专利名称：一种用于含油脂污水处理的全细胞脂肪酶制剂的构建方法
技术领域：
本发明涉及应用于含油脂污水处理的活性污泥中微生物改造的技术方法，属于环 境生物技术领域。
背景技术：
随着人民生活水平的不断提高，粮油工业也得到了迅猛的发展。21世纪初，仅我国 具有一定规模的浸出油厂就已经达到2，000多家，并且生产规模还在逐年增加。随之而来 的高浓度油脂废水的排放量也在急剧增加。石油加工业、饭店餐饮业以及生活污水的排放， 更进一步加剧了含油脂废水的泛滥，对环境和人类的健康造成极大的危害。解决含油脂废水污染问题的关键集中在污水的处理技术及其效果上。目前采用的 主要有物理法、化学法和生物法。物理法处理含油脂的污水，主要是利用油脂和水的理化性 质不同实现油水分离，从而达到除去油脂的效果，物理法可以在某种程度上回收利用部分 油脂，但对污水处理而言，油脂去除率低、能耗高；化学法处理含油污水，主要是通过添加化 学试剂对油脂进行降解，从而达到除去油脂的目的，该方法往往需要添加一些化学试剂，不 仅能耗高，而且容易造成化学试剂的二次污染等问题；生物法处理含油脂污水，主要是通过 微生物的降解作用对油脂分解，从而达到除去油脂的目的。生物法已经逐步替代了常规的 物理、化学方法，成为当今世界应对含油脂污水的主要方法。生物法中以脂肪酶制剂进行预处理的应用较为广泛[Jeganathan J，et al. Hydrolyticpretreatment of oily wastewater by immobilized lipase. J Hazard Mater. 2007，145 (1_2) 127-135.]，也有利用产脂肪酶微生物直接应用于含油脂污水处理的 艮道[Chigusa K, et al. Treatment of wastewater from oil manufacturing plant by yeasts. War. Sci. Technol.，1996，34 (1) :51_58]。脂肪酶制剂应用于含油脂污水的处理，是 在污水进行活性污泥法处理前，通过脂肪酶对污水中油脂的水解作用，达到分解污水中油 脂为小分子有机物的目的。这样不仅需要额外添加相应的设备，增加了污水处理的工艺流 程，而且所用的脂肪酶必须经过固定化以改善其酶学性质，这些必然使得污水处理的成本 大大增加。将产脂肪酶微生物直接加入活性污泥中，可以省去添加设备和增加工艺流程的 麻烦，但由于一般产脂肪酶微生物的脂肪酶活性低、性质不佳等原因，以至污水处理中的油 脂去除效率低，污水处理周期长。
发明内容
本发明的目的是提出一种高活力油脂污水处理的全细胞脂肪酶制剂的构建方法。 针对污水中的高浓度油脂的降解，将高活性的脂肪酶展示表达在产脂肪酶的微生物细胞表 面，以提高产脂肪酶微生物中脂肪酶的活性，使脂肪酶在对污水中油脂降解的高效性与产 脂肪酶微生物应用的便捷性结合，解决了单一使用脂肪酶的高成本问题和单一使用产脂肪 酶微生物的低效性问题，从而使活性污泥法处理含油脂污水的效率得到极大提高。本方法 亦可应用于针对污水中其他难以降解的成分(如烃类、苯环类化合物等)对活性污泥中其
3他微生物进行改造。以下是实现本发明目的的技术路线1、针对含油脂污水中油脂的降解，克隆高效降解脂肪酶基因。根据已报道的解脂耶氏酵母中脂肪酶基因的序列分别设计脂肪酶基因克隆的引 物对，提取解脂耶氏酵母的基因组DNA为模板，进行PCR扩增得到脂肪酶基因片段(如图 1)。经测序分析后进行表达，得到高活性的脂肪酶。2、将高活性的脂肪酶在活性污泥中的微生物或适合在活性污泥中生长繁殖的微 生物细胞表面进行展示表达，得到全细胞酶制剂。本发明将高水解活性的脂肪酶展示表达在Yarrowia lipolytics(解脂耶氏酵 母)细胞表面得到全细胞脂肪酶制剂。具体方案如下1)参照 Flo 膜蛋白的基因编码序列(GenBank accession No. NCOOl 133)设计 Flo 基因的克隆引物Flo-F-Sfi I和Flo-R-EcoR I。以S. cerevisia(酿酒酵母)的基因组 DNA为模板PCR扩增得到分别带有Sfi I和EcoR I限制性酶切位点的Flo基因片段。2)根据脂肪酶基因LIPY7的序列设计下列引物LIPY7f_Mun I和LIPY7r_XbaI。 利用PCR扩增得到分别带有Mim I和Xba I限制性酶切位点的LIPY7基因片段。将Flo基 因片段用EcoR I消化、LIPY7基因片段用Mim I消化，得到相同粘性末端的基因片段(EcoR I与Mim I互为同尾酶)。在T4DNA连接酶的作用下，将用EcoR I消化的Flo基因片段与 用MunI消化的LIPY7基因片段连接。