一种快速测定肠道或粪便中短链脂肪酸含量的方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及肠道或粪便中短链脂肪酸含量的测定。
【背景技术】
[0002] 肠道微生物菌群主要是指在人体远端肠道中丰富多样地存在同时对人体的健康 和营养起到关键作用的肠道菌群的总称。肠道微生物是人体重要的"微生物器官"，与免疫、 营养、代谢等诸多生理功能紧密相关。人体肠道为微生物提供了良好的栖息环境，在成人肠 道内，微生物数量高达10 14,接近人体体细胞数量的10倍；质量达到1. 2kg，接近人体肝脏 的质量；其包含的基因数目约是人体自身的100倍，具有人体自身不具备的代谢功能。作为 人体最庞大、最复杂的微生态系统，肠道微生物的代谢产物不仅能调节人体健康，更在膳食 和宿主之间起到了重要的桥梁作用。正如诺贝尔奖获得者JoshuaLederberg曾指出的，人 体与人体共生微生物构成了超级生物体，肠道微生物的代谢产物对人体能产生巨大作用。 近年来，相关方面的研究已经成为世界各国科学家关注的热点。
[0003] 研究发现，在大肠环境中，肠道微生物在远端肠道中定植并能分泌降解碳水化合 物等营养物质的酶。肠道菌能利用碳水化合物等多种营养物质而产生短链脂肪酸等代谢产 物，其中主要为乙酸、丙酸、丁酸和戊酸。这些短链脂肪酸的产量能降低大肠的pH，并因此抑 制一些有害病原菌的增殖、影响微生物酶活和抑制大肠癌变。以上这些都能对大肠健康产 生有益影响，并对人体生理健康发挥重要作用。同时，这些短链脂肪酸的氧化能为人体结肠 组织提供超过70%的耗氧。乙酸能被大脑、心脏和外周组织氧化利用。丙酸可以影响肝脏 和胆固醇代谢。丁酸能作为结肠上皮细胞的能量来源调节上皮细胞和免疫细胞的生长和凋 亡、抑制结肠炎和结肠癌、调节氧化应激，并能影响粘液层的组成。另外，短链脂肪酸还有维 持水电解质平衡、抗病原微生物以及调节肠道菌群平衡、改善肠道功能、调节免疫、抗炎、抗 肿瘤和调控基因表达等重要作用。近年来，研究者们正逐步意识到大肠的健康(尤其是肠道 菌及其代谢产物）与多种慢性疾病风险的降低间呈相关性。Nature、SCienCe、JExpMed、P NatlAcadSciUSA等国际一流学术期刊最新研究表明：很多慢性疾病，如肥胖，糖尿病，肠 炎等病人其肠道短链脂肪酸的含量与正常人群具有显著性差异。在人群中，测定肠道或粪 便中的短链脂肪酸含量能成为评价和帮助判断多种慢性疾病的初筛指标之一。
[0004] 因此，建立一种快速测定肠道或粪便中短链脂肪酸含量的方法对于在大量的样本 中进行慢性疾病(如肠炎等)的初筛，显得尤为重要。但到目前为止，还没有搜索到对于快速 测定肠道或粪便中短链脂肪酸含量方法的相关文献。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种简单、快速和准确的肠道或粪便中短链脂肪酸含量的 测定方法。
[0006] 本发明是通过以下技术方案实现的。
[0007] (1)将肠道内容物或粪便用蒸馏水以1: 9 ~ 1: 14进行均质稀释，混匀后，将混 合物离心15-20min(转速为6000转/min)，取0.5-1ml上清液用于测定短链脂肪酸含 量。
[0008] (2)通过Agilent6890N气相色谱和HP-INN0WAX色谱柱进行色谱分析。
[0009] 气相分析条件：FID检测器，载气为队#2的流速为19. 0ml/min，分流比为1:10。 空气的流速为300 流速为30ml/min;检测器温度为240°C，进样口温度为 240。。。
[0010] 升温程序为：l〇〇°C保持0. 5min后，按4°C/min的升温速度升温至150°C，测定时 间共13min。样品进样量为0. 2-0. 5y1，且每次每个样品均进行3次独立重复测定，通过 HPChem工作站软件（A. 09.xx，Agilent)进行数据分析。
[0011] (3)对建立的气相方法进行方法学验证。
