% SDS lOmL力卩H20 定容至 1000mL。B 液(0. 5 X SSC, 0. 1% SDS, pH 7. 4)20 X SSC 25mL
170187]10% SDS 10mL
0188]加H20定容至lOOOmL。
0189]C 液(0. 1M 柠檬酸钠，pH 5. 4)
0190]1M柠檬酸钠lOOmL
0191]加H20 定容至 lOOOmL。
0192]显色液(新鲜配制使用，按顺序加入以下溶液)
0193]C 液19mL
0194]TMBlmL30% H202 2 u L1.从临床样本中提取分支杆菌基因组DNA从临床样本中提取分枝杆菌基因组DNA可采用亚能生物技术(深圳)有限公司的 分枝杆菌DNA快速提取试剂盒来提取，具体的提取方法参照《分枝杆菌DNA快速提取试剂盒 操作说明书》。同时也可以采用其它的方法或者其它公司的试剂盒来提取分枝杆菌基因组 DNA，只需提取的DNA量能达到本产品的检测要求即可。痰样中分枝杆菌DNA的提取1)收集临床痰样，加入等量的化痰试剂(4%的NaOH)，充分振荡化痰处理15 30 分钟，直至痰液完全液化。(注如果痰样很浓呈干酪状，则加入两倍量的化痰试剂。)2)转移1. 2mL痰样消化液到1. 5mL离心管中，12000转/分钟，离心5分钟，弃上清。3)加入lmL M洗液，充分混勻，12000转/分钟，离心2分钟，弃上清。4)加入50④L M裂解液，充分混勻，于沸水中煮10分钟(注意离心管管盖可能会 爆开，小心污染)。5) 12000转/分钟，离心2分钟，上清液即可作为PCR模板。2. PCR 扩增取出PCR反应管，在管壁上做好标记，于5000rpm离心2秒后加入4④L样品上清 液作为PCR扩增模板。每次实验，必须设置一个阳性对照和一个阴性对照，即各以4④L阳 性对照DNA和裂解液为模板。按以下条件进行扩增 3.杂交取15mL塑料离心管，放入标有患者编号的膜条，加入A液5_6mL及所有(25 y L) PCR产物，将盖拧紧，混勻PCR产物，再将离心管盖稍拧松，以避免加热时管盖爆开。将离心管放入沸水中加热10分钟(确保杂交液液面完全位于沸水液面之下)，取出拧紧盖子，放入 杂交箱57°C杂交1. 5到4小时。同时取50mL塑料管，加入40mL B液于杂交箱或水浴箱中 进行预热至57 °C。对照另外取两张膜条分别与阴性对照PCR产物和阳性对照PCR产物杂交，方法同上。4.洗膜取出膜条，移至装有预热B液的50mL塑料管中，于57°C轻摇洗涤15分钟(每管 40mL溶液，最多可同时洗涤6张膜条)。5.显色用A液配制1 2000的POD溶液(单做两张膜只需4 y L POD母液，配制成8mL 使用液，做四张膜可用6 y L POD母液，配制成12mL使用液)，室温轻摇浸泡30分钟，弃去 POD溶液。用A液室温轻摇洗两次，每次5分钟。用C液室温洗膜1-2分钟，同时配制显色 液(显色液需新鲜配制，配法见上一页)。将膜条浸泡于显色液中避光显色10 15分钟即 可观察结果。6.结果判定实验的每张膜条在PC位点处均应有蓝色斑点出现，此时结果的判读视为有效；阴 性对照的杂交膜条除PC位点有蓝色斑点外，其它位点均不应显色，否则有可能是发生污染 或实验不成功。膜条上探针排列顺序 膜条上各位点代表的意义 由斑点显现的位置即可判断患者所感染分杆菌的类型。图1显示感染分枝杆菌的类型是耻垢分枝杆菌(MSM)。图2显示感染分枝杆菌的类型是胞内分枝杆菌(MIN)。图3显示感染分枝杆菌的类型是堪萨斯分枝杆菌(MKA)。图4显示感染分枝杆菌的类型是龟分枝杆菌(MCH)。图5显示感染分枝杆菌的类型是海分枝杆菌(MMA)。图6显示感染分枝杆菌的类型是偶发分枝杆菌(MF0)。图7显示感染分枝杆菌的类型是土分枝杆菌(MIE)。图8显示感染分枝杆菌的类型是不产色分枝杆菌(MN0)。图9显示感染分枝杆菌的类型是结合分枝杆菌(MTC)。图10显示感染分枝杆菌的类型是鸟分枝杆菌(MAV)。图11显示感染分枝杆菌的类型是瘰疬分枝杆菌(MSC)。图12显示感染分枝杆菌的类型是脓肿分枝杆菌(MAB)。图13显示感染分枝杆菌的类型是蟾蜍分枝杆菌(MXE)。图14显示感染分枝杆菌的类型是浅黄分枝杆菌(MGI)。图15显示感染分枝杆菌的类型是草分枝杆菌(MPH)。图16显示感染分枝杆菌的类型是戈登分枝杆菌(MG0)。图17显示感染分枝杆菌的类型是次要分枝杆菌(MTR)。图18显示感染分枝杆菌的类型是金色分枝杆菌(MAU)。图19显示感染分枝杆菌的类型是胃/溃疡分枝杆菌(MGA)。图20显示感染分枝杆菌的类型是母牛分枝杆菌(MUA)。图21显示感染分枝杆菌的类型是苏尔加分枝杆菌(MSZ)。图22显示感染分枝杆菌的类型是迪氏分枝杆菌(MDI)。图23显示感染分枝杆菌的类型是猿猴分枝杆菌(MSI)。
权利要求