以Flo-F-Sfi I为正向引物、LIPY7r_Xba I为反向 引物，以连接产物为模板进行PCR扩增，得到F10-LIPY7融合基因片段，且两端分别带有Sfi I和XbaI限制性酶切位点。将此融合基因分别用Sfi I和Xba I消化，并与经Sfi I和 Xba I消化的表达载体PINA1296连接，得到脂肪酶LIPY7在解脂耶氏酵母中展示表达的载 体 pINAl296_F_LIPY7 (如图 2)。3)将重组质粒pINA1296-F-LIPY7 经Not I 线性化后，转化Yarrowia lipolytica, 经间接免疫荧光检测，证实脂肪酶LIPY7展示表达在Yarrowia lipolytica细胞表面(如 图3)，得到脂肪酶LIPY7的全细胞脂肪酶(菌)制剂，命名为YL-LIPY7。3、全细胞脂肪酶制剂在含油脂污水处理中的应用将全细胞脂肪酶制剂添加在活 性污泥中进行含油脂污水处理，分析验证其对油脂污水的处理效率。将该全细胞脂肪酶制剂直接添加在序列间歇式活性污泥法(SBR工艺)的活性污 泥中进行活性污泥微生物的同步驯化，通过活性污泥中生物相的观测，证实该全细胞脂肪 酶制剂稳定存在于活性污泥中。实验证实该全细胞脂肪酶制剂可有效提高含油脂污水处理 的效率。该全细胞脂肪酶制剂在生物膜法污水处理工艺中也证实对含油脂污水处理有效。本发明利用生物工程技术将高活性的脂肪酶展示表达在产脂肪酶的微生物细胞 表面，形成高活力全细胞脂肪酶制剂。该制剂以产脂肪酶微生物的形式直接加入活性污泥 中，进行含油脂污水的处理。这种全细胞脂肪酶制剂可以避免直接使用脂肪酶带来的酶固 定化成本和添加预处理工艺流程的问题，有效解决了单一使用脂肪酶的高成本问题和单一 使用产脂肪酶微生物的低效性问题，极大的提高产脂肪酶微生物在活性污泥法处理含油脂 污水中的效率。该全细胞脂肪酶制剂还可以应用于油脂污染土壤的生态修复。
图1为本发明PCR扩增Yarrowia Iipolytica中的脂肪酶基因图片，其中I——PCR 产物，M——DNA Marker,图2为本发明脂肪酶LIPY展示表达载体pINA1296-F-LIPY7结构示意图。图3、图4为本发明脂肪酶LIPY7(RBITC标记、红色)在Y. lipolytics细胞表面展 示表达免疫荧光检测图片
具体实施例方式下面结合具体实例对本发明作进一步阐述，但实施实例不限制本发明的保护范 围。实施例1 高水解活性脂肪酶基因的克隆解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytics)具有很好的降解油脂的能力，是应用于含 油脂废水处理的活性污泥中一种重要的微生物。根据已报道的解脂耶氏酵母中脂肪酶基因 的序列(LIP7，EMBL Accession No. Α.了549519)分别设计脂肪酶基因克隆引物LIP7f :5，-aaa￡aattccaccatcatcatcatcatatggtcagctttggagctcgaat-3'LIP7r 5' -aaaKcggccgcaggtgtgcattcggctatctgaga-3'提取保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)的解脂耶氏酵母 Yarrowialipolytica AS 2. 1216 的基因组 DNA 为模板，以 LIP7f、LIP7r 为引物对进行 PCR 扩增得到与LIP7 (IlOlbp)、大小一致的片断(如图1)。经测序分析，基因片段与LIP7序列比较有一个碱基的差异，但其编码的氨基酸序 列没有发生变化，此脂肪酶基因命名为LIPY7，其基因序列提交GenBank 解脂耶氏酵母的 脂肪酶基因 LIPY7 (GenBank accession No. DQ200799)。实施例2 高水解活性脂肪酶在解酯耶氏酵母细胞表面的展示表达参照Flo膜蛋白的基因编码序列(GenBank accession No. NCOOl 133)设计Flo基 因的克隆引物Flo-F-Sfi I :5，-ttt ggccgttctggcc acaatgcctcatcgctatatgtttttgg-3，Flo-R-EcoR I 5' -gat gaattc ggtgatttgtcctgaagatgatgatgacaaa-3‘以S. cerevisia的基因组DNA为模板PCR扩增分别带有Sfi I和EcoR I限制性 酶切位点的Flo基因片段。根据脂肪酶基因LIPY7的序列设计下列引物LIPY7f-Mun I -aaa caattR atggtcagctttggagctcgaat-3‘LIPY7r_XbaI :5，-aaa tcta^a aggtgtgcattcggctatctgaga-3，利用PCR扩增得到分别带有Mim I和XbaI限制性酶切位点的LIPY7基因片段。