[0012] 配制短链脂肪酸的标准溶液(混标及单标)，同时标准曲线浓度范围设定为：乙酸 2-80mmol/L;丙酸 1.5-60mmol/L;正丁酸 1-50mmol/L;异丁酸 0.1-5mmol/L;正戊酸 0. 1-5mmol/L;异戊酸0. 1-5mmol/L(每个标准分析物设定10个浓度梯度，每个浓度的标 准分析物平行测定五次)。每个分析物的最低检测限（LL0D)等于每个分析物相对于噪音信 号5倍的浓度(峰面积)，即测定5个空白中添加的某种标准分析物的浓度。
[0013] 通过测定样品的回收率确定测定方法的准确度，回收率通过下式进行计算： RR% =Cl/c2X100 其中，q是测得的浓度，c2是已知加入粪便培养物中的标准物的浓度。平行独立测定5 次。
[0014] 中间精密度，即相对标准偏差百分数（％RSD)，用于分析相同样品中的每个分析物 在不同天数的测定值。平行独立测定5次。
[0015] 图1表示的是标准溶液中短链脂肪酸的色谱分离。如图所示，HP-INN0WAX色谱柱 可以在10min内对标准短链脂肪酸进行较好分离。计算每个分析物的LL0D，并测定准确度 和精密度。如表1所示，该方法具有良好的准确度和精密度。乙酸和丙酸的LL0D均为0. 1 mmol/L，正丁酸、异丁酸、正戊酸和异戊酸的LL0D为0.05mmol/L。所有短链脂肪酸标准分 析物的RSD低于5% (表1)。通过Mandel拟合分析，不同标准物在以下浓度范围内存在良 好的线性关系：乙酸（2-80mmol/L);丙酸（1.5-60mmol/L);正丁酸（1-50mmol/L);异丁 酸（0. 1-5mmol/L);正戊酸（0. 1-5mmol/L)和异戊酸（0. 1-5mmol/L)。因此，该方法能很 好地满足快速及准确测定短链脂肪酸的需要。
[0016] 表1标准溶液中短链脂肪酸的响应时间、标准曲线、准确度和精密度
a标准偏差通过5次测定结果计算得出，RR%为回收率，RSD%为中间精密度，即相对标 准偏差百分数。
[0017] 该测定肠道或粪便中短链脂肪酸含量的方法的技术特色在于该方法只需将样本 在蒸馏水中均质、离心后，取上清液即可直接进行气相进样和分析，不需其他前处理步骤， 能显著减少测定时间。
[0018] 本发明的技术效果是：本方法的高回收率使其在分析肠道或粪便样本短链脂肪酸 含量时，能成为一种简单、快速和准确的分析方法。
【附图说明】
[0019] 图1为标准短链脂肪酸气相色谱图。色谱中的峰表示为：1为乙酸；2为丙酸；3为 正丁酸；4为异丁酸；5为正戊酸；6为异戊酸。
[0020] 图2为人体粪便短链脂肪酸气相色谱图。色谱中的峰表示为：1为乙酸；2为丙酸； 3为正丁酸；4为异丁酸；5为正戊酸；6为异戊酸。
[0021] 图3为小鼠结肠内容物短链脂肪酸色谱图。色谱中的峰表示为：1为乙酸；2为丙 酸；3为正丁酸；4为异丁酸；5为正戊酸；6为异戊酸。
【具体实施方式】
[0022] 本发明将通过以下实施例作进一步说明。
[0023] 按照上述具体操作步骤，在设定条件下测定肠道内容物或粪便中的短链脂肪酸含 量。
[0024] 实施例1。
[0025] (1)将人体粪便以1: 9进行均质稀释，混匀后，将混合物离心15min(6000貧)， 取0. 5ml上清液用于测定短链脂肪酸含量。
[0026] (2)通过Agilent6890N气相色谱和HP-INN0WAX色谱柱进行色谱分析。
[0027] 气相分析条件：FID检测器，载气为队#2的流速为19. 0ml/min，分流比为1:10。 空气的流速为300 流速为30ml/min;检测器温度为240°C，进样口温度为 240。。。
[0028] 升温程序为：100°C保持0. 5min后，按4°C/min的升温速度升温至150°C，测定时 间共13min。样品进样量为0.3yl，且每次每个样品均进行3次独立重复测定，通过HP Chem工作站软件（A. 09.xx，Agilent)进行数据分析。
[0029] 测得样品色谱图如图2所示。