一种分枝杆菌菌种检测膜条，包括一基底，和固定于所述基底上的特异性寡核苷酸探针，其特征在于所述特异性寡核苷酸探针包括1)用于检测耻垢分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO1或SEQ ID NO26-28任意一项所示；2)用于检测胞内分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO2或SEQ ID NO29-31任意一项所示；3)用于检测堪萨斯分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO3或SEQ ID NO32-33任意一项所示；4)用于检测龟分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO4或SEQ ID NO34-38任意一项所示；5)用于检测海分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO5或SEQ ID NO39-41任意一项所示；6)用于检测偶发分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO6或SEQ ID NO42-45任意一项所示；7)用于检测土分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO7或SEQ ID NO46-48任意一项所示；8)用于检测不产色分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO8或SEQ ID NO49-50任意一项所示；9)用于检测结核分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO9或SEQ ID NO51-53任意一项所示；10)用于检测鸟分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO10或SEQ ID NO54-56任意一项所示；11)用于检测瘰疬分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO11或SEQ ID NO57-58任意一项所示；12)用于检测脓肿分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO12或SEQ ID NO59-61任意一项所示；13)用于检测蟾蜍分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO13或SEQ ID NO62-64任意一项所示；14)用于检测浅黄分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO14或SEQ ID NO65-67任意一项所示；15)用于检测草分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO15或SEQ ID NO68-70任意一项所示；16)用于检测戈登分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO16或SEQ ID NO71-73任意一项所示；17)用于检测次要分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO17或SEQ ID NO74-75任意一项所示；18)用于检测金色分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO18所示或SEQ ID NO76-78任意一项所示；19)用于检测胃/溃疡分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ IDNO19或SEQ ID NO79-80任意一项所示；20)用于检测母牛分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO20或SEQ ID NO81-82任意一项所示；21)用于检测苏尔加分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ IDNO21或SEQ ID NO83-84任意一项所示；22)用于检测迪氏分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO22或SEQ ID NO85-86任意一项所示；23)用于检测猿猴分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO23或SEQ ID NO87-89任意一项所示；上述所有序列可由其碱基互补序列替换。
2.根据权利要求1所述的一种分枝杆菌菌种检测膜条，其特征在于所述基底为尼龙膜。
3.一种分枝杆菌菌种检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括1)用于检测耻垢分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQID NO :1或SEQ ID NO 26-28任意一项所示；2)用于检测胞内分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQID NO :2或SEQ ID NO 29-31任意一项所示；3)用于检测堪萨斯分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQID N0:3或 SEQ ID NO 32-33任意一项所示；4)用于检测龟分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQID NO :4或SEQ ID NO 34-38任意一项所示；5)用于检测海分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQID NO :5或SEQ ID NO 39-41任意一项所示；6)用于检测偶发分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQID NO :6或SEQ ID NO 42-45任意一项所示；7)用于检测土分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQID NO :7或SEQ ID NO 46-48任意一项所示；8)用于检测不产色分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQID N0:8或 SEQ ID NO 49-50任意一项所示；9)用于检测结核分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQID NO :9或SEQ ID NO 51-53任意一项所示；10)用于检测鸟分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQID N0:10或SEQ ID NO 54-56任意一项所示；11)用于检测瘰疬分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQID N0:11或 SEQ ID NO 57-58任意一项所示；12)用于检测脓肿分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQID N0:12或 SEQ ID NO 59-61任意一项所示；13)用于检测蟾蜍分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQID N0:13或 SEQ ID NO 62-64任意一项所示；14)用于检测浅黄分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQID N0:14或 SEQ ID NO 65-67任意一项所示；15)用于检测草分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQID N0:15或SEQ ID NO 68-70任意一项所示；16)用于检测戈登分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQID N0:16或 SEQ ID NO 71-73任意一项所示；17)用于检测次要分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQID N0:17或 SEQ ID NO 74-75任意一项所示；18)用于检测金色分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQID N0:18所示 或SEQ ID NO 76-78任意一项所示；19)用于检测胃/溃疡分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQIDN0 :19或 SEQ ID NO 79-80任意一项所示；20)用于检测母牛分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQID N0:20或 SEQ ID NO 81-82任意一项所示；21)用于检测苏尔加分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQIDN0 21或 SEQ ID NO 83-84任意一项所示；22)用于检测迪氏分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQID N0:22或 SEQ ID NO 85-86任意一项所示；23)用于检测猿猴分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQID N0:23或 SEQ ID NO 87-89任意一项所示；上述所有序列可由其碱基互补序列替换；24)特异性扩增分枝杆菌16SrRNA和23S rRNA之间插入序列的引物，其碱基序列如 SEQ ID NO 24-25 所示。
4.根据权利要求3所述的一种分枝杆菌菌种检测试剂盒，其特征在于所述寡核苷酸探 针固定于基底上。
5.根据权利要求3所述的一种分枝杆菌菌种检测试剂盒，其特征在于所述寡核苷酸探 针固定于尼龙膜上。
6.一种分枝杆菌菌种检测方法，包括以下步骤1)从样品中提取分枝杆菌基因组DNA;2)以步骤1)所得DNA为模板，利用权利要求3所述特异性扩增分枝杆菌16SrRNA和 23S rRNA之间插入序列的弓丨物进行PCR扩增；3)上述PCR产物与固定在基质上的权利要求3所述探针序列杂交；4)洗膜及显色。
全文摘要
本发明公开了一种分枝杆菌菌种检测试剂盒，包括一膜条，所述膜条上固定有特异性检测23种分枝杆菌的特异性寡核苷酸探针和特异性扩增分枝杆菌16S rRNA和23S rRNA之间插入序列的引物。本发明所述分枝杆菌菌种基因检测试剂盒采用PCR结合反向DNA杂交芯片检测技术，能够在一天时间内同时鉴定23种分枝杆菌，该技术是目前能同时鉴定分枝杆菌种类最多的，时间最短，检测结果最可靠的新技术。本发明所述试剂盒通过不同分枝杆菌的基因序列的差异来区分分枝杆菌，从细菌的基因序列和分子结构水平来区分和鉴定，分类更准确，更可靠。
文档编号C12Q1/68GK101857903SQ20101020689
公开日2010年10月13日 申请日期2010年6月11日 优先权日2010年6月11日
发明者任维, 邹耀东 申请人:亚能生物技术(深圳)有限公司