将 Flo基因片段用EcoR I消化、LIPY7基因片段用Mim I消化，得到相同粘性末端的基因片段 (EcoRI与Mun I互为同尾酶)。在T4 DNA连接酶的作用下，将用EcoR I消化的Flo基因 片段与用Mun I消化的LIPY7基因片段连接。以Flo-F-Sfi I为正向引物、LIPY7r-Xba I 为反向引物，连接产物为模板进行PCR扩增，得到Flo-LIPY7融合基因片段，且两端分别带 有Sfi I和XbaI限制性酶切位点。将此融合基因分别用Sfi I和Xba I消化，并与经Sfi I和Xba I消化的表达载体PINA1296连接，得到脂肪酶LIPY7在解脂耶氏酵母中进行展示 表达的载体pINA1296-F-LIPY7(如图2)。
将重组质粒pINA1296-F-LIPY7经Not I 线性化后，转化 Yarrowia Iipolyticaj^ 间接免疫荧光检测，证实脂肪酶LIPY7展示表达在Yarrowia lipolytics细胞表面(如图 3)，得到脂肪酶LIPY7的全细胞脂肪酶(菌)制剂YL-LIPY7。在相同的反应条件下测定相同生物量的冻干微生物细胞的脂肪酶活性，细胞表 面展示表达有脂肪酶LIPY7的Yarrowia Iipolytica的脂肪酶活性较野生型Yarrowia lipolytics的脂肪酶活性平均高出35%。说明全细胞脂肪酶(菌)制剂YL-LIPY7有较好 的油脂水解活性。实施实例3 全细胞脂肪酶制剂YL-LIPY7在高浓度油脂污水处理中的应用I、在常规活性污泥法处理含油脂污水中的应用将全细胞脂肪酶制剂YL-LIPY7 添加在序列间歇式活性污泥法(SBR工艺)IOOL曝气池中进行含油脂污水的处理，与对照组 相比可明显提高含油脂污水处理的效率。如下表
II、在生物膜法处理含油脂污水中的应用将全细胞脂肪酶制剂YL-LIPY7与 生物膜反应器中的微生物同步挂膜，驯化后进行含油脂污水的处理，与对照组相比可明显 提高含油脂污水处理的效率。如下表
权利要求
一种用于含油脂污水处理的全细胞脂肪酶制剂的构建方法，主要是针对含油脂污水中油脂的降解，克隆高效降解脂肪酶基因，将高水解活性的脂肪酶展示表达在解脂耶氏酵母细胞表面得到全细胞脂肪酶制剂，其特征在于具体方案如下1)、参照Flo膜蛋白的基因编码序列(GenBank accession No.NC001133)设计Flo基因的克隆引物Flo F Sfi I和Flo R EcoR I。以S.cerevisia的基因组DNA为模板PCR扩增得到分别带有Sfi I和EcoR I限制性酶切位点的Flo基因片段；2)、根据脂肪酶基因LIPY7的序列设计下列引物LIPY7f Mun I和LIPY7r XbaI。利用PCR扩增得到分别带有Mun I和Xba I限制性酶切位点的LIPY7基因片段，将Flo基因片段用EcoR I消化、LIPY7基因片段用Mun I消化，得到相同粘性末端的基因片段，其中EcoR I与Mun I互为同尾酶，在T4DNA连接酶的作用下，将用EcoR I消化的Flo基因片段与用MunI消化的LIPY7基因片段连接，以Flo F Sfi I为正向引物、LIPY7r Xba I为反向引物，以连接产物为模板进行PCR扩增，得到Flo LIPY7融合基因片段，且两端分别带有Sfi I和XbaI限制性酶切位点，将此融合基因分别用Sfi I和Xba I消化，并与经Sfi I和Xba I消化的表达载体pINA1296连接，得到脂肪酶LIPY7在解脂耶氏酵母中展示表达的载体pINA1296 F LIPY7；3)、将重组质粒pINA1296 F LIPY7经Not I线性化后，转化Yarrowia lipolytica，经间接免疫荧光检测，证实脂肪酶LIPY7展示表达在Yarrowia lipolytica细胞表面，得到脂肪酶LIPY7的全细胞脂肪酶制剂。
全文摘要
本发明提出了一种用于含油脂污水处理的全细胞脂肪酶制剂的构建方法，主要是针对含油脂污水中油脂的降解，克隆高效降解脂肪酶基因，将高水解活性的脂肪酶展示表达在解脂耶氏酵母细胞表面得到全细胞脂肪酶制剂。该制剂以产脂肪酶微生物的形式直接加入活性污泥中，进行含油脂污水的处理。这种全细胞脂肪酶制剂可以避免直接使用脂肪酶带来的酶固定化成本和添加预处理工艺流程的问题，有效解决了单一使用脂肪酶的高成本问题和单一使用产脂肪酶微生物的低效性问题，极大的提高产脂肪酶微生物在活性污泥法处理含油脂污水中的效率。该全细胞脂肪酶制剂还可以应用于油脂污染土壤的生态修复。
文档编号C12N1/19GK101942474SQ201010206368
公开日2011年1月12日 申请日期2010年6月11日 优先权日2010年6月11日
发明者宋慧婷, 江正兵 申请人:湖北大学