[0030] 根据各短链脂肪酸标准曲线比对，测得该人体粪便样本中的各短链脂肪酸浓度： 乙酸 12. 8 ± 1. 2mmol/L;丙酸 7. 5 ± 0. 8mmol/L;正丁酸 7. 3 ± 0. 6mmol/L;异丁酸 0? 7 ± 0? 2mmol/L;正戊酸 0? 3 ± 0? 2mmol/L;异戊酸 1. 3 ± 0? 3mmol/L。
[0031] 实施例2。
[0032] (1)将小鼠结肠内容物以1: 10进行均质稀释，混匀后，将混合物离心20min(6000 取0.5ml上清液用于测定短链脂肪酸含量。
[0033] (2)通过Agilent6890N气相色谱和HP-INN0WAX色谱柱进行色谱分析。
[0034] 气相分析条件：FID检测器，载气为队#2的流速为19. 0ml/min，分流比为1:10。 空气的流速为300 流速为30ml/min;检测器温度为240°C，进样口温度为 240。。。
[0035] 升温程序为：100°C保持0. 5min后，按4°C/min的升温速度升温至150°C，测定时 间共13min。样品进样量为0.2yl，且每次每个样品均进行3次独立重复测定，通过HP Chem工作站软件（A. 09.xx，Agilent)进行数据分析。
[0036] 测得样品色谱图如图3所示。
[0037]根据各短链脂肪酸标准曲线比对，测得该小鼠结肠内容物样本中的各短链脂肪酸 浓度：乙酸 30. 5 ± 1. 8mmol/L;丙酸 10. 7 ± 0? 9mmol/L;正丁酸 6. 5 ± 0? 8mmol/L； 异丁酸 2. 8 ± 0? 6mmol/L;正戊酸 2. 4 ± 0? 6mmol/L;异戊酸 1. 6 ± 0? 7mmol/L。
【主权项】
1. 一种快速测定肠道或粪便中短链脂肪酸含量的方法，其特征是按以下步骤： (1) 将肠道内容物或粪便用蒸馏水以1: 9 ~ 1: 14进行均质稀释，混匀后，将混合物 离心15-20 min，转速为6000转/min，取0. 5-1 ml上清液用于测定短链脂肪酸含量； (2) 通过Agilent 6890 N气相色谱和HP-INNOWAX色谱柱进行色谱分析； 气相分析条件：FID检测器，载气为N2;N 2的流速为19. 0 ml/min，分流比为1:10 ;空气 的流速为300 ml/min，氏的流速为30 ml/min ;检测器温度为240°C，进样口温度为240°C ; 升温程序为：l〇〇°C保持0. 5 min后，按4°C /min的升温速度升温至150°C，测定时间 共13 min;样品进样量为0. 2-0.5 yl，且每次每个样品均进行3次独立重复测定，通过HP Chem工作站软件进行数据分析。
【专利摘要】一种快速测定肠道或粪便中短链脂肪酸含量的方法，按以下步骤：（1）将肠道内容物或粪便用蒸馏水以1:9~1:14进行均质稀释，混匀后，将混合物离心15-20min，取0.5-1ml上清液；（2）通过Agilent？6890？N气相色谱和HP-INNOWAX色谱柱进行色谱分析；气相分析条件：FID检测器，载气为N2；N2流速19.0ml/min，分流比1:10；空气流速300ml/min，H2流速30ml/min；检测器温度240℃，进样口温度240℃；升温程序：100℃保持0.5min后，按4℃/min升温速度升温至150℃，测定时间共13min；样品进样量为0.2-0.5μl，每次每样进行3次独立重复测定，HP？Chem工作站软件数据分析。本发明只需将样本在蒸馏水中均质、离心后，取上清液即可直接进行气相进样和分析，能显著减少测定时间。且具有简单、快速和准确的特点。
【IPC分类】G01N30/02
【公开号】CN105021726
【申请号】CN201510400874
【发明人】聂少平, 胡婕伦, 谢明勇
【申请人】南昌大学
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年7